Microscopía fluorescente sin lentes en un chip

Summary

Un sin cristalino en el chip de plataforma microscopía de fluorescencia se ha demostrado que puede objetos de imagen fluorescente sobre un campo ultra amplio de visión de, por ejemplo,> 0,6-8 cm2 con <4μm resolución utilizando una muestra de compresión basado en el algoritmo de decodificación. Dicho pacto y amplio campo fluorescentes en el chip técnica de imagen podría ser valiosa para alto rendimiento de citometría, la investigación de células raras y el análisis de microarrays.

Abstract

En el chip de imagen sin lentes, en general, tiene como objetivo sustituir voluminosos lentes de los microscopios ópticos más simples y diseños más compactos, especialmente para aplicaciones de selección de alto rendimiento. Esta plataforma de tecnología emergente tiene el potencial de eliminar la necesidad de componentes ópticos voluminosos y / o costosa a través de la ayuda de nuevas teorías y los algoritmos de reconstrucción digitales. En el mismo sentido, aquí se demuestra una modalidad on-chip de microscopía de fluorescencia que se puede lograr, por ejemplo, <4μm resolución espacial en un campo ultra amplio de visión (FOV) de> 0,6-8 cm ² sin el uso de las lentes , mecánicos de barrido o de película delgada filtros de interferencia de base. En esta técnica, la excitación fluorescente se logra a través de una interfaz de prisma o hemisféricas de vidrio iluminado por una fuente incoherente. Después de interactuar con el volumen de todo el objeto, esta luz de excitación es rechazada por el total-interna-reflexión (TIR) ​​proceso que está ocurriendo en la parte inferior de la muestra de micro-fluídica chip. La emisión fluorescente de los objetos emocionados se recoge por un frontal de fibra óptica o una forma cónica y se entrega a un conjunto de sensores optoelectrónicos, como un charge-coupled-device (CCD). Mediante el uso de un algoritmo de compresión de muestreo basados ​​en la decodificación, el adquirido lensfree primas imágenes fluorescentes de la muestra puede ser rápidamente procesados ​​para producir, por ejemplo, <4μm resolución sobre un campo de visión de> 0,6-8 cm ^2. Por otra parte, apilados verticalmente micro-canales que están separados por ejemplo, 50-100 micras también puede ser con éxito imágenes utilizando la misma lensfree en el chip de plataforma microscopio, lo que aumenta el rendimiento general de esta modalidad. Este compacto en el chip de plataforma de imagen fluorescente, con un decodificador de la compresión rápida detrás de él, podría ser más valiosa de alto rendimiento para la citometría, la investigación de células raras y el análisis de microarrays.

Protocol

En esta sección vamos a revisar los métodos experimentales de nuestro sin cristalino en el chip de plataforma microscopía de fluorescencia ^1-4. Para demostrar las capacidades de esta técnica, vamos a mostrar los resultados en el chip de imagen para fluorescente micro-partículas y etiquetado de glóbulos blancos. Aunque no se mencionan aquí, la misma plataforma lensfree microscopía de fluorescencia también se puede utilizar para animales de la imagen modelo pequeño, como transgénicos C. elegans muestras ^3.

1. Diseño de la Plataforma de imagen sin cristalino en chip

Nuestro sin cristalino en el chip de plataforma de imagen está compuesto por varios componentes ópticos, incluyendo un conjunto de sensores digitales (por ejemplo, un chip CCD), una fuente de luz incoherente, un prisma, un filtro de absorción, una placa frontal de fibra óptica o un cono de fibra óptica. Como se muestra en la Figura 1, estos componentes son ensamblados con micro-fluídica dispositivos para conseguir imágenes fluorescentes de un volumen de muestra grande en un chip, sin el uso de las lentes, los escáneres mecánicos o de película delgada de filtros basados ​​en la interferencia.

1. Matriz de sensores digitales: La configuración de nuestra imagen sin cristalino utiliza un conjunto de sensores optoelectrónicos para registrar la emisión fluorescente de la meta de micro-objetos. En esta plataforma, para la detección de la señal de fluorescencia, los diferentes tipos de matrices de sensores se pueden utilizar, como CCD (por ejemplo, los modelos: KAF-8300, KAI-11002, KAF-39000, todos de KODAK) y complementario de óxido metálico -semiconductor de imágenes (CMOS, por ejemplo, Modelo: MT9T031C12STCD, de Micron Technologies). Parámetros clave de interés para estas redes de sensores incluyen el tamaño de píxel (por ejemplo, 5,4 m, 9 m, 6,8 my 3,2 m de KAF-8300, KAI-11002, KAF-39000 y MT9T031C12STCD, respectivamente) y el área de imagen activa ( por ejemplo, 2,4 cm ^2, 8 cm ^2, 18 cm ² y 32 mm ² para KAF-8300, KAI-11002, KAF-39000 y MT9T031C12STCD, respectivamente). Para lensfree en el chip de imágenes, sensores CCD, en general, es preferible para lograr un mayor rendimiento (mayor área activa) y una mayor sensibilidad, mientras que los sensores CMOS puede ser preferible para los diseños de peso relativamente más baratas y livianas (por ejemplo, para uso en campo).
2. Fuentes de luz: En nuestra plataforma, una fuente de luz incoherente, por ejemplo, un simple diodo emisor de luz (LED, por ejemplo, de Thorlabs, M455L2 C2 y LEDD1B), puede ser utilizado para la excitación de fluorescencia. En el montaje experimental se muestra en la figura. 1, una multi-modo de fibra óptica (Thorlabs, BFH37-1000) con un tamaño del núcleo mm está a tope junto a una fuente de LED (sin el uso de los lentes o la óptica de acoplamiento) y la luz de excitación se entrega a la volumen de la muestra a través de la abertura de salida de esta fibra. En este sistema, los niveles de potencia de excitación de fluorescencia debe ser alrededor de ~ 0.2 a 5 mW para un campo de visión de> 2.8 cm ² en la salida de la fibra de iluminación, sin embargo, los LED deberían ser capaces de salida ~ 5mW-1W niveles de potencia como el enfoque de acoplamiento a tope es mucho lo que disminuye la pérdida de energía de excitación a la salida de la fibra. Para lograr la excitación de varios tintes, LEDs de diferentes colores también pueden ser multiplexados mediante el uso de un acoplador de fibra óptica.
   Además de en el chip de imagen fluorescente, lensfree imágenes holográficas de transmisión de la misma muestra también se puede obtener con esta plataforma mediante la utilización de una fuente de iluminación vertical como se ilustra en la figura. 2. A diferencia de la fibra de excitación de fluorescencia, para la adquisición de imágenes holográficas, otro cable de fibra óptica con un tamaño de núcleo más pequeño (por ejemplo, ~ 50 a 400 micras) es extremo, junto a otra fuente de LED (Mightex, FCS-0625-000). Esta luz de la iluminación vertical, después de salir de la fibra de extremo, comienza a adquirir la coherencia espacial parcial, ya que se propaga hacia la muestra. El diámetro de esta región, espacialmente coherente es proporcional a la distancia que viaja la luz y es inversamente proporcional al tamaño de la abertura de salida de la fibra. Siempre y cuando este diámetro coherencia espacial en el plano de la muestra es mayor que el tamaño de difracción de cada muestra en el plano del sensor, la luz dispersada por cada objeto de fidelidad puede interferir con la luz de fondo, la creación de un lensfree en línea holograma de la muestra. Estos hologramas adquiridos lensfree puede ser rápidamente procesadas usando iterativos fase de recuperación para reconstruir una transmisión de campo brillante imagen del volumen de la muestra ^7.5. Para este fin la iluminación holográfica, una mayor longitud de onda LED (es decir, ~ 625-700 nm) es seleccionada, ya que los filtros de absorción que se utilizan para bloquear la luz de excitación son filtros de paso alto con el típico corte de longitudes de onda, por ejemplo, 500-600nm , que permite la adquisición de la transmisión en línea de los hologramas de las muestras sin un problema.
3. Otros componentes ópticos: En esta plataforma on-chip microscopía fluorescente, dos métodos diferentes de excitación de filtrado se utilizan en paralelo para crear el necesario campo oscuro de fondo, como se muestra en la figura 2. En primer lugar, un prisma de vidrio (por ejemplo, EdmundÓptica, romboidal o prismas de la paloma) o una copa hemisferio se utiliza para crear totales-reflexión interna (por la luz de excitación) en la superficie inferior de la micro-chip de fluidos que alberga las muestras de interés. En paralelo a esto, un filtro de absorción de bajo costo (por ejemplo, de Roscolux) se utiliza quitar la luz de excitación débil dispersa que no obedece al proceso de TIR. Tras el rechazo exitoso de la excitación con estos dos mecanismos, sólo la emisión de fluorescencia de las muestras se adquiere en el plano del detector. Nótese aquí que una cierta fracción de la señal fluorescente emitida también experiencias TIR, en la misma interfaz. Sin embargo, este límite sólo la apertura numérica de la detección de este lensfree en el chip de imagen para enfoque de ~ 1.0, de tal manera que sólo los rayos oblicuos sobre una apertura numérica de detección de alta permanecen atrapados en el micro-chip, mientras que el resto de los rayos fluorescentes todavía puede azotó el área activa del sensor-matriz que se muestra por sus píxeles.
   A pesar de una apertura numérica de detección de grandes, las manchas de crudo en el sensor fluorescente de matriz de llegar a ser bastante amplia (por ejemplo, ~ 150-200 micras), ya que las emisiones fluorescentes no es direccional, por lo que rápidamente se aleja. Para diseñar y controlar mejor la distribución espacial de la difusión de la señal fluorescente en nuestra plataforma sin lentes, se utilizó un componente óptico plano, es decir, un frontal de fibra óptica (por ejemplo, Edmund Optics, NT55-142), que se coloca entre el objeto y el aviones de sensor. Una placa frontal de fibra óptica se compone de una matriz 2D de cables de fibra óptica que llevan la información intensidad óptica de un lado del dispositivo a otro. Su función principal en nuestra lensfree en el chip de microscopía puesta en marcha es para acoplar los modos de espacio libre de la emisión fluorescente del volumen de la muestra en la guía ondas ópticas que viajan sin la difusión espacial dentro de cada fibra, que en parte puede reducir el punto de fluorescentes lensfree -extendió la función (PSF) entre el objeto y los planos del detector. Esto aumenta aún más nuestra relación señal-ruido (SNR), así como la resolución espacial que se puede lograr utilizando nuestra plataforma sin lentes.
   Como alternativa a una placa frontal regular, también podemos utilizar en nuestra plataforma de imágenes en un chip "cónico" de fibra óptica frontal que tiene una densidad significativamente mayor de cables de fibra óptica en su faceta superior en comparación con la de abajo. Dicha placa frontal afilado no sólo nos ayudan a lograr una mejor PSF, pero también puede presentar aumento en nuestra plataforma (por ejemplo,> 2-3x) que además nos ayuda a mejorar nuestra resolución sin lentes hasta por ejemplo, <4 micras. También debemos señalar que el campo de visión de un diseño cónico se reduzca al menos en la plaza del factor de aumento introducido en comparación con un sistema de imagen basado en la placa frontal regulares, que pueden constituir una reducción de, por ejemplo, de ~ 8 cm ² FOV inicialmente (CCD: KAI-11002) hasta <2 cm ^2, con la puesta a punto.
   Por último, también debe tener en cuenta que el uso de una placa frontal de fibra óptica o un cono de distorsiona los hologramas lensfree de la muestra a causa de diversos modos ópticos de la matriz de fibra óptica ^3. Mientras que estos patrones distorsionados lensfree en la matriz de detectores puede ser útil para ciertas aplicaciones de la citometría de relación, para la reconstrucción de imágenes holográficas de transmisión, la matriz de fibra óptica (por ejemplo, la placa frontal o el cono), debe ser retirado de la asamblea en el chip a costa de la resolución espacial redujo ligeramente en el modo ³ fluorescentes.
4. Micro-fluídica Chips: Los chips de micro-fluidos que se utilizan en nuestra plataforma se fabrican utilizando PDMS (polidimetilsiloxano) las paredes se colocan en portaobjetos de cristal creando los canales de micro-que son necesarios para el chip de imagen. Para la fabricación de estos canales de micro-fluídica buscamos la siguiente receta:
   1. PDMS A y B elastómeros se mezclan uniformemente y se agita con una relación de volumen de 1:10.
   2. Una vez que esta solución heterogénea se vierte en una placa de Petri, que se cura a 65 ° C durante 2 horas.
   3. Usando una cuchilla X-acto, el tamaño y forma de la pared de micro-canales fluidos se extrae de la placa de Petri.
   4. La unión dispositivo se logra mediante el uso de una alta frecuencia-generador de plasma (Electro-Technic Products Inc., BD-10AS), que debe exponer tanto las diapositivas de cristal de la cubierta y la zona de unión PDMS.
   5. Después de este tratamiento de plasma, el dispositivo se coloca dentro de un horno de ~ 40-50 minutos a 70 ° C para fortalecer la unión.
5. Montaje y alineación de la plataforma de microscopia sin cristalino en el chip:
   Los procedimientos de montaje para nuestra plataforma de lensfree imagen en el chip se pueden detallar como:
   1. Cubierta de cristal de la opto-electrónica del sensor de matriz se retira.
   2. El uso del lápiz de vacío (Edmund Optics, NT57-636), un filtro de absorción delgada se coloca suavemente sobre la parte superior del área del detector activo.
   3. Una placa frontal de fibra óptica o una forma cónica se coloca en la parte superior de esta f absorciónILTER.
   4. La fabrica micro-chip es fluido y luego directamente colocados en la parte superior de la matriz de fibra óptica.
   5. Un prisma de vidrio o una esfera hemi-se monta sobre el micro-chip de fluidos usando un aceite índice de coincidencia (Cargille, aceite de inmersión de la serie 300) de tal manera que el índice de refracción de la interfaz se corresponde con el índice de refracción de vidrio.
   6. Fibra de lado la iluminación se mueve más cerca del prisma (o el hemisferio) y su ángulo se ajusta para asegurar que la reflexión total interna, se produce en la interfase vidrio-aire correspondiente al substrato del fondo del micro-chip de fluidos. La iluminación vertical (para la transmisión de imágenes lensfree) está alineado a ser perpendicular al detector de arreglo de discos y se centra en un campo deseado de vista.
   7. Laterales y verticales de fuentes de luz de forma secuencial encendido / apagado para conseguir ambas imágenes fluorescentes y brillantes imágenes de campo usando la transmisión misma plataforma on-chip.
   8. Imágenes Lensfree primas sean adquiridas mediante una interfaz desarrollada a medida LabVIEW a través de un PC (por ejemplo, 3,2 GHz, Intel Core).

2. Preparación de la muestra

Hemos utilizado microesferas fluorescentes (por ejemplo, Invitrogen, Fluospheres) para calibrar nuestra plataforma de imagen, mediante la medición de su sistema de lensfree punto propagación de función (PSF). Después de esta primera medición se realiza PSF, varias células o pequeños animales modelo (por ejemplo, transgénicos C. elegans muestras) se pueden visualizar utilizando la misma plataforma on-chip.

A partir de la siguiente sub-sección, vamos a dar más detalles de nuestros pasos de preparación de muestras.

1. Microesferas fluorescentes-:
   1. Primas soluciones bolas fluorescentes se combinan con agua destilada para optimizar la concentración de las muestras.
   2. ~ 10 L de solución de bolas fluorescentes se mezcla con 40 ml, 5 ml y 20 ml de agua DI por 10 m, 4 m y 2 m de diámetro cuentas, respectivamente. Soluciones heterogéneas de varias cuentas (por ejemplo, no fluorescentes y fluorescentes) se preparan según sea necesario mediante la mezcla de diferentes soluciones de cuentas entre sí.
   3. La solución final de la muestra se inyecta en el micro-chip de fluidos de las paredes laterales PDMS con una aguja de la jeringa aguda (Fisher Scientific, BD Agujas PrecisionGlide, 14-826 Series)
2. Blancas de la sangre de etiquetado de la célula:
   1. Un volumen de aproximadamente 100 l de sangre entera se mezcla con ~ 1 ml de buffer de lisis de glóbulos rojos (eBioscience).
   2. Después de la incubación de ~ 3 min, la solución de lisis de sangre se centrifuga y la capa de sedimento se resuspende en aproximadamente 200 l de PBS (tampón fosfato salino).
   3. Para etiquetar el ácido nucleico de las células con colorantes de fluorescencia, 5 L de 1 mM SYTO 16 se añade a la resuspensión de 200 l, después de lo cual la muestra se incuba durante ~ 30 minutos en oscuridad a temperatura ambiente.
   4. Centrifugación de la segunda se aplica a esta muestra la etiqueta, donde se retira el sobrenadante para disminuir el ruido de fondo debido a la emisión de fluorescencia de los tintes no consolidados.
   5. Glóbulos blancos pellet capa se vuelve a suspender en PBS, que luego puede ser transferido a un micro-chip de fluidos para lensfree en el chip de imagen fluorescente (véase, por ejemplo, la Figura 7).

3. El procesamiento digital de las imágenes adquiridas fluorescentes sin lentes

En esta plataforma de imágenes sin lentes, dos diferentes algoritmos se utilizan para aumentar en forma digital la resolución del sistema, es decir, la deconvolución Lucy-Richardson y el muestreo basado en la compresión de decodificación. A través del uso de estos métodos de procesamiento digital, que cuantifica la mejora de la resolución que se puede lograr con cada enfoque por resolver apretadas bolas pares (ver fig. 5-6). El reconstruido imágenes fluorescentes lensfree puede ser pseudocolored (si lo desea) para resaltar el color natural de los objetos de la micro, lo que sin duda requiere un conocimiento previo de la longitud de onda de la señal fluorescente, a menos que un color (por ejemplo, un RGB: rojo, verde y azul CCD / CMOS) sensor chip se utiliza. Para estos métodos de procesamiento digital, desarrollada a medida se utilizan los algoritmos que sólo requieren una CPU (por ejemplo, un procesador de 3,2 GHz, Intel Core). Potencialmente, la próxima generación de unidades de procesamiento gráfico (GPU) también podrían ser utilizados para un procesamiento más rápido. Además de imágenes, si es necesario, los objetos fluorescentes también pueden ser decodificados automáticamente se cuenta con una interfaz desarrollada a medida (ver fig. 8) para las aplicaciones de la citometría en el chip.

1. La medición del sistema de punto-Spread Function (PSF):
   Antes de cualquier procesamiento digital para la resolución de la mejora (como deconvolución o la compresión de decodificación), la incoherencia de punto extendido función del sistema en un chip debe ser estimado, el cual se puede lograr un promedio de varios patrones de medida lensfree fluorescentes creados por pequeñas y aisladas fluorescentes cuentas ubicadas a cierta altura del sensor del chip. Estosindividuales de los patrones de fluorescencia se alinea entonces con respecto a su centro de coordenadas masa a un promedio de ^1,2 después de la adecuada normalización de la intensidad. Este patrón de un promedio de lensfree puede ser luego utilizado como fluorescentes punto difusión de nuestra función en el chip del microscopio.
2. Lucy-Richardson deconvolución ^1: Para mejorar digitalmente la resolución espacial de nuestra plataforma, nos alimentamos de la prima de imagen adquiridos fluorescentes y la función de medida incoherente punto de margen en un ^8.10 algoritmo acelerado Lucy-Richardson. Aplicando el teorema de Bayes, el algoritmo de Lucy-Richardson utiliza la medida de punto extendido función para refinar iterativamente la estimación de máxima verosimilitud de la distribución de fuentes de fluorescencia en el plano del objeto ^8,9. El proceso de iteración se termina normalmente después de unos cuantos cientos de ciclos antes de la aparición de la amplificación de ruido para asegurar un mínimo error cuadrado entre las proyectadas y la medida patrones fluorescentes lensfree. La convergencia de este algoritmo de deconvolución se aceleró también por un método de extrapolación vectores para acortar el tiempo de cálculo ^10. Para dar una idea: este algoritmo proporciona una resolución espacial efectiva de ~ 20 m (con un chip CCD / CMOS con un tamaño de píxel de, por ejemplo, ~ 9μm) y puede deconvoluir un campo de visión de ~ 8 cm ² dentro de unas pocas decenas de minutos en un PC que ejecuta Matlab ^1. Tenga en cuenta que el tiempo mismo cálculo se reduce a tan sólo unos segundos para, por ejemplo, ~ 1 mm ² FOV que es comparable con el campo de visión de una lente objetivo de 10X típico.
3. A la compresión de muestreo / sensor basado en escasa decodificación de la señal ^2: mejora además la resolución (hasta <4 m) ⁴ se puede lograr mediante el uso de la compresión de detección / de muestreo basado en algoritmos de decodificación ^11,12. Muestreo de compresión / de detección proporciona un marco teórico que ha surgido recientemente ^13-15 que tiene como objetivo recuperar una señal de escasa a partir de muestras mucho menos de lo que se requiere de acuerdo con el teorema de muestreo. Aunque, en general, la recuperación de la señal por debajo de las mediciones de la muestra es un problema mal planteado, para una clase específica de las funciones (es decir, para las funciones parciales), el teorema de muestreo bien conocida y su base de representación ha sido recientemente demostrado ser muy ineficiente en términos el número de mediciones que se requieren, es decir, la señal de escasa misma puede, en general, únicamente se recuperó a partir de muestras muy pocos en comparación con la clásica teoría del muestreo.
   Sin lentes imágenes fluorescentes registrado por nuestro microscopio en un chip por sí satisfacer una necesidad importante de la compresión Decodificación: Para las aplicaciones que son de interés para este trabajo, como de campo amplio citometría fluorescente, el análisis de células raras y de alto rendimiento de imagen de microarrays, objetos fluorescentes de interés puede ser considerada ya escasa. Por lo tanto, en nuestro microscopio de fluorescencia sin lentes, la decodificación de la distribución y la fuerza relativa de los emisores fluorescentes situados en el plano del objeto puede ser modelado como un l a gran escala _{de 1} regularizada problema de mínimos cuadrados que se pueden resolver utilizando, por ejemplo, un interior- método de punto ^2,12. Este problema de optimización puede ser expresada matemáticamente como:
   
   en | | u | | = _k (Σ _i ⁿ | u _i | ^{k) (1 / k)} y | | u | | _∞ = max _i | u _i |. Por lo tanto, minimizar el l _1-2-l regularizado norma de la diferencia entre el grabado / medida (y) y el estimado (Ax) lensfree imágenes, donde x y A representan la distribución de código fuente para ser decodificados y la matriz de medición formado con el PSF experimental del sistema, respectivamente. También utilizamos una función de restricción obligando a la distribución de código fuente en el plano del objeto a ser negativo. Este proceso iterativo de compresión de decodificación termina cuando el valor de la función de costes llega a un valor de tolerancia predeterminada. Parámetros de regularización (β) y la tolerancia son las funciones generales de la escasez de objetos y el nivel de medición de ruido, y se han optimizado en nuestro sistema para ~ ~ βmax/10 y 0,01, respectivamente.
   Con base en el esquema anterior se indica numérico, compresión de decodificación de imágenes raw fluorescentes mejora en gran medida la capacidad de nuestra plataforma para resolver los objetos dispersos y presenta una velocidad de procesamiento comparable a Lucy-Richardson deconvolución ^2. Además de las imágenes de una sola capa, los objetos fluorescentes situados a diferentes profundidades, también puede ser decodificado y separados unos de otros al mismo tiempo mediante la ejecución del mismo algoritmo utilizando todos los PSF correspondientes a diferentes capas de profundidad ^2.
4. Pseudocoloring: Aunque no es una limitación fundamental, la presentan en el chip de plataforma de imagen se emplea a obreros monocromo opto-electrónicos en símatrices nsor que, en general, ofrecer una mejor relación señal-ruido para obtener imágenes de muestra biológica. Por lo tanto, las imágenes fluorescentes primas se adquieren en escala de grises de formato, que no contiene la información de color real de las muestras. Esto podría mitigarse mediante el uso de color CCD / CMOS fichas en nuestra estructura de imagen lensfree de tal manera que tres canales de color (rojo, verde y azul) se adquieren en cada medición fluorescente lensfree. Por otro lado, si las características del medio de contraste de etiquetado de emisión ya se conocen, el formato RAW en escala de grises las imágenes fluorescentes de un sensor monocromo-chip y sus versiones decodificados / deconvoled también puede ser artificialmente convertidos a imágenes en color utilizando un algoritmo implementado en pseudocoloring por ejemplo, MATLAB. Para ello, las imágenes obtenidas en escala de grises se puede ampliar en tres dimensiones los datos de cubos, donde puede ser de cualquier color de interés sintetizada mediante el uso de factores de ponderación adecuada en cada canal de seudo el cubo de datos. Como resultado de este proceso, las imágenes monocromas lensfree fluorescente se puede convertir (si se desea) a las imágenes de varios canales que ofrecen información conocida color de un objeto dado fluorescentes.
5. El recuento automatizado de células fluorescentes: Para las aplicaciones de la citometría, también hemos desarrollado una interfaz de usuario de diseño personalizado (ver Fig. 8.) Que puede contar automáticamente los objetos fluorescentes / células sobre la base de sus imágenes lensfree adquirido con nuestra plataforma de microscopía en el chip. Con este trabajo, inicialmente un umbral suave se aplica a las imágenes en bruto lensfree a reducir posibles ubicaciones de los objetos fluorescentes. A continuación, una serie de funciones (especialmente regionprops) se utilizan para medir las propiedades de la imagen de cada sub-región de interés, tales como la posición, área, la forma y la intensidad. El uso de estos datos de objetos, objetos binarios se clasifican en subgrupos, tales como las células, los píxeles muertos, así como el polvo o la fluorescencia de fondo automático. Una vez que el resultado final de la función regionprops se filtra para mostrar sólo las células de interés, la longitud de la matriz de la estructura resultante se puede utilizar para obtener el recuento de células en el campo de visión completa de nuestra lensfree en el chip de imágenes.

4. Los resultados representativos:

Una visión general de nuestro set-up se muestra en la Figura 1, con varios componentes ópticos que se utilizan en el montaje. Las principales características de nuestra plataforma de microscopía en el chip se explican en la Figura 2, incluyendo la excitación fluorescente y la detección, la reflexión total interna, así como la iluminación parcialmente coherente para la transmisión de imágenes holográficas en la misma plataforma. Sin lentes fluorescentes en el chip resultados de las imágenes de una mezcla heterogénea que contiene diversos micro-partículas (4 micras y 10 micras verde verde / rojo) se muestran en las figuras 3-4. Comparativa de Lucy-Richardson deconvolución y la compresión de muestreo / decodificación de detección basados ​​en se presenta en la Figura 5 para mejorar digitalmente la resolución de las materias primas imágenes fluorescentes sin lentes. A la compresión de decodificación activada la resolución espacial (<4 m) se cuantifica en la Figura 6. Sin cristalino en el chip de la etiqueta fluorescente microscopía glóbulos blancos se ilustra en la Figura 7, que también ofrece imágenes de comparación tomada con un microscopio fluorescente convencional. Finalmente, nuestra interfaz automatizada fluorescente contar objeto se muestra en la Figura 8.

Información general sobre la figura 1. Sin lentes de nuestra imagen en el chip set-up se muestra con varios componentes ópticos que se utilizan en el montaje.

Figura 2. El esquema de la plataforma on-chip de imagen lensfree fluorescentes se muestra (imagen izquierda). Excitación de fluorescencia se logra a través de la faceta lateral de un prisma romboidal con una fuente incoherente. El montaje experimental de nuestra plataforma on-chip de imagen fluorescente también se muestra (imagen derecha). Muestra de sangre entera dentro de un chip de microfluidos (dimensiones: 2,5 x 3,5 x 0,3 cm) estaba emocionado a través de la interfaz de prisma, donde se utilizó aceite de índice coincidente para montar el chip y el prisma. Tras el rechazo de la luz de excitación por la TIR y el filtro de color, sólo la emisión fluorescente de las células sanguíneas marcado fue registrado por nuestro chip sensor CCD (KODAK 11002) más de un campo de visión de ~ 2,5 x 3,5 cm.

Figura 3. Campo amplio sin lentes fluorescentes en el chip de imagen de una mezcla que contiene 4 micras y 10 micras partículas fluorescentes de color verde se ilustra. Para fines de comparación, 10 veces más imágenes objetivo de microscopio también se proporcionan, que concuerdan con nuestras imágenes fluorescentes sin lentes.

Figura 4.

Figura 5. Comparación de rendimiento de la Lucy-Richardson (LR) deconvolución y el muestreo de compresión (CS) basada en algoritmos de decodificación se proporciona, para obtener imágenes de los diversos 10 micras de cuentas pares. La fila superior muestra las imágenes sin lentes fluorescentes primas. Las imágenes de la inserción en la fila superior muestra las comparaciones microscópicas de las mismas partículas que se adquieren con un lente objetivo de 10X. La fila del medio demuestra nuestra compresión resultados de decodificación, mientras que la fila inferior muestra los resultados de deconvolución Lucy-Richardson. d, d _CS, y _LR d se refieren a la distancia de centro a centro en imágenes de microscopio, CS decodifica las imágenes sin lentes, y LR deconvolved imágenes sin lentes, respectivamente.

Figura 6. Procesamiento digital de imágenes en bruto sin lentes fluorescentes se ilustra. Un algoritmo de muestreo basado en la compresión se utiliza para lograr <4 m de resolución espacial mediante la resolución de apretadas 2 pares m de diámetro de cuentas. Los recuadros muestran también 40X comparaciones objetivo de microscopio, que concuerdan muy bien con las imágenes fluorescentes decodificado. Aquí d se refiere a las distancias de centro a centro en imágenes de microscopio, mientras que d _CS se refiere a las distancias de centro a centro en el CS decodificado imágenes fluorescentes sin lentes.

Figura 7. Imágenes sin lentes de fluorescencia (SYTO 16) etiquetados células blancas de la sangre se ilustra. La prima imágenes lensfree son rápidamente decodificados usando un decodificador CS base, lo que concuerda muy bien con una imagen de microscopio convencional de la misma muestra que se adquiere con una lente objetivo de 10X.

Figura 8. Un diseño personalizado de interfaz automatizada fluorescente recuento de objetos (en MATLAB) se ilustra.

Discussion

Hemos demostrado una plataforma on-chip microscopía de fluorescencia que se puede lograr, por ejemplo, <4μm resolución espacial sobre, por ejemplo,> 0.6-8 cm ² campo de visión sin el uso de las lentes, mecánico de exploración o de película delgada de la interferencia de filtros. En esta técnica, con el uso de una placa frontal de fibra óptica o una forma cónica, la emisión fluorescente de los objetos que se recoge con un 2D-serie de cables de fibra óptica antes de ser entregado a un sensor opto-electrónico-array como un CCD / chip CMOS. Estas imágenes adquiridas lensfree luego se procesa con rapidez para producir <resolución 4μm más> 0.6-8 cm ² campo de visión con una muestra de compresión / de detección basado en el algoritmo de decodificación. Una plataforma de imágenes fluorescentes compactas y amplio campo podría ser muy útil para alto rendimiento de citometría, la investigación de células raras, así como para el análisis de microarrays.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Charge-coupled device(CCD)	KODAK	KAF-8300
Charge-coupled device(CCD)	KODAK	KAF-11002
Charge-coupled device(CCD)	KODAK	KAF-39000
Complementary Metal-Oxide-Semiconductor (CMOS)	Micron	MT9T031C12STCD
High power LED light source	Thorlabs Inc.	M455L2-C2
High power LED driver	Thorlabs Inc.	LEDD1B
Fiber coupled LED light source	Mightex	FCS-0625-000
Vacuum Pen	Edmund Scientific	NT57-636
2, 4, 10 μm Fluospheres	Invitrogen	F-8826, F-8859, F-8836
RBS lysis buffer 1X	eBioscience	00-4333
SYTO 16 labeling reagent	Invitrogen	S7578
Fiber-optic faceplate	Edmund Scientific	NT55-142
Fiber-optic taper	Edmund Scientific	NT55-134
Prisms	Edmund Scientific	NT47-626, NT45-403
Filters	Edmund Scientific	NT39-417
PDMS Elastomers	Dow Corning	Slygard 184