Lensless Fluorescerande Mikroskopi on a Chip

Summary

En lensless på-chip fluorescerande mikroskopi plattform är visat att kan bilden fluorescerande föremål över ett extremt brett fält-of-view av t ex,> 0,6-8 cm2 med <4μm upplösning med en tryckkraft provtagning baserad avkodning algoritm. En sådan kompakt och brett fält fluorescerande on-chip avbildning modalitet kan vara värdefull för hög genomströmning Cytometry, sällsynta cell forskning och microarray-analys.

Abstract

On-chip lensless bildbehandling i allmänhet syftar till att ersätta skrymmande lins-baserade optiska mikroskop med enklare och mer kompakt design, särskilt för high-throughput screening program. Denna framväxande teknologiplattform har potential att eliminera behovet av skrymmande och / eller kostsamma optiska komponenter genom hjälp av nya teorier och digitala algoritmer återuppbyggnad. I samma anda, här visar vi en on-chip fluorescerande mikroskopi tillvägagångssätt som kan uppnå exempelvis <4μm rumslig upplösning över ett extremt brett fält-of-view (FOV) på> 0,6-8 cm ² utan användning av alla linser , mekanisk-scanning eller tunn-film baserad filter störningar. Med den här tekniken är fluorescerande magnetisering uppnås genom ett prisma eller halvsfärisk glas gränssnittet upplyst av en osammanhängande källa. Efter att interagera med hela objektet volym är detta excitation ljus förkastades av total-intern reflektion (TIR) ​​process som sker i botten av provet mikro-fluidic chip. Den fluorescerande utsläpp från glada objekten samlas sedan upp av en fiberoptisk frontpanelen eller en kona och levereras till en optoelektroniska sensorer såsom en charge-coupled-enhet (CCD). Genom att använda en tryckspänning provtagning baserad avkodning algoritm kan det förvärvade lensfree råa fluorescerande bilder av provet snabbt bearbetas för att ge t.ex. <4μm upplösning över en FOV på> 0,6-8 cm ^2. Dessutom vertikalt staplade mikro-kanaler som är åtskilda av t.ex. kan 50-100 ìm också framgångsrikt avbildas med samma lensfree on-chip mikroskopi plattformen, vilket ytterligare ökar den totala genomströmningen av denna stödform. Denna kompakta on-chip fluorescerande imaging-plattform, med ett snabbt tryck-dekoder bakom det, skulle vara ganska värdefull för hög genomströmning Cytometry, sällsynta cell forskning och microarray-analys.

Protocol

I detta avsnitt kommer vi att granska de experimentella metoder för vår lensless on-chip fluorescerande mikroskopi plattform ^1-4. För att visa möjligheterna med denna teknik kommer vi att visa on-chip-imaging resultat för lysrör mikropartiklar och märkt vita blodkroppar. Även om det inte diskuteras här, kan samma lensfree fluorescerande mikroskopi plattformen också användas för att bilden liten modell djur såsom transgena C. elegans prov ^3.

1. Design av lensless On-Chip Imaging Plattform

Vår lensless på-chip bildbehandling plattform består av flera optiska komponenter inklusive en digital sensor array (t.ex. en CCD-chip), en osammanhängande belysning källa, ett prisma, en absorption filter, ett fiberoptiskt frontpanelen eller en fiberoptisk kona. Som visas i figur 1, är dessa komponenter monteras med mikro-fluidic enheter för att uppnå fluorescerande avbildning av en stor provvolym på ett chip, utan användning av alla linser, mekaniska skannrar eller tunnfilms-baserade störningar filter.

1. Digital Sensor Array: Vår lensless imaging konfiguration använder en optoelektronisk sensorer för att spela in fluorescerande utsläpp från målet mikro-objekt. I denna plattform för detektion av fluorescens signalen, kan olika typer av sensor-arrayer användas, såsom CCD: er (t ex modeller: KAF-8300, Kai-11.002, KAF-39 tusen, alla från KODAK) och kompletterande metall-oxid -halvledare kameror (CMOS, exempelvis, Modell: MT9T031C12STCD, från Micron Technologies). Viktiga parametrar av intresse för dessa sensor-arrayer inkluderar pixel storlek (t.ex. 5,4 ìm, 9 ìm, 6,8 ìm och 3,2 ìm för KAF-8300, Kai-11.002, KAF-39 tusen och MT9T031C12STCD, respektive) och den aktiva imaging-området ( t.ex. 2,4 cm ^2, 8 cm ^2, 18 cm ² och 32 mm ² för KAF-8300, Kai-11.002, KAF-39 tusen och MT9T031C12STCD respektive). För lensfree on-chip bildbehandling kan CCD-sensorer i allmänhet att föredra för att uppnå högre genomströmning (bredare aktivt område) och bättre känslighet, medan CMOS-sensorer kan vara att föredra för relativt sett billigare och lättare vikt konstruktioner (t.ex. för användning i fält).
2. Ljuskällor: I vår plattform, en osammanhängande ljuskälla, t.ex. en enkel lysdiod (LED, t.ex. från Thorlabs, M455L2-C2 och LEDD1B), kan användas för fluorescens excitation. I den experimentella uppsättning som visas i figur. 1, är en multi-mode fiberoptisk kabel (Thorlabs, BFH37-1000) med 1 mm kärna storlek butt-kopplad till en LED-källa (utan användning av alla linser eller koppling optik) och excitation ljus levereras sedan till provvolymen genom utgången öppning av denna fiber. I detta system bör den nödvändiga effekten av fluorescens excitation vara runt ~ 0,2-5 mW för en FOV på> 2-8 cm ² vid utgången av den belysning fibrer, bör dock lysdioder kunna mata ~ 5mW-1W effektnivåer som butt-koppling tillvägagångssätt är betydligt förstörande vilket minskar excitation effekt vid utgången av fibern. För att uppnå excitation av olika färgämnen, kan annan färg lysdioder också multiplexade med hjälp av en fiberoptisk koppling.
   Förutom on-chip fluorescerande Imaging kan lensfree holografiska överföring bilder av samma prov också fås med denna plattform genom att använda en vertikal belysning källa som visas på bild. 2. Till skillnad från fluorescens excitation fibrer, för holografisk bild förvärv, är en annan fiberoptisk kabel med en mindre kärna storlek (t.ex. ~ 50-400 mikrometer) rumpa kopplad till en annan LED-källa (Mightex, FCS-0625 till 000). Denna vertikala belysning ljus, efter spännande fiber slut, börjar att förvärva delar av rumsliga sammanhang som propagerar mot provet. Diametern på den här rummet sammanhållen region är proportionell mot avståndet som ljuset färdas och är omvänt proportionell mot utgången maskstorlek av fibern. Så länge denna rumsliga sammanhang diameter på provet planet är större än diffraktion storleken på varje prov vid sensorn planet, kan det spridda ljuset från varje objekt störa troget med bakgrunden ljus och skapar en lensfree in-line hologram av provet. Dessa förvärvade lensfree hologram kan sedan snabbt bearbetas med iterativ metoder fas återhämtning att rekonstruera en överföring ljus-field bild av provet volym ^5-7. För detta holografiska belysning slut en längre våglängd LED (dvs ~ 625-700 nm) är vald eftersom absorptionen filter som används för att blockera excitation ljus är högpassfilter med typiska cut-off våglängder av t ex 500-600Nm , tillstånd som förvärvet av överföring i online-hologram av prover utan en fråga.
3. Andra optiska komponenter: I denna on-chip fluorescerande mikroskopi plattform, finns två olika excitation filtrering metoder som används parallellt för att skapa den nödvändiga mörka fält bakgrund som visas i Fig. 2. Först ett glas prisma (t.ex. EdmundOptik, romboid eller prismor duva) eller ett glas halvklotet används för att skapa total-intern reflektion (för excitation ljus) i botten ytan av mikro-fluidic chip som är värd för prover av intresse. Parallellt med detta, är ett billigt absorption filter (t.ex. från Roscolux) som används avlägsna svagt spridda excitation ljus som inte lyder TIR-processen. Efter ett framgångsrikt avvisande av excitation med hjälp av dessa två mekanismer är det bara fluorescerande utsläpp av proverna förvärvades i detektorn planet. Notera här att en viss andel av den emitterade fluorescerande signal också erfarenheter TIR på samma gränssnitt. Men detta endast begränsar upptäckt numerisk apertur på detta lensfree på chips avbildningsteknik till ~ 1,0, så att bara de sneda strålar över en sådan stor upptäckt numerisk bländare stanna kvar inom mikro-chip medan resten av det fluorescerande strålar kan fortfarande slog den aktiva delen av sensorn-array som ska provtas av dess pixlar.
   Trots att en så stor upptäckt numerisk bländare, den råa fluorescerande fläckar på sensorn-array blivit ganska bred (t.ex. ~ 150-200 mikrometer) sedan fluorescerande utsläpp inte är riktad och därför snabbt avviker. Att ingenjör och bättre kontroll den rumsliga spridningen av denna fluorescerande signal i våra lensless plattform utnyttjas vi en plan optisk komponent, dvs ett fiberoptiskt frontpanelen (t.ex. Edmund Optics, NT55-142), som placeras mellan objektet och sensor plan. Ett fiberoptiskt fronten består av en 2D-array av fiberoptiska kablar som bär optisk intensitet information från ena sidan av enheten till den andra. Dess huvudsakliga funktion i vår lensfree on-chip mikroskopi set-up är att koppla den fria utrymmet steg av fluorescerande utsläpp från provvolymen i guidade optiska vågor reser utan rumsliga spridning inom varje fiber, vilket delvis kan begränsa lensfree fluorescerande punkt spridda funktion (PSF) mellan objektet och planen detektorn. Detta ökar vår signal-brus-förhållande (SNR) samt den rumsliga upplösningen som kan uppnås med hjälp av vår lensless plattform.
   Som ett alternativ till en vanlig frontpanelen, kan vi använda även i vår on-chip-imaging-plattformen en "konisk" fiberoptiska fronten, som har en betydligt större täthet av fiberoptiska kablar på sin topp aspekt jämfört med de nedersta. En sådan avsmalnande framsidan inte bara hjälpa oss att uppnå en bättre PSF, men också kan införa förstoring i vår plattform (t.ex.> 2-3X), vilket ytterligare hjälper oss att förbättra våra lensless upplösning ner till t.ex. <4 ìm. Vi bör också notera att fält-of-view av en sådan avsmalnande design är nedsatt med minst kvadraten på introducerade förstoringsfaktorn jämfört med en vanlig frontpanelen baserat Imaging System, som kan utgöra en minskning av t ex från ~ 8 cm ² FOV initialt (CCD: Kai-11.002) ner till <2 cm ² med kona.
   Slutligen bör vi också notera att användning av en fiberoptisk frontpanelen eller en kona snedvrider lensfree hologram av provet på grund av olika optiska steg av fiberoptiska array ^3. Även om sådana förvrängda lensfree mönster på detektorn array kan ändå vara användbart för vissa applikationer Cytometry relation, för holografisk rekonstruktion av överföring bilder, fiberoptiska array (t ex framsidan eller koniska) behöver tas bort från on-chip montering på bekostnad av något lägre spatial upplösning i fluorescerande läge ^3.
4. Micro-fluidic Chips: Den mikro-fluidic chips som används i vår plattform är tillverkade med hjälp av PDMS (Polydimetylsiloxan) väggar placeras på objektglas skapa mikro-kanaler som behövs för on-chip-avbildning. Att tillverka dessa mikro-fluidic kanaler vi arbeta för följande recept:
   1. PDMS A och B elastomerer är jämnt blandas och rörs om med 1:10 volymen.
   2. När denna heterogena hälls i en petriskål, är det botas vid 65 ° C i 2 timmar.
   3. Använda en X-Acto kniv, den föreskrivna storleken och formen på mikro-fluidic kanal mur ur petriskål.
   4. Enheten bindning sedan uppnås genom att använda en hög frekvens plasma generator (Electro-Technic Products Inc., BD-10AS), som måste utsätta både bilderna täcker glaset och PDMS bindning området.
   5. Efter denna plasma behandling är enheten placeras i en ugn i ~ 40-50 minuter vid 70 ° C för att stärka bindning.
5. Montering och justering av lensless on-chip mikroskopi plattform:
   Församlingen rutiner för våra lensfree on-chip-avbildning plattform kan vara detaljerad som:
   1. Skyddsglas av optoelektroniska sensor-array tas bort.
   2. Använda ett vakuum penna (Edmund Optics, NT57-636), är en tunn absorption filtret försiktigt placeras på toppen av detektorns aktiva området.
   3. En fiberoptisk frontpanelen eller en taper är placerad på toppen av denna absorption fIlter.
   4. Den fabricerade mikro-fluidic chip är sedan direkt upp på toppen av fiberoptiska array.
   5. Ett glas prisma eller en halvklotet är monterad ovanför mikro-fluidic chip med hjälp av ett index-matchning olja (Cargille, immersionsolja 300-serien) så att brytningsindex av gränssnittet är anpassat till glaset brytningsindex.
   6. Side belysning fiber flyttas närmare prisma (eller halvklotet) och dess vinkel är anpassad för att säkerställa att total-intern reflektion sker vid glas-luft-gränssnittet motsvarar mikro-fluidic chip bottensubstratet. Den vertikala belysning (för lensfree överföring imaging) är anpassad till vara vinkelrätt mot detektorn-array och centreras till ett önskat fält-of-view.
   7. Side och vertikala ljus-källor är sekventiellt slås på / av för att uppnå både lysrör bildbehandling och ljusa fält överföring avbildning med samma on-chip-plattform.
   8. Lensfree RAW-bilder då förvärvas med hjälp av en anpassad utvecklat Labview gränssnitt via en dator (t.ex. 3,2 GHz-processor, Intel Core).

2. Provberedning

Vi använde fluorescerande mikro-pärlor (t.ex. Invitrogen, Fluospheres) att kalibrera vår avbildning plattform, genom att mäta sitt lensfree systemet point-spread funktion (PSF). Efter denna första polyesterstapelfibrer mätningen är klar kan olika celler eller små djur modellen (t ex transgena C. elegans prover) avbildas med samma on-chip-plattform.

Från och med nästa avsnitt kommer vi att lämna ytterligare detaljer om våra steg provberedning.

1. Lysrör mikro-pärlor:
   1. Raw fluorescerande pärla lösningar kombineras med DI-vatten för att optimera koncentrationen av proverna.
   2. ~ 10 mikroliter av fluorescerande pärla lösningen blandas med 40 mikroliter, 5 ml och 20 ml DI-vatten för 10 mikrometer, 4 ìm och 2 ìm pärlor diameter, respektive. Heterogena lösningar av olika pärlor (t.ex. icke-lysrör och lysrör) bereds vid behov genom att blanda olika pärla lösningar med varandra.
   3. Det slutliga urvalet lösning kan sedan injiceras i mikro-fluidic chip från sidan PDMS väggarna med en vass injektionsnålen (Fisher Scientific, BD PrecisionGlide Needles, 14-826 serien)
2. Vita blodkroppar märkning:
   1. En volym på ~ 100 mikroliter blod blandas med ~ 1 mL av röda blodkroppar lyserings buffert (eBioscience).
   2. Efter inkubation ~ 3 min, är lyseras blodet lösningen centrifugeras och pellets lagret är suspenderade i ~ 200 mikroliter av PBS (Fosfatbuffrad saltlösning).
   3. Att märka nukleinsyra i celler med fluorescerande färgämnen, är 5 mikroliter av 1mm SYTO 16 läggs till 200 mikroliter av resuspension, varefter provet inkuberas ~ 30 min i mörker vid rumstemperatur.
   4. Andra centrifugering tillämpas på det här märks prov, där supernatanten tas bort för att minska bakgrundsljud på grund av fluorescerande utsläpp från obundna färgämnen.
   5. Vita blodkroppar pellets lagret är suspenderade i PBS som sedan kan överföras till en mikro-fluidic chip för lensfree on-chip-fluorescerande imaging (se t.ex. figur 7).

3. Digital bearbetning av den förvärvade lensless fluorescerande bilder

I detta lensless avbildning plattform, är två olika algoritmer används för att digitalt öka upplösningen av systemet, nämligen Lucy-Richardson deconvolution och tryckhållfasthet provtagning baserad avkodning. Genom att använda dessa digitala bearbetningsmetoder, kvantifieras vi Resolution Enhancement som kan uppnås med varje inställning genom att lösa tätt pärla-par (se fikon. 5-6). Den rekonstruerade lensfree fluorescerande bilder kan sedan pseudocolored (om så önskas) för att markera den naturliga färgen på mikro-objekt, som säkert kräver förkunskaper om fluorescerande signal våglängd, om inte en färg (t.ex. en RGB: röd-grön-blå CCD / CMOS-sensor)-chip används. För dessa digitala bearbetningsmetoder, är specialanpassade utvecklat algoritmer som används som bara kräver en processor (till exempel en 3,2 GHz processor, Intel Core). Potentiellt kan nästa generation grafikprocessorer enheter (GPU) kan också användas för snabbare bearbetning. Förutom bildframställning, om det behövs, kan avkodas fluorescerande objekten också automatiskt räknas med en anpassad utvecklat gränssnitt (se bild. 8) för on-chip cytometry applikationer.

1. Mätning av systemet Point-Spread Funktion (PSF):
   Före varje digital bearbetning till beslut förbättringar (t.ex. deconvolution eller tryck-avkodning), behöver osammanhängande punkt spridning funktion av on-chip-systemet kan uppskattas, vilket kan uppnås genom genomsnitt flera uppmätta lensfree fluorescerande mönster skapat av isolerade små lysrör pärlor finns vid en viss höjd från sensor-chip. Dessaenskilda fluorescerande mönster är då i linje med avseende på deras masscentrum koordinater som medelvärdet efter lämplig intensitet normalisering ^1,2. Detta genomsnitt lensfree mönstret kan sedan användas som fluorescerande punkt spridning funktion av vår on-chip mikroskop.
2. Lucy-Richardson Deconvolution ^1: För att digitalt förbättra den rumsliga upplösningen i vår plattform, foder vi den råa förvärvade fluorescerande bild och den uppmätta osammanhängande peka spred funktion i en accelererad Lucy-Richardson algoritm ^8-10. Genom att tillämpa Bayes 'sats använder Lucy-Richardson algoritm den uppmätta punkten spridda funktion för att iterativt förfina maximal sannolikhet uppskattning av fluorescens källan fördelning på objektet plan ^8,9. Den iterationen processen avslutas normalt efter några hundra cykler före uppkomsten av brusförstärkning att säkerställa minimal square error mellan de prognostiserade och den uppmätta lensfree fluorescerande mönster. Konvergensen av denna deconvolution algoritmen har också påskyndats av en vektor extrapolering metod för att förkorta beräkningstiden ^10. För att ge en idé: denna algoritm ger en effektiv fysisk upplösning på ~ 20 m (med en CCD / CMOS-chip med en pixelstorlek på t.ex. ~ 9μm) och kan deconvolve en FOV på ~ 8 cm ² inom några tiotal minuter på en vanlig PC som kör Matlab ^1. Observera att samma beräkningstiden droppar till bara ett par sekunder för t ex, ~ 1mm ² FOV som är jämförbar med FOV på en typisk 10X objektiv.
3. Tryckhållfasthet provtagning / avkänning baserade gles-signal avkodning ^2: Ytterligare upplösning förbättring (ner till <4 ìm) ⁴ kan uppnås med hjälp av Tryckhållfasthet Sensing / provtagning baserad avkodningsalgoritmer ^11,12. Tryckhållfasthet Provtagning / Sensing erbjuder en nyligen framväxande teoretiskt ramverk ^13-15 som syftar till att återställa en gles signal från betydligt färre prover än vad som krävs enligt samplingssatsen. Även i allmänhet, signal återhämtning från under provtagning-mätningar är ett illa ställt problem för en viss klass av funktioner (nämligen för glesa funktioner), den välkända samplingssatsen och dess representation grunden är nyligen visat sig vara ganska ineffektiva när det gäller av antalet mätningar som krävs, dvs kan samma glesa signalen i allmänhet vara unikt återhämtat sig från mycket få prover jämfört med den klassiska provtagning teorin.
   Lensless fluorescerande bilder som spelats in av våra on-chip mikroskop tillfredsställa sig ett viktigt krav för Tryckhållfasthet Avkodning: För de program som är av intresse för detta arbete, som brett fält fluorescerande Cytometry, sällsynta celler analys och hög genomströmning micro-array bildbehandling, fluorescerande objekt av intresse kan anses redan vara sparsam. Därför, i våra lensless fluorescerande mikroskop, kan avkodning av fördelningen och den relativa styrkan hos fluorescerande sändare placerad på objektet planet modelleras som en storskalig L _1-reglerats minsta kvadrat problem som kan lösas med hjälp av t.ex. en interiör- punkt metod ^2,12. Detta optimeringsproblem kan matematiskt uttryckas som:
   
   där | | u | | _k = (Σ _I ⁿ | U _I | ^{k) (1 / k)} och | | u | | _∞ = MAX _I | U _I |. Därför minimerar vi l _1-reglerats L _2-normen av skillnaden mellan den inspelade / uppmätt (y) och den uppskattade (Ax) lensfree bilder, där x och A representerar källan distribution som ska avkodas och mätningen matrisen bildas med hjälp av experimentell polyesterstapelfibrer av systemet, respektive. Vi använder också en begränsande funktion tvingar källan fördelning på objektet planet att vara ett negativt tal. Denna iterativa tryckhållfasthet avkodning Processen slutar när värdet av kostnaden funktionen når till en förutbestämd tolerans värde. Legalisering (β) och tolerans parametrar är i allmänhet funktioner av objektet gleshet och mätning ljudnivå, och är optimerade i vårt system till ~ βmax/10 och ~ 0,01, respektive.
   Baserat på ovanstående beskrivs numeriska system, tryckspänning avkodning av råvaror fluorescerande bilder förbättrar kraftigt vår plattform förmåga att lösa glesa objekt och uppvisar en processorhastighet jämförbar med Lucy-Richardson Deconvolution ^2. Förutom exponering av ett enda lager, kan fluorescerande objekt som finns på olika djup också avkodas och separeras från varandra samtidigt genom att köra samma algoritm använder alla vävda motsvarar olika djup lager ^2.
4. Pseudocoloring: Även om inte en grundläggande begränsning, som presenteras on-chip-imaging plattform mestadels använder svartvita optoelektroniska SEnsor matriser som i allmänhet ger bättre signal-brus-förhållandet för biologiskt prov avbildning. Därför är den råa fluorescerande bilder förvärvade i gråskala format som inte innehåller den verkliga färginformation av proverna. Detta kan lindras med hjälp av CCD / CMOS-chip i våra lensfree bildhantering arkitektur så att tre färgkanalerna (röd, grön och blå) förvärvas i varje lensfree fluorescerande mätning. Å andra sidan, om den märkning färgen avgaser redan är kända, RAW-format gråskala fluorescerande bilder av en svartvit sensor-chip och deras avkodas / deconvoled versioner kan också vara artificiellt konverteras till färgbilder med hjälp av en pseudocoloring algoritm genomförts i t.ex. MATLAB. För detta ändamål kan de förvärvade gråskalebilder utökas till 3-dimensionell data-kuber, där alla färger av intresse kan syntetiseras genom användning av lämpliga väga faktorer vid varje pseudo-kanal av data kuben. Som ett resultat av denna behandling, kan monokroma lensfree fluorescerande bilder konverteras (om så önskas) för att flera kanaler bilder som ger kända färginformation i en viss fluorescerande objektet.
5. Automatiserad fluorescerande celler räkna: För Cytometry applikationer, har vi också utvecklat ett skräddarsytt användargränssnitt (se bild 8.) Som automatiskt kan räkna fluorescerande objekt / celler baserat på deras lensfree bilder som förvärvats med våra on-chip mikroskopi plattform. Mot denna uppgift är initialt en mjuk tröskelvärde som tillämpas för att rå lensfree bilder för att begränsa potentiella platser för fluorescerande objekt. Sedan finns en rad funktioner (särskilt regionprops) används för att mäta bild egenskaperna för varje sub-regionen av intresse, såsom läge, areal, form och intensitet. Med hjälp av dessa objekt uppgifter är binära objekt som delas in i undergrupper, som t.ex. celler, döda pixlar, samt damm eller bakgrund auto fluorescens. När det slutliga resultatet av regionprops funktion är filtrerad så att endast de celler av intresse, kan längden på den resulterande strukturen array användas för att få celler över hela FOV av våra lensfree on-chip kameran.

4. Representativa resultat:

En översikt över vår inställning visas i figur 1, med flera optiska komponenter som används i monteringen. Viktiga funktioner i vår on-chip mikroskopi plattformen beskrivs i figur 2, inklusive lysrör excitation och detektion, total inre reflektion samt delvis sammanhängande belysning för holografiska sändning avbildning på samma plattform. Lensless fluorescerande on-chip bildbehandling resultatet av en heterogen blandning som innehåller olika mikropartiklar (4 ìm grön och 10 mikrometer grön / röd) visas i figurerna 3-4. Jämförelse av Lucy-Richardson deconvolution och tryckhållfasthet Provtagning / Sensing baserad avkodning finns i Figur 5 för digitalt förbättra upplösningen av rå lensless fluorescerande bilder. Tryckhållfasthet avkodning aktiverat rumslig upplösning (<4 mikrometer) kvantifieras i Figur 6. Lensless on-chip mikroskopi av fluorescerande vita blodkroppar illustreras i Figur 7, som också tillhandahåller jämfört bilder tagna med en konventionell fluorescerande mikroskop. Slutligen är vår automatiska fluorescerande objektet räkna gränssnittet visas i figur 8.

Figur 1. Översikt av våra lensless on-chip bildbehandling inställning visas med flera optiska komponenter som används i monteringen.

Figur 2. Schematisk bild av on-chip lensfree fluorescerande avbildning plattform visas (vänstra bilden). Fluorescens excitation uppnås genom sidan aspekten av en romboid prisma med en osammanhängande källa. Den experimentella uppsättning av vår on-chip fluorescerande imaging plattform visas också (högra bilden). Hela blodprov inom en mikroflödessystem chip (dimensioner: 2,5 x 3,5 x 0,3 cm) var upphetsad genom prismat gränssnitt där index matchande olja används för att montera chipet och prisma. Efter avvisandet av excitation ljus genom TIR och färgfilter, var bara fluorescerande emissionen från de märkta blodkropparna registreras av våra CCD-chip (KODAK 11.002) över en FOV på ~ 2,5 x 3,5 cm.

Figur 3. Brett fält lensless fluorescerande on-chip-avbildning av en blandning som innehåller 4 ìm och 10 mikrometer grönt fluorescerande partiklar illustreras. Som jämförelse är 10X mikroskop objektiva bilder också, vilket stämmer väl överens med våra lensless fluorescerande bilder.

Figur 4.

Figur 5. Performance jämförelse av Lucy-Richardson (LR) deconvolution och tryckhållfasthet provtagning (CS) baserat avkodningsalgoritmer tillhandahålls för avbildning av olika 10 mikrometer pärla-par. Den översta raden visar lensless råa fluorescerande bilder. Den infällda bilder i den översta raden visar mikroskop jämförelser av samma partiklar som förvärvas med hjälp av en 10X objektiv. Den mellersta raden visar vår tryck-avkodning resultat medan den nedersta raden visar Lucy-Richardson deconvolution resultat. D, D _CS, och d _LR hänvisar till center-till-centrum avstånd i mikroskop bilder, avkodas CS lensless bilder, och LR deconvolved lensless bilder, respektive.

Figur 6. Digital bearbetning av lensless fluorescerande RAW-bilder illustreras. En tryckspänning Provtagning baserad algoritm används för att uppnå <4 ìm rumsliga upplösningen genom att lösa tätt 2 ìm diameter pärla par. Den inläggningar visar också 40X jämförelser mikroskop mål, vilket stämmer väldigt väl överens med den avkodade fluorescerande bilder. Här d hänvisar till center-till-centrum avstånd i mikroskop bilder, medan d _CS hänvisar till center-till-centrum avstånd på CS avkodade lensless fluorescerande bilder.

Figur 7. Lensless avbildning av fluorescerande (SYTO 16) vita blodkroppar illustreras. Den råa lensfree bilder snabbt avkodas med hjälp av en CS-baserad avkodare, vilket stämmer väl med ett konventionellt mikroskop bild av samma prov som förvärvas med 10X objektiv.

Figur 8. En specialdesignade automatiserade fluorescerande objektet räkna gränssnitt (i MATLAB) illustreras.

Discussion

Vi visade en on-chip fluorescerande mikroskopi plattform som kan uppnå exempelvis <4μm spatial upplösning än t.ex.> 0,6-8 cm ² field-of-view utan användning av alla linser, mekanisk-scanning eller tunn film interferens-filter. Med den här tekniken med hjälp av en fiberoptisk frontpanelen eller en kona, är fluorescerande utsläpp från föremål som samlats in med en 2D-array av fiberoptiska kablar innan leverans till en opto-elektronisk sensor-array som en CCD / CMOS-chip. Dessa förvärvade lensfree bilderna sedan snabbt bearbetas för att ge <4μm upplösning över> 0,6-8 cm ² field-of-view med en tryckkraft provtagning / avkänning baserad avkodning algoritm. En sådan kompakt och brett fält fluorescerande imaging plattform kan vara ganska användbar för hög genomströmning Cytometry, sällsynta cell forskning samt microarray-analys.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Charge-coupled device(CCD)	KODAK	KAF-8300
Charge-coupled device(CCD)	KODAK	KAF-11002
Charge-coupled device(CCD)	KODAK	KAF-39000
Complementary Metal-Oxide-Semiconductor (CMOS)	Micron	MT9T031C12STCD
High power LED light source	Thorlabs Inc.	M455L2-C2
High power LED driver	Thorlabs Inc.	LEDD1B
Fiber coupled LED light source	Mightex	FCS-0625-000
Vacuum Pen	Edmund Scientific	NT57-636
2, 4, 10 μm Fluospheres	Invitrogen	F-8826, F-8859, F-8836
RBS lysis buffer 1X	eBioscience	00-4333
SYTO 16 labeling reagent	Invitrogen	S7578
Fiber-optic faceplate	Edmund Scientific	NT55-142
Fiber-optic taper	Edmund Scientific	NT55-134
Prisms	Edmund Scientific	NT47-626, NT45-403
Filters	Edmund Scientific	NT39-417
PDMS Elastomers	Dow Corning	Slygard 184