Summary
تم وصف طريقة لتوسيع الخلايا التائية γδ من خلايا الدم المحيطية وحيدات النوى (PBMC). يتم تحفيز PBMC المستمدة من الخلايا التائية γδ وتوسيع استخدام zoledronate وانترلوكين 2 (IL - 2). ويمكن تطبيق توسيع نطاق كبير من الخلايا المناعية تي γδ لالخلوية ذاتي من السرطان.
Abstract
يمكن الإنسان γδ الخلايا التائية الاعتراف والاستجابة لطائفة واسعة من التوتر الناجم عن المستضدات ، وتطوير نشاط واسع وبالتالي الفطرية المضادة للورم ومكافحة العدوى. 1 غالبية الخلايا التائية γδ في الدم المحيطي لديها مستقبلات الخلايا التائية Vγ9Vδ2. هذه الخلايا الاعتراف المستضد بطريقة معقدة رئيسية مستقلة التوافق النسيجي وتطوير وظائف قوية والمستجيب لحل الخلايا مثل TH1 - 1 لذلك ، γδ الخلايا هي خلايا تي مرشحا جذابا المستجيب للعلاج مناعي السرطان. Vγ9Vδ2 خلايا تي الاستجابة لphosphoantigens مثل (E) - 4 - 3 - هيدروكسي ميثيل لكن - 2 - enyl بيروفوسفات (HMBPP) ، الذي يتم تصنيعه في البكتيريا عبر isoprenoid الحيوي ؛ 2 و بيروفوسفات isopentenyl (IPP) ، والتي يتم إنتاجها في الخلايا حقيقية النواة من خلال مسار mevalonate. 3 في حالة فسيولوجية ، وتوليد IPP في الخلية nontransformed لا يكفي لتنشيط الخلايا T γδ. التقلبات في مسار mevalonate في الخلايا السرطانية يؤدي إلى تراكم IPP وتنشيط خلايا تي γδ 3 لأن aminobisphosphonates (مثل pamidronate أو zoledronate) تمنع farnesyl سينسيز بيروفوسفات (FPPS) ، انزيم يعمل المصب من IPP في مسار mevalonate ، ومستويات من الخلايا ويمكن IPP sensitibity إلى الاعتراف γδ زيادة الخلايا التائية التي aminobisphosphonates علاجيا. IPP تراكم أقل كفاءة في خلايا nontransfomred من الخلايا السرطانية مع التركيز عقاقيري ذات الصلة من aminobisphosphonates ، التي تسمح لنا العلاج المناعي للسرطان عن طريق تنشيط خلايا تي γδ مع aminobisphosphonates 4 المثير للاهتمام ، IPP يتراكم في حيدات عندما يتم التعامل مع PBMC aminobisphosphonates ، وذلك بسبب كفاءة امتصاص الدواء من قبل هذه الخلايا. 5 حيدات التي تتراكم تصبح IPP مستضد تقديم الخلايا ويحفز الخلايا التائية Vγ9Vδ2 في الدم المحيطي. 6 وبناء على هذه الآليات ، قمنا بتطوير تقنية لتوسيع نطاق واسع من الثقافات γδ باستخدام الخلايا التائية zoledronate وانترلوكين -2 (IL - 2). 7 طرق أخرى لتوسيع نطاق الاستفادة من الخلايا التائية γδ في bromohydrin phosphoantigens الاصطناعية بيروفوسفات (BrHPP) 8 أو 2 - 3 - الميثيل - butenyl - 1 - بيروفوسفات (2M3B1PP) 9 وجميع هذه الأساليب تسمح السابقين فيفو التوسع ، مما أدى إلى أعداد كبيرة من الخلايا التائية γδ لاستخدامها في العلاج المناعي بالتبني. ومع ذلك ، zoledronate الوحيد هو كاشف وافقت عليها ادارة الاغذية والعقاقير متوفرة تجاريا. Zoledronate الموسع γδ الخلايا التائية عرض CD27 -- CD45RA -- المستجيب النمط الظاهري الذاكرة ويمكن تقييم وظيفتها بواسطة الإنترفيرون γ مقايسة الإنتاج 7.
Protocol
1. عزلة PBMC
- سحب الدم (7،5-8،0 مل) في أنبوب دينار بحريني CPT Vacutainer إعداد الخلية مع هيبارين الصوديوم. أنبوب يحتوي على تخثر هيبارين الصوديوم والسوائل كثافة Ficoll - Hypaque ، بالإضافة إلى حاجز هلام البوليستر ، والذي يفصل بين السوائل اثنين. أنبوب الطرد المركزي / عينة الدم في درجة حرارة الغرفة (18 درجة مئوية إلى 25 درجة مئوية) في الدوار الأفقي (سوينغ التدريجي الرأس) لمدة 20 دقيقة في ز س 1800. الطرد المركزي التبديل قبالة الفرامل.
- بعد الطرد المركزي ، وتسلسل طبقات يحدث على النحو التالي (ينظر من الأعلى إلى الأسفل) : البلازما) -- ب) الخلايا الدموية المحيطية وحيدات النوى (PBMC) والصفائح الدموية -- ج) حل الكثافة -- د) هلام البوليستر -- ه) المحببة -- و) خلايا الدم الحمراء (الشكل 1).
- جمع جزء من طبقة البلازما ، وترك 5-10 ملم من البلازما فوق الطور البيني من دون إزعاج طبقة الخلايا. يمكن استخدام البلازما للثقافة (القسم 2.5).
- حصاد الكسر المخصب (PBMC) في الطور البيني مع ماصة ونقل إلى أنبوب مخروطي 15 مل.
- غسل PBMC مع 10 مل من الفوسفات مخزنة المالحة (PBS) ، عن طريق أنبوب للقلب 5 مرات ، وأجهزة الطرد المركزي لمدة 5 دقائق ثم في ز س 400.
- كرر الخطوات من الغسيل مرتين ، ثم resuspend الكرية خلية في 5 مل من برنامج تلفزيوني. تحديد عدد الخلايا. وعادة ما يتم استرداد 1.3 X10 6 خلايا من 1 مل من الدم الكامل.
- تحديد وتيرة والنمط الظاهري من خلايا تي في γδ PBMC بواسطة التدفق الخلوي (القسم 3) (الشكل 2).
2. توسيع الخلايا التائية γδ
- الطرد المركزي تعليق خلية في أنابيب مخروطية 15 مل لمدة 5 دقائق في ز × 400 في درجة حرارة الغرفة ، وتجاهل supernatants.
- تحضير مستنبت (CM) وذلك بإضافة IL - 2 الإنسان (IL - 2) وzoledronate (Zometa) لتركيزات النهائي من 1000 وحدة دولية / مل و 5 ميكرومتر ، على التوالي. ALyS203 (علم الخلية ومعهد التكنولوجيا) أو OpTmizer (Invitrogen) وسائل الإعلام دعم التوسع جيدة من الخلايا التائية γδ (مزيد من المعلومات في المراجع 6 و 9). وتقدم Zometa في شكل سائل (4 mg/5-ml فيال). لإعداد حل ميكرومتر 5 ، إضافة ميكرولتر من 50 إلى 30 مل Zometa متوسطة الثقافة.
- Resuspend الخلية بيليه في المتوسط الثقافة والتكيف مع الخلايا 1x10 6 / مل.
- الماصة 1 مل من CM تحتوي 1x10 6 خلايا في كل بئر من لوحة ال 24 أيضا. على نطاق واسع الثقافات ، يمكن خلايا المصنف عند 0.5 X الخلايا 6 10 / سم 2 وفقا للمناطق الآبار السطحية للصفيحة ، صحن ، أو قارورة.
- إضافة البلازما ذاتي (القسم 1.3) ، المجمعة الأمصال البشرية AB ، أو FCS بحيث يكون حوالي 10 ٪ من حجم ثقافة (100 ميكرولتر لكل بئر من لوحة 24 أيضا). وضع لوحات في ترطيب 37 درجة مئوية ، 5 ٪ CO 2 حاضنة لل24-48 ساعة.
- الحفاظ على الثقافة في مناطق ذات كثافة خلية من 0،5-2 × 10 6 خلية / مل. إضافة المتوسطة الطازجة تحتوي IL - 2 الإنسان (1000 وحدة دولية / مل) فقط (دون Zometa) كل 2-3 أيام ، ونقل الخلايا المستزرعة في آبار جديدة أو القوارير ، حسب الاقتضاء ، وفقا لدرجة من تكاثر الخلايا (الشكل 3). العرض البلازما أو مصل في المتوسط حتى يمكن الحفاظ على تركيز المصل لا يقل عن 1 ٪.
- خلايا حصاد يوم 14/12 ، وتحديد وتيرة والنمط الظاهري ، ووظائف الخلايا التائية التي γδ التدفق الخلوي (أنظر أدناه).
3. المظهري تحليل التدفق الخلوي
- نقل 200 عينة تحتوي على ميكرولتر 2 × 10 5 الخلايا لفرز مضان تنشيط الخلايا (FACS) الأنابيب.
- إضافة 2 مل من برنامج تلفزيوني الباردة وأجهزة الطرد المركزي لمدة 5 دقائق في ز س 400. ثم ، resuspend الكريات العازلة في 50 ميكرولتر FACS (PBS + 1 ٪ FCS أزيد الصوديوم + 0.1 ٪). إضافة 5 ميكرولتر من كل الأجسام المضادة للعينات (يتم سرد الاجسام المضادة في الجدول 1).
- احتضان على الجليد في الظلام لمدة 20 دقيقة.
- إضافة 2 العازلة FACS مل لكل عينة ، ومن ثم الدوامة. عينات من أجهزة الطرد المركزي لمدة 5 دقائق في ز س 400 في 4 درجات مئوية. صب بعناية طاف.
- Resuspend الخلايا في 300 ميكرولتر FACS العازلة والدوامة. تحليل العينات على تدفق عداد الكريات (الشكل 2).
4. الإنترفيرون γ مقايسة إنتاج 10
- قبل يوم من الفحص ، وإعداد الخلايا مشجعا بواسطة زراعة الخلايا 3-5 X10 داودي 5 / مل في المتوسط 1640 RPMI FCS زائد 10 ٪ (RPMI - 10) بين عشية وضحاها مع Zometa (5 ميكرومتر) (Z - المعينة الآخرة دودي).
- جمع Z - داودي وresuspend في RPMI - 10 في الخلايا 2x10 6 / مل. إضافة ميكرولتر من 100 Z - داودي (2x10 5) إلى كل بئر من لوحة الجولة القاع 96 - جيدا.
- تحضير الخلايا التائية γδ في الخلايا 2x10 6 / مل في RPMI - 10 التي تحتوي على 20 ألف Brefeldin ميكروغرام / مل. نقل 100 ميكرولتر من γδ تعليق الخلايا التائية (2x10 5) إلى كل الخلايا التي تحتوي على Z - داودي جيدا أو للسيطرة على آبار (100 ميكرولتر من RPMI - 10 فقط ، أو RPMI - 10 مع 20 نانوغرام / مل من phorbol 12 - 13 - myristate خلات[PMA] بالإضافة إلى 2 ميكروغرام / مل من ionomycin).
- مزيج من قبل pipetting صعودا وهبوطا عدة مرات. احتضان لمدة 4 ساعة على 37 درجة مئوية ، و 5 ٪ CO 2 الحاضنة.
- لوحة أجهزة الطرد المركزي لمدة 5 دقائق في ز × 400 درجة مئوية في 4 و resuspend الكريات في 200 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني الباردة.
- نقل العينات إلى أنابيب FACS. إضافة 4 مل من برنامج تلفزيوني الباردة وأنابيب أجهزة الطرد المركزي لمدة 5 دقائق في ز س 400 في 4 درجات مئوية.
- Resuspend الكريات في 50 ميكرولتر من FACS العازلة مع FITC - مترافق TCRVγ9 المضادة (5 ميكرولتر) وPE/Cy5-conjugated مكافحة CD3 خريطة موقع (2.5 ميكرولتر). احتضان محمية من الضوء لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
- إضافة 100 ميكرولتر من كاشف IntraPrep 1 واحتضان لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. إضافة 4 مل من كل أنبوب إلى برنامج تلفزيوني وأجهزة الطرد المركزي لمدة 5 دقائق في ز × 400 في درجة حرارة الغرفة.
- إزالة طاف بواسطة الطموح وإضافة 100 ميكرولتر من 2 كاشف IntraPrep. احتضان لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة دون أن تهتز.
- إضافة 5 ميكرولتر من PE - مترافق مكافحة IFN - γ خريطة موقع في أنبوب اختبار. احتضان محمية من الضوء لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
- إضافة 4 مل من كل أنبوب إلى برنامج تلفزيوني وأجهزة الطرد المركزي لمدة 5 دقائق في ز × 400 في درجة حرارة الغرفة. إزالة طاف بواسطة الطموح وresuspend الكرية خلية في 0.5 مل من FACS العازلة.
- تحليل الخلايا عن طريق تدفق عداد الكريات. بوابة على خلايا + + CD3 TCRVγ9 ودراسة التعبير عن الإنترفيرون γ (الشكل 4).
5. ممثل النتائج :
من المهم تحديد نسبة الخلايا التائية γδ في PBMC في الشروع في الثقافة. كما هو مبين في الشكل. 2 ألف ، نسبة TCRVγ9 + + CD3 كان γδ خلايا T في PBMC 1.6 ٪ في اليوم 0. وكان السكان المهيمن CD27 + + CD45RA ساذج أو CD27 CD45RA + -- الظواهر الذاكرة المركزية. تشكلت عندما كانت حفز بكفاءة γδ الخلايا التائية ، والتكتلات في أيام 3-5 (الشكل رقم 3 ألف وباء). عندما تأخر تشكيل كتلة ، ونمو أنواع الخلايا الأخرى ، مثل خلايا CD4 + أو + CD8 αβ خلايا تي أو الخلايا القاتلة الطبيعية ويمكن السيطرة على نمو الخلايا التائية γδ (الشكل 3 C و D). بعد 14 يوما من الثقافة ، وزيادة وتيرة الخلايا التائية γδ إلى أكثر من 93.8 ٪ من الخلايا المستزرعة في نجاح γδ الثقافات الخلايا التائية (الشكل 2 E). المثقف الخلايا التائية γδ NKG2D upregulated وCD69 التعبير (الشكل 2 G و H). عرضها CD27 -- CD45RA -- المستجيب النمط الظاهري الذاكرة (الشكل 2 F). تم تقييم وظائف الخلايا التائية γδ فيما يتعلق بالإنتاج وخلوى السمسة. والإنترفيرون γ الخلايا تلطيخ أثبتت أن تنتج الخلايا التائية γδ الإنترفيرون γ استجابة لسلطة النقد الفلسطينية / ionomycin المعاملة أو خلايا Z - IPP داودي التي تراكمت بعد العلاج zoledronate (الشكل 4). هذه النتائج تشير إلى أن zoledronate يمكن أن يحفز الكفاءة الوظيفية وتوسيع الخلايا التائية γδ.
| أنبوب | FITC | PE | تنمية الطفولة المبكرة | PE/Cy5 |
| 1 | CD3 | CD19 | CD45 | CD14 |
| 2 | CD3 | TCRαβ | CD4 | CD8 |
| 3 | CD3 | CD56 | ||
| 4 | TCR Vγ9 | TCRαβ | CD45 | CD3 |
| 5 | TCR Vγ9 | NKG2D | ||
| 6 | TCR Vγ9 | CD69 | ||
| 7 | TCR Vγ9 | الماوس IgG1 | ||
| 8 | TCR Vγ9 | CD45RA | CD27 | |
| 9 | TCR Vγ9 | الماوس IgG1 | الماوس IgG1 |
الجدول 1. الاجسام المضادة المستخدمة في تلوين متعدد الألوان من الخلايا التائية γδ. ويرد مثال للتحليل المظهري من الخلايا التائية γδ أجريت في مختبر لدينا في الشكل. 2.
الشكل 1. فصل PBMC. ويوجه الدم (7،5-8،0 مل) في أنبوب دينار بحريني CPT Vacutainer إعداد الخلية مع هيبارين الصوديوم وطرد مباشرة لمدة 20 دقيقة في ز س 1800. بعد الطرد المركزي ، مما أدى إلى طبقات كما رأينا من أعلى إلى بوttom : أ بلازما) -- ب) والصفائح الدموية PBMC -- حل الكثافة ج) -- د) هلام بوليستر -- ه) المحببة -- و) خلايا الدم الحمراء.
الشكل 2. نموذجي النمط الظاهري سطح الخلايا التائية γδ. وقد حفزت PBMC مع zoledronate وIL - 2 لمدة 14 يوما. تم صبغ الخلايا مع FITC ذات العلامات المضادة للTCR Vγ9 وPE/Cy5-labeled مكافحة CD3 لرصد التوسع في الخلايا التائية γδ (A و E). وقد تم تحديد الخلايا التائية التي γδ التعبير عنها من TCRVγ9 ، ودرست خلاله التعبير عنها من وCD45RA CD27 (B و F) ، NKG2D (C و G) ، أو CD69 (D و H).
الشكل 3. الممثل الخلايا التائية γδ الثقافات. وقد حفزت PBMC مع IL - 2 (1000 وحدة دولية / مل) ، وzoledronate (5 ميكرون). تظهر حقول ممثل (IX71 المجهر المقلوب [أوليمبوس] × 200). ويمكن ملاحظة التكتلات والتجمعات من الخلايا التائية γδ يوم 3 (أ) ويوم 5 (باء) ، عندما تم بنجاح موسع γδ خلايا تي. في المقابل ، لم يلاحظ أي كتل أو مجاميع عندما γδ نمو الخلايا التائية لم تكن كافية (C و D).
الشكل 4. الإنترفيرون γ الإنتاج. وحضنت γδ خلايا T - 10 مع RPMI فقط (أ) أو سلطة النقد الفلسطينية / ionomycin (B) أو Z - داودي (C) لمدة 4 ساعة. الأولى ، كانت ملطخة التعبير سطح TCRVγ9 ثم الإنترفيرون γ. تم فحص الانتاج داخل الخلايا الإنترفيرون γ تلطيخ
الشكل 5. حركية γδ الثقافة الخلايا التائية. (أ) العدد المطلق للخلايا المستزرعة ، (ب) النسبة المئوية للخلايا T γδ ، و (ج) العدد المطلق للخلايا T γδ في النقاط الزمنية المشار إليها.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
الطريقة المعروضة هنا يمكن التوسع كفاءة الخلايا التائية γδ من PBMC. γδ تنشيط خلايا تي وتوسعت بنسبة zoledronate IL - 2 وتطوير وظائف المستجيب كاملة ، والتي تعكسها والإنتاج خلوى السمسة. وقد أفيد أن bromohydrin phosphoantigens الاصطناعية بيروفوسفات (BrHPP) و 2 ميثيل - 3 - butenyl - 1 - بيروفوسفات (2M3B1PP) أيضا توسيع الخلايا التائية γδ ؛ ومع ذلك ، فإنها ليست متاحة تجاريا في المقابل ، تم ترخيص بالفعل zoledronate عن التطبيقات السريرية كما Zometa. ولذلك ، فإن كاشف موثوق بها متوفرة بسهولة.
اختيار وسائل الإعلام والثقافة ، ومصل أمر بالغ الأهمية. ثقافة استخدام وسائط مناسبة مثل ALyS203 (علم الخلية ومعهد التكنولوجيا) أو OpTmizer (Invitrogen) لنجاح التوسع γδ الخلايا التائية 11 البلازما تحقق ذاتي ، يمكن أن تجمع البشر AB الأمصال أو FCS γδ دعم الثقافة الخلايا التائية. نتذكر أيضا أن PBMC من بعض الجهات المانحة لم تستجب لتحفيز zoledronate بغض النظر عن الكواشف ثقافة أخرى. اذا ما حدث ذلك ، فإن الخيار الوحيد هو تغيير المانحة.
كما أننا أظهرنا ، وقد تحقق التخصيب من خلايا تي γδ في وقت مبكر نسبيا ، حوالي 80 ٪ من الخلايا المستنبتة والخلايا التائية التي γδ يوم 7. واصلت γδ الخلايا التائية على التكاثر تصل الى 12-14 يوما (الشكل 5). ويمكن الحصول على ما يقرب من 2.2 × 10 8 γδ خلايا تي من 1 × 10 6
PBMC تحتوي على 1.6 × 10 4 γδ خلايا تي. وقد استخدم هذا الأسلوب الثقافة في المرحلة الأولى تقييم التجارب السريرية سلامة وجدوى العلاج Zoledronate - T توسيع γδ نقل الخلايا في المرضى الذين يعانون من المايلوما المتعددة أو سرطان الرئة. 12،13
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
الإعلان عن أي تضارب في المصالح.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| ZOMETA | Novartis AG | zoledronate | |
| PROLEUKIN | Novartis AG | human recombinant IL-2 | |
| BD Vacutainer CPT Cell Preparation Tube with Sodium Heparin | BD Biosciences | 362753 | |
| RPMI1640 | Invitrogen | 21870-076 | |
| ALyS203- medium | Cell Science & Technology Institute | 0301-7 | |
| OpTmizer | Invitrogen | 0080022SA | |
| brefeldin A | Sigma-Aldrich | B5936-200UL | |
| phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA) | Sigma-Aldrich | P1585-1MG | |
| ionomycin | Sigma-Aldrich | 13909-1ML | |
| IntraPrep | Beckman Coulter Inc. | A07803 | |
| anti-human CD3-FITC or PE/Cy5 | Beckman Coulter Inc. | A07746 FITC A07749 PE/Cy5 | |
| anti-human CD4-ECD | Beckman Coulter Inc. | 6604727 | |
| anti-human CD8-PE/Cy5 | Beckman Coulter Inc. | 6607011 | |
| anti-human CD14-PE/Cy5 | Beckman Coulter Inc. | A07765 | |
| anti-human CD19-PE | Beckman Coulter Inc. | A07769 | |
| anti-human CD45-ECD | Beckman Coulter Inc. | A07784 | |
| anti-human CD56-PE/Cy5 | Beckman Coulter Inc. | A07789 | |
| anti-human TCRαβ-PE | Beckman Coulter Inc. | A39499 | |
| anti-human TCR Vγ9-FITC | Beckman Coulter Inc. | IM1463 | |
| anti-human CD27-PE/Cy5 | Beckman Coulter Inc. | 6607107 | |
| anti-human CD45RA-ECD | Beckman Coulter Inc. | IM2711 | |
| anti-human CD69-PE | BD Biosciences | 555531 | |
| anti-human NKG2D-PE | Beckman Coulter Inc. | A08934 | |
| Anti-humal IFNγ-PE | Beckman Coulter Inc. | IM2717U | |
| Mouse IgG1 isotype control-PE | Beckman Coulter Inc. | A07796 | |
| Mouse IgG1 isotype control-ECD or PE/Cy5 | Beckman Coulter Inc. | A07797A07798 |
References
- Bonneville, M., O'Brien, R. L., Born, W. K. γ T cell effector functions: a blend of innate programming and acquired plasticity. Nat Rev Immunol. 10, 467-478 (2010).
- Hintz, M. Identification of (E)-4-hydroxy-3-methyl-but-2-enyl pyrophosphate as a major activator for human γδ T cells in Escherichia coli. FEBS Lett. 509, 317-322 (2001).
- Gober, H. J. Human T cell receptor γδ cells recognize endogenous mevalonate metabolites in tumor cells. J Exp Med. 197, 163-168 (2003).
- Kabelitz, D., Wesch, D., He, W. Perspectives of gammadelta T cells in tumor immunology. Cancer Res. 67, 5-8 (2007).
- Roelofs, A. J. Peripheral blood monocytes are responsible for gammadelta T cell activation induced by zoledronic acid through accumulation of IPP/DMAPP. Br J Haematol. 144, 245-250 (2009).
- Dieli, F. Induction of γδ T-lymphocyte effector functions by bisphosphonate zoledronic acid in cancer patients in vivo. Blood. 102, 2310-2311 (2003).
- Kondo, M. Zoledronate facilitates large-scale ex vivo expansion of functional γδ T cells from cancer patients for use in adoptive immunotherapy. Cytotherapy. 10, 842-856 (2008).
- Espinosa, E. Chemical synthesis and biological activity of bromohydrin pyrophosphate, a potent stimulator of human γδ T cells. J Biol Chem. 276, 18337-18344 (2001).
- Kobayashi, H. Safety profile and anti-tumor effects of adoptive immunotherapy using γδ T cells against advanced renal cell carcinoma: a pilot study. Cancer Immunol Immunother. 56, 469-476 (2007).
- Murali-Krishna, K. Counting antigen-specific CD8 T cells: a reevaluation of bystander activation during viral infection. Immunity. 8, 177-187 (1998).
- Sato, K. Impact of culture medium on the expansion of T cells for immunotherapy. Cytotherapy. 11, 936-946 (2009).
- Abe, Y. Clinical and immunological evaluation of zoledronate-activated Vγ9 γδT-cell-based immunotherapy for patients with multiple myeloma. Exp Hematol. 37, 956-968 (2009).
- Nakajima, J. A phase I study of adoptive immunotherapy for recurrent non-small-cell lung cancer patients with autologous γδ T cells. Eur J Cardiothorac Surg. 37, 1191-1197 (2010).
