Summary
Метод расширить γδ Т-клеток из периферической крови мононуклеаров (МКПК) описывается. РВМС полученных γδ Т-клетки стимулируются и расширить с помощью золедронат и интерлейкин-2 (IL-2). Большое расширение масштабов γδ Т-клеток может быть применен к аутологичных сотовой иммунотерапии рака.
Abstract
Человек γδ Т-клетки могут распознавать и реагировать на широкий спектр стресс-индуцированного антигенами, тем самым развивается врожденная широкий противоопухолевыми и антибактериальными деятельности. 1 Большинство γδ Т-клеток в периферической крови у Vγ9Vδ2 Т клеточного рецептора. Эти клетки распознают антиген главного комплекса гистосовместимости-независимым способом и развивать сильные цитолитического и Th1-подобный эффекторные функции. 1 Таким образом, γδ Т-клетки являются привлекательным кандидатом эффекторных клеток рака иммунотерапия. Vγ9Vδ2 Т-клеток реагировать на phosphoantigens, такие как (E)-4-гидрокси-3-метил-бут-2-енил пирофосфат (HMBPP), который синтезируется в бактериях посредством биосинтеза изопреноидов, 2 и isopentenyl пирофосфат (IPP), который производится в эукариотических клетках через мевалоната пути. 3 В физиологическом состоянии, поколения ИПП в nontransformed ячейка не является достаточным для активации γδ Т-клеток. Дисрегуляция мевалоната пути в опухолевых клетках приводит к накоплению IPP и γδ Т-клеток, активации. 3 Поскольку аминобисфосфонатов (таких, как памидронат или золедронат) тормозят фарнезил синтазы пирофосфат (ГЛС), фермент действует на выходе из ИПП в мевалоната пути, внутриклеточные уровни IPP и sensitibity к γδ признание Т-клеток может быть терапевтически увеличился на аминобисфосфонатов. IPP накопления менее эффективен в nontransfomred клеток, чем опухолевые клетки с фармакологически соответствующей концентрации аминобисфосфонатов, которые позволяют нам иммунотерапии рака путем активации Т-клеток γδ с аминобисфосфонатов. 4 Интересно, что IPP накапливается в моноциты, когда РВМС относятся с аминобисфосфонатов, из-за эффективной наркотиков поглощение этих клеток. Моноциты 5, которые накапливаются IPP стать антиген-представляющих клеток и стимулируют Vγ9Vδ2 Т-клеток в периферической крови. 6 На основе этих механизмов, мы разработали методику для крупномасштабного расширения γδ культурах клеток Т использованием золедронат и интерлейкина -2 (IL-2). 7 Другие методы для расширения γδ Т-клетки используют синтетические bromohydrin phosphoantigens пирофосфат (BrHPP) 8 или 2-метил-3-бутенил-1-пирофосфат (2M3B1PP) 9. Все эти методы позволяют бывшим естественных условиях расширения, в результате чего большое количество γδ Т-клеток для использования в приемных иммунотерапии. Однако, только золедронат является FDA утвержденных коммерчески доступных реагентов. Zoledronate расширенной γδ Т-клетки CD27 дисплей - CD45RA - эффектор фенотип памяти и их функции могут быть оценены IFN-γ производства анализа 7.
Protocol
1. Выделение МКПК
- Нарисуйте крови (7,5-8,0 мл) в BD Vacutainer КПП сотовый Подготовка труб с гепарином натрия. Трубка содержит антикоагулянт гепарин натрия и Ficoll-Hypaque плотность жидкости, а также барьер полиэстер гель, который отделяет двух жидкостей. Одноразовая пробирка / крови при комнатной температуре (18 ° C до 25 ° С) в горизонтальный ротор (поворотно-откидной головкой) в течение 20 мин при 1800 х г. Коммутатор центрифуги тормоза прочь.
- После центрифугирования последовательность слоев происходит следующим образом (если смотреть сверху вниз):) плазмы - Ъ) мононуклеарных клеток периферической крови (МКПК) и тромбоцитов - с) плотность раствора - г) полиэстер гель - е) гранулоциты - е) красные кровяные клетки (рис. 1).
- Сбор фракция плазменного слоя, делая 5 до 10 мм плазмы выше интерфазе, не нарушая слой клеток. Плазма может быть использована для культуры (раздел 2.5).
- Урожай фракции, обогащенной (МКПК) на межфазной с пипеткой и трансфер в 15 мл коническую трубку.
- Вымойте РВМС с 10 мл фосфатно-солевом буфере (PBS), обращая трубки 5 раз, а затем центрифуги в течение 5 мин при 400 х г.
- Повторите промывание шаги в два раза, а затем ресуспендируют осадок клеток в 5 мл PBS. Определить число клеток. Обычно 1,3 x10 6 клеток выделяют из 1 мл цельной крови.
- Определить частоту и фенотип γδ Т-клеток в РВМС методом проточной цитометрии (раздел 3) (рис. 2).
2. Расширение γδ Т-клеток
- Центрифуга клеточные суспензии в 15 мл конические пробирки в течение 5 мин при 400 х г при комнатной температуре, и отбросить супернатанты.
- Подготовка питательной среды (СМ), добавив человеческого ИЛ-2 (IL-2) и золедронат (Зомета) до конечной концентрации 1000 МЕ / мл и 5 мкМ, соответственно. ALyS203 (Cell науки и технологический институт) или OpTmizer (Invitrogen) средства массовой информации поддерживать хорошие расширения γδ Т-клеток (более подробная информация в ссылках 6 и 9). Зомета содержится в жидком виде (4 мг/5мл флакон). Для подготовки 5 мкМ раствор, добавьте 50 мкл Zometa до 30 мл питательной среды.
- Ресуспендируют осадок клеток в культуральной среде и приспосабливаться к 1х10 6 кл / мл.
- Внесите 1 мл CM содержащей 1x10 6 клеток в каждую лунку 24-луночного планшета. Для крупных культурах, клетки могут быть посеяны на уровне 0,5 х 10 6 клеток / см 2 в зависимости от площади поверхности пластины скважин, блюдо, или колбу.
- Добавить аутологичной плазмы (раздел 1.3), объединенных человека АВ сывороток, или ФТС, так что это примерно 10% от объема культура (100 мкл на каждую лунку 24-луночного планшета). Место пластин в увлажненных 37 ° С, 5% СО 2 инкубатора в течение 24-48 часов.
- Поддержание культуры на плотность клеток 0.5-2 х 10 6 клеток / мл. Добавьте свежую среду, содержащую человеческий IL-2 (1000 МЕ / мл) только (без Зомета) каждые 2-3 дня, и передача культивируемых клеток в новые скважины или колбы в случае необходимости, в зависимости от степени пролиферации клеток (рис. 3). Поставка плазме или сыворотке в среду, так что концентрация сывороточного может поддерживаться не менее 1%.
- Урожай клеток на 12-14 день и определить частоту, фенотип, и функции γδ Т-клеток с помощью проточной цитометрии (см. ниже).
3. Фенотипическая анализ с помощью проточной цитометрии
- Передача 200 мкл образцов, содержащих 2 х 10 5 клеток к флуоресценции активированной сортировки клеток (FACS) труб.
- Добавьте 2 мл холодного PBS и центрифуги в течение 5 мин при 400 х г. Затем, ресуспендируют гранул в 50 мкл буфера FACS (PBS + 1% ФТС + 0,1% азид натрия). Добавьте 5 мкл каждого антитела к образцов (моноклональные антитела, приведены в таблице 1).
- Инкубировать на льду в темноте в течение 20 мин.
- Добавить 2 мл FACS буфера для каждого образца, а затем вихрь. Центрифуга образцы в течение 5 мин при 400 х г при 4 ° C. Тщательно слейте супернатант.
- Ресуспендируют клеток в 300 мкл буфера FACS и вихря. Анализ образцов на проточный цитометр (рис. 2).
4. IFN-γ производства анализа 10
- За день до теста, подготовить стимулятор клетки при культивировании 3-5 x10 5 клеток Дауди / мл в RPMI 1640, плюс 10% FCS (RPMI-10) в течение ночи с Зомета (5 мкМ) (далее назначенный Z-Дауди).
- Сбор Z-Дауди и ресуспендируют в RPMI-10 на 2x10 6 клеток / мл. Добавить 100 мкл Z-Дауди (2х10 5) в каждую лунку с круглым дном 96-луночный планшет.
- Подготовка γδ Т-клеток на 2х10 6 клеток / мл в RPMI-10 содержащие Brefeldin при 20 мкг / мл. Передача 100 мкл γδ Т-клеточной суспензии (2x10 5) в каждую лунку содержащих Z-Дауди клетки или для контроля скважин (100 мкл RPMI-10 только, или RPMI-10 с 20 нг / мл форбол 12-миристат-13-ацетат[PMA] плюс 2 мкг / мл иономицина).
- Смешать с помощью пипетки вверх и вниз несколько раз. Инкубируйте в течение 4 часов при 37 ° C, 5% СО 2 инкубатора.
- Центрифуга пластине в течение 5 мин при 400 х г при 4 ° С и ресуспендируйте гранул в 200 мкл холодного PBS.
- Передача образцов FACS труб. Добавьте 4 мл холодного PBS и центрифуги трубы в течение 5 мин при 400 х г при 4 ° C.
- Ресуспендируют гранул в 50 мкл FACS буфера с FITC-сопряженных анти-TCRVγ9 (5 мкл) и PE/Cy5-conjugated анти-CD3 мАт (2,5 мкл). Инкубируйте защищенном от света месте в течение 15 мин при комнатной температуре.
- Добавить 100 мкл IntraPrep реагента 1 и инкубировать в течение 15 мин при комнатной температуре. Добавить 4 мл PBS в каждую пробирку и центрифуги в течение 5 мин при 400 х г при комнатной температуре.
- Удалить супернатант аспирацией и добавьте 100 мкл реагента 2 IntraPrep. Инкубировать в течение 5 минут при комнатной температуре без встряхивания.
- Добавьте 5 мкл PE-сопряженных анти-IFN-γ МКА к пробирке. Инкубируйте защищенном от света месте в течение 15 мин при комнатной температуре.
- Добавить 4 мл PBS в каждую пробирку и центрифуги в течение 5 мин при 400 х г при комнатной температуре. Удалить супернатант аспирацией и ресуспендируют осадок клеток в 0,5 мл буфера FACS.
- Анализ клеток потока цитометр. Ворота на CD3 + TCRVγ9 + клеток и изучение экспрессии IFN-γ (рис. 4).
5. Представитель Результаты:
Важно, чтобы определить процент γδ Т-клеток в РВМС на начало культуры. Как показано на рис. 2, процент CD3 + + TCRVγ9 γδ Т-клеток в РВМС составил 1,6% в день 0. Доминирующей популяции CD27 + CD45RA + наивным или CD27 + CD45RA - центральный фенотипы памяти. Когда γδ Т-клеток были эффективно стимулировали, они образовали кластеры в дни 3-5 (рис. 3, Б). Когда формирования кластера было отложено, рост других типов клеток, такие как CD4 + или CD8 + Т-клеток αβ или NK клетки могут доминировать рост γδ Т-клеток (рис. 3 C и D). После 14 дней культивирования частота γδ Т-клеток увеличилось до более чем 93,8% из культивируемых клеток успешно γδ Т клеточных культурах (рис. 2 E). Культурный γδ Т-клетки upregulated NKG2D и CD69 выражении (рис. 2 G и Н). Они проявили CD27 - CD45RA - эффектор фенотип памяти (рис. 2 F). Функции γδ Т-клеток были оценены в отношении продукции цитокинов и цитотоксичность. Внутриклеточного IFN-γ окрашивание показало, что γδ Т-клеток производится IFN-γ в ответ на PMA / иономицина лечения или Z-Дауди клетки, которые накопились после лечения ИПП золедронат (рис. 4). Эти результаты показывают, что золедронат может эффективно стимулировать и расширения функциональных γδ Т-клеток.
| трубка | FITC | PE | ECD | PE/Cy5 |
| 1 | CD3 | CD19 | CD45 | CD14 |
| 2 | CD3 | TCRαβ | CD4 | CD8 |
| 3 | CD3 | CD56 | ||
| 4 | TCR Vγ9 | TCRαβ | CD45 | CD3 |
| 5 | TCR Vγ9 | NKG2D | ||
| 6 | TCR Vγ9 | CD69 | ||
| 7 | TCR Vγ9 | IgG1 мыши | ||
| 8 | TCR Vγ9 | CD45RA | CD27 | |
| 9 | TCR Vγ9 | IgG1 мыши | IgG1 мыши |
Таблица 1. Моноклональные антитела, используемые в многоцветном окрашивании γδ Т-клеток. Примером фенотипического анализа γδ Т-клеток производится в нашей лаборатории показано на рис. 2.
Рисунок 1. Разделение РВМС. Кровь (7,5-8,0 мл) втягивается в BD Vacutainer КПП сотовый Подготовка труб с гепарином натрия и непосредственно центрифугировали в течение 20 мин при 1800 х г. После центрифугирования в результате слои, как показано сверху боttom:) Плазма - б) РВМС и тромбоцитов - с) Плотность раствора - г) полиэстер гель - е) гранулоцитов - е) красных кровяных телец.
Рисунок 2. Типичный фенотип поверхности γδ Т-клеток. РВМС стимулировали золедронат и ИЛ-2 в течение 14 дней. Клетки окрашивали FITC-меченого анти-TCR Vγ9 и PE/Cy5-labeled анти-CD3 контролировать расширение γδ Т-клеток (и Е). γδ Т-клетки были идентифицированы по их выражению TCRVγ9, и их выражение CD27 и CD45RA (B и F), NKG2D (С и G), или CD69 (D и H) был рассмотрен.
Рисунок 3. Представителю γδ культур Т-клеток. РВМС стимулировали ИЛ-2 (1000 МЕ / мл) и золедронат (5 мкМ). Представитель поля показано на рисунке (IX71 инвертированного микроскопа [Olympus] х 200). Кластеры и агрегатов γδ Т-клеток может наблюдаться на 3 день (А) и 5-й день (B), когда γδ Т-клетки были успешно расширены. В отличие от этого, нет кластеров или агрегатов наблюдались при γδ Т-клеток рост не был адекватным (С и D).
Рисунок 4. IFN-γ производства. γδ Т-клетки инкубировали с RPMI-10 только () или PMA / иономицина (В) или Z-Дауди (C) в течение 4 часов. Во-первых, поверхность выражение TCRVγ9 окрашивали и IFN-γ производства был рассмотрен внутриклеточного IFN-γ окрашивание.
Рисунок 5. Кинетика γδ культуре Т-клеток. (А) Абсолютное число культивируемых клеток, (B) процент γδ Т-клеток, и (C) абсолютное число Т-клеток γδ в указанных точках времени.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Метод, представленный здесь обеспечивает эффективное расширение γδ Т-клетки из РВМС. γδ Т-клетки активируются и расширена золедронат и ИЛ-2 разработки полного эффекторные функции, отражается производство цитокинов и цитотоксичность. Было сообщено, что синтетические bromohydrin phosphoantigens пирофосфат (BrHPP) и 2-метил-3-бутенил-1-пирофосфат (2M3B1PP) также расширить γδ Т-клеток, однако они не являются коммерчески доступными. В противоположность этому, золедронат уже лицензирована для клинического применения в качестве Зомета. Таким образом, надежный реагент легко доступен.
Выбор питательных сред и сыворотки имеет решающее значение. Используйте соответствующие средства массовой информации, таких как культура ALyS203 (Cell науки и технологический институт) или OpTmizer (Invitrogen) для успешного расширения γδ Т клетки. 11 Убедитесь, что аутологичной плазмы, объединенных человека АВ сыворотки или FCS может поддерживать γδ Т клеточной культуры. Также помните, что РВМС от некоторых доноров не реагируют на стимуляцию золедронат независимо от других реагентов культуры. Если это произойдет, то единственным вариантом является изменение донора.
Как мы уже показали, обогащение γδ Т-клеток был достигнут сравнительно рано, почти 80% культивируемых клеток были γδ Т-клеток, днем 7. γδ Т-клетки продолжали размножаться до 12-14 дней (рис. 5). Примерно 2,2 х 10 8 γδ Т-клетки могут быть получены из 1 х 10 6
РВМС содержащего 1,6 х 10 4 γδ Т-клеток. Эта культура метод был использован в первой фазы клинических испытаний и оценки безопасности и целесообразности Zoledronate расширенной γδ Т терапии передачи клетка у пациентов с множественной миеломой или рак легких. 12,13
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Нет конфликта интересов объявлены.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| ZOMETA | Novartis AG | zoledronate | |
| PROLEUKIN | Novartis AG | human recombinant IL-2 | |
| BD Vacutainer CPT Cell Preparation Tube with Sodium Heparin | BD Biosciences | 362753 | |
| RPMI1640 | Invitrogen | 21870-076 | |
| ALyS203- medium | Cell Science & Technology Institute | 0301-7 | |
| OpTmizer | Invitrogen | 0080022SA | |
| brefeldin A | Sigma-Aldrich | B5936-200UL | |
| phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA) | Sigma-Aldrich | P1585-1MG | |
| ionomycin | Sigma-Aldrich | 13909-1ML | |
| IntraPrep | Beckman Coulter Inc. | A07803 | |
| anti-human CD3-FITC or PE/Cy5 | Beckman Coulter Inc. | A07746 FITC A07749 PE/Cy5 | |
| anti-human CD4-ECD | Beckman Coulter Inc. | 6604727 | |
| anti-human CD8-PE/Cy5 | Beckman Coulter Inc. | 6607011 | |
| anti-human CD14-PE/Cy5 | Beckman Coulter Inc. | A07765 | |
| anti-human CD19-PE | Beckman Coulter Inc. | A07769 | |
| anti-human CD45-ECD | Beckman Coulter Inc. | A07784 | |
| anti-human CD56-PE/Cy5 | Beckman Coulter Inc. | A07789 | |
| anti-human TCRαβ-PE | Beckman Coulter Inc. | A39499 | |
| anti-human TCR Vγ9-FITC | Beckman Coulter Inc. | IM1463 | |
| anti-human CD27-PE/Cy5 | Beckman Coulter Inc. | 6607107 | |
| anti-human CD45RA-ECD | Beckman Coulter Inc. | IM2711 | |
| anti-human CD69-PE | BD Biosciences | 555531 | |
| anti-human NKG2D-PE | Beckman Coulter Inc. | A08934 | |
| Anti-humal IFNγ-PE | Beckman Coulter Inc. | IM2717U | |
| Mouse IgG1 isotype control-PE | Beckman Coulter Inc. | A07796 | |
| Mouse IgG1 isotype control-ECD or PE/Cy5 | Beckman Coulter Inc. | A07797A07798 |
References
- Bonneville, M., O'Brien, R. L., Born, W. K. γ T cell effector functions: a blend of innate programming and acquired plasticity. Nat Rev Immunol. 10, 467-478 (2010).
- Hintz, M. Identification of (E)-4-hydroxy-3-methyl-but-2-enyl pyrophosphate as a major activator for human γδ T cells in Escherichia coli. FEBS Lett. 509, 317-322 (2001).
- Gober, H. J. Human T cell receptor γδ cells recognize endogenous mevalonate metabolites in tumor cells. J Exp Med. 197, 163-168 (2003).
- Kabelitz, D., Wesch, D., He, W. Perspectives of gammadelta T cells in tumor immunology. Cancer Res. 67, 5-8 (2007).
- Roelofs, A. J. Peripheral blood monocytes are responsible for gammadelta T cell activation induced by zoledronic acid through accumulation of IPP/DMAPP. Br J Haematol. 144, 245-250 (2009).
- Dieli, F. Induction of γδ T-lymphocyte effector functions by bisphosphonate zoledronic acid in cancer patients in vivo. Blood. 102, 2310-2311 (2003).
- Kondo, M. Zoledronate facilitates large-scale ex vivo expansion of functional γδ T cells from cancer patients for use in adoptive immunotherapy. Cytotherapy. 10, 842-856 (2008).
- Espinosa, E. Chemical synthesis and biological activity of bromohydrin pyrophosphate, a potent stimulator of human γδ T cells. J Biol Chem. 276, 18337-18344 (2001).
- Kobayashi, H. Safety profile and anti-tumor effects of adoptive immunotherapy using γδ T cells against advanced renal cell carcinoma: a pilot study. Cancer Immunol Immunother. 56, 469-476 (2007).
- Murali-Krishna, K. Counting antigen-specific CD8 T cells: a reevaluation of bystander activation during viral infection. Immunity. 8, 177-187 (1998).
- Sato, K. Impact of culture medium on the expansion of T cells for immunotherapy. Cytotherapy. 11, 936-946 (2009).
- Abe, Y. Clinical and immunological evaluation of zoledronate-activated Vγ9 γδT-cell-based immunotherapy for patients with multiple myeloma. Exp Hematol. 37, 956-968 (2009).
- Nakajima, J. A phase I study of adoptive immunotherapy for recurrent non-small-cell lung cancer patients with autologous γδ T cells. Eur J Cardiothorac Surg. 37, 1191-1197 (2010).
