Summary
Un metodo per espandere γδ cellule T dalle cellule mononucleate del sangue periferico (PBMC) è descritta. PBMC cellule derivate γδ T vengono stimolati e ampliati con zoledronato e interleuchina-2 (IL-2). L'espansione su larga scala di γδ cellule T possono essere applicate a autologo immunoterapia cellulare del cancro.
Abstract
Γδ cellule T in grado di riconoscere e rispondere a una vasta gamma di antigeni indotta da stress, sviluppando in tal modo innato attività ampio anti-tumorale e anti-infettivi. 1 La maggior parte dei γδ cellule T nel sangue periferico hanno il recettore delle cellule T Vγ9Vδ2. Queste cellule riconoscono l'antigene in un complesso maggiore di istocompatibilità modalità indipendente e sviluppare una forte funzioni citolitica e Th1-come effettore. 1 Perciò, γδ cellule T sono cellule effettrici candidato attraente per l'immunoterapia del cancro. Vγ9Vδ2 cellule T rispondere a phosphoantigens come (E)-4-idrossi-3-metil-but-2-enil pirofosfato (HMBPP), che è sintetizzata nei batteri attraverso isoprenoidi biosintesi, 2 e isopentenil pirofosfato (IPP), che viene prodotto nelle cellule eucariotiche attraverso la via mevalonato. 3 In condizioni fisiologiche, la generazione di IPP nella cella nontransformed non è sufficiente per l'attivazione delle cellule T γδ. Disregolazione della via mevalonato nelle cellule tumorali porta all'accumulo di IPP e l'attivazione delle cellule T γδ. 3 Poiché aminobifosfonati (come pamidronato o zoledronato) inibiscono la farnesil pirofosfato sintasi (FPP), l'enzima agisce a valle di IPP nella via mevalonato, i livelli intracellulari di IPP e sensitibity γδ per il riconoscimento delle cellule T possono essere terapeuticamente aumentato di aminobifosfonati. IPP accumulo è meno efficiente in cellule nontransfomred rispetto alle cellule tumorali con una concentrazione farmacologicamente rilevanti aminobifosfonati, che ci permettono l'immunoterapia per il cancro attivando γδ cellule T con aminobifosfonati 4. Interessante, IPP si accumula nei monociti quando PBMC sono trattati con aminobifosfonati, a causa di efficienti assunzione di droghe da queste cellule 5. monociti che si accumulano IPP diventare cellule presentanti l'antigene e stimolare Vγ9Vδ2 cellule T nel sangue periferico. 6 Sulla base di questi meccanismi, abbiamo sviluppato una tecnica per la grande espansione del γδ colture di cellule T con zoledronato e interleuchina -2 (IL-2). 7 Altri metodi per l'espansione delle cellule T γδ utilizzare il sintetico pirofosfato bromohydrin phosphoantigens (BrHPP) 8 o 2-metil-3-butenyl-1-pirofosfato (2M3B1PP) 9. Tutti questi metodi consentono ex vivo di espansione, con conseguente gran numero di γδ cellule T per l'uso in immunoterapia adottiva. Tuttavia, solo zoledronato è un reagente approvato dalla FDA disponibili in commercio. Zoledronato espanso γδ cellule T CD27 schermo - CD45RA - fenotipo effettore memoria e la loro funzione può essere valutata da IFN-γ test di produzione 7.
Protocol
1. Isolamento dei PBMC
- Prelievo di sangue (7,5-8,0 ml) in una provetta BD Preparazione Vacutainer cella CPT con eparina di sodio. Il tubo contiene un anticoagulante eparina sodica e di un Ficoll-Hypaque densità del fluido, più una barriera di gel di poliestere, che separa i due liquidi. Centrifuga tubo / campione di sangue a temperatura ambiente (18 ° C a 25 ° C) in un rotore orizzontale (swing-out testa) per 20 minuti a 1800 x g. Interruttore centrifuga freni sbloccati.
- Dopo la centrifugazione, la sequenza di strati avviene nel seguente modo (visto dall'alto verso il basso): a) al plasma - b) le cellule mononucleate del sangue periferico (PBMC) e piastrine - c) soluzione di densità - d) gel poliestere - e) granulociti - f) globuli rossi (Fig. 1).
- Raccolgono una frazione dello strato di plasma, lasciando 5 a 10 mm di plasma al di sopra della interfase senza disturbare lo strato di cellule. Il plasma può essere utilizzato per la cultura (sezione 2.5).
- Raccolta della frazione arricchita (PBMC) presso l'interfase con una pipetta e trasferirli in un tubo da 15 ml.
- Lavare i PBMC con 10 ml di soluzione salina tampone fosfato (PBS), invertendo il tubo di 5 volte, quindi si centrifuga per 5 min a 400 x g.
- Ripetere le fasi di lavaggio due volte, quindi risospendere il pellet cellulare in 5 ml di PBS. Determinare il numero delle cellule. Di solito 1,3 x10 6 celle vengono recuperati da 1 ml di sangue intero.
- Determinare la frequenza e il fenotipo delle cellule T in γδ PBMC mediante citometria di flusso (sezione 3) (Fig. 2).
2. Espansione di cellule T γδ
- Centrifuga sospensioni cellulari in provette da 15 ml conica per 5 min a 400 x g a temperatura ambiente, ed eliminare il surnatante.
- Preparare terreno di coltura (CM) con l'aggiunta di IL-2 (IL-2) e zoledronato (Zometa) a concentrazioni finali di 1000 UI / ml e 5 mM, rispettivamente. ALyS203 (Cell Science & Technology Institute) o OpTmizer (Invitrogen) supportare l'espansione dei media buona γδ cellule T (maggiori informazioni nei riferimenti 6 e 9). Zometa è fornito in forma liquida (4 fiala mg/5-ml). Per preparare una soluzione al 5 mM, aggiungere 50 ml di Zometa a 30 ml di terreno di coltura.
- Risospendere il pellet di cellule in terreno di coltura e regolare a 1x10 6 cellule / ml.
- Pipettare 1 ml di CM contenente 1x10 6 cellule in ciascun pozzetto di una 24-pozzetti. Per le grandi culture, le cellule possono essere seminati a 0,5 x 10 6 cellule / cm 2 secondo le superfici dei pozzi piatto, piatto, o borraccia.
- Aggiungi plasma autologo (sezione 1.3), pool umano AB sieri, o FCS in modo che sia circa il 10% del volume della cultura (100 microlitri per ciascun pozzetto di una piastra da 24 pozzetti). Posizionare le piastre in un umidificata 37 ° C, 5% CO 2 incubatore per 24-48 ore.
- Mantenere la coltura ad una densità cellulare di 0,5-2 x 10 6 cellule / ml. Aggiungi terreno fresco contenente umano IL-2 (1000 UI / ml) (senza Zometa) ogni 2-3 giorni, e trasferire cellule coltivate in nuovi pozzi o fiaschi, se necessario, a seconda del grado di proliferazione cellulare (Fig. 3). Fornitura plasma o siero al mezzo in modo che la concentrazione sierica può essere mantenuto almeno l'1%.
- Celle di raccolta il giorno 12-14 e determinare la, fenotipo frequenza, e le funzioni del γδ cellule T mediante citometria di flusso (vedi sotto).
3. L'analisi fenotipica mediante citometria di flusso
- Trasferire 200 campioni microlitri contenente 2 x 10 5 cellule a fluorescenza-attivato cell sorting (FACS) tubi.
- Aggiungere 2 ml di PBS freddo e centrifugare per 5 min a 400 x gr. Poi, risospendere il pellet in 50 microlitri di buffer FACS (PBS + 1% di sodio azide FCS + 0,1%). Aggiungere 5 ml di ciascuna anticorpi ai campioni (gli anticorpi monoclonali sono elencati nella Tabella 1).
- Incubare in ghiaccio al buio per 20 min.
- Aggiungere 2 ml di tampone FACS per ogni campione, e poi vortice. Campioni Centrifugare per 5 min a 400 x g a 4 ° C. Con attenzione decantare il surnatante.
- Risospendere le cellule in 300 microlitri di buffer FACS e vortice. Analizzare campioni su un citofluorimetro (Fig. 2).
4. IFN-γ saggio produzione 10
- Il giorno prima del test, preparare le cellule stimolatore di coltura 3-5 x10 Daudi 5 cellule / ml in RPMI 1640 medium più 10% FCS (RPMI-10) durante la notte con Zometa (5 mM) (nel seguito denominati Z-Daudi).
- Raccogliere Z-Daudi e risospendere in RPMI-10 a 2x10 6 cellule / ml. Aggiungere 100 ml di Z-Daudi (2x10 5) a ciascun pozzetto di una piastra a fondo rotondo da 96 pozzetti.
- Preparare γδ cellule T a 2x10 6 cellule / ml in RPMI-10 contenente Brefeldin A a 20 mg / ml. Trasferire 100 ml di γδ sospensione cellulare T (2x10 5) in ciascun pozzetto contenente Z-Daudi cellule o di pozzetti di controllo (100 ml di RPMI-10 solo, o RPMI-10 con 20 ng / ml di forbolo miristato 12-13-acetato[PMA] e 2 mg / ml di ionomicina).
- Mescolare pipettando su e giù parecchie volte. Incubare per 4 ore a 37 ° C, 5% CO 2 incubatore.
- Centrifugare la piastra per 5 minuti a 400 x g a 4 ° C e risospendere il pellet in 200 ml di PBS freddo.
- Trasferire i campioni di tubi FACS. Aggiungere 4 ml di PBS freddo e centrifugare le provette per 5 min a 400 x g a 4 ° C.
- Risospendere il pellet in 50 ml di buffer di FACS con FITC-coniugato anti-TCRVγ9 (5 mL) e PE/Cy5-conjugated anti-CD3 (2,5 microlitri). Incubare al riparo dalla luce per 15 minuti a temperatura ambiente.
- Aggiungere 100 ml di reagente IntraPrep 1 e incubare per 15 minuti a temperatura ambiente. Aggiungere 4 ml di PBS in ogni provetta e centrifugare per 5 min a 400 x g a temperatura ambiente.
- Eliminare il surnatante tramite aspirazione e aggiungere 100 ml di reagente 2 IntraPrep. Incubare per 5 minuti a temperatura ambiente senza agitazione.
- Aggiungere 5 ml di PE-coniugato anti-IFN-γ mAb alla provetta. Incubare al riparo dalla luce per 15 minuti a temperatura ambiente.
- Aggiungere 4 ml di PBS in ogni provetta e centrifugare per 5 min a 400 x g a temperatura ambiente. Eliminare il surnatante tramite aspirazione e risospendere il pellet cellulare in 0,5 ml di tampone FACS.
- Analizzare le cellule citofluorimetro. Porta il CD3 + + TCRVγ9 cellule ed esaminare l'espressione di IFN-γ (Fig. 4).
5. Rappresentante dei risultati:
E 'importante per determinare la percentuale di cellule T nel γδ PBMC all'inizio della cultura. Come mostrato in fig. 2 A, la percentuale dei CD3 + + TCRVγ9 γδ cellule T in PBMC è stata di 1,6% al giorno 0. Le popolazioni dominanti erano CD45RA + CD27 + CD27 + ingenuo o CD45RA - fenotipi memoria centrale. Quando γδ cellule T sono stati stimolati in modo efficiente, hanno formato grappoli nei giorni 3-5 (Fig. 3 A e B). Quando la formazione di cluster è stato ritardato, la crescita di altri tipi cellulari, quali CD4 + e CD8 + cellule T αβ o cellule NK potrebbe dominare la crescita di γδ cellule T (fig. 3 C e D). Dopo 14 giorni di cultura, la frequenza di cellule T γδ aumentato a oltre il 93,8% delle cellule coltivate in successo culture γδ cellule T (Fig. 2 E). Le colture di cellule T γδ upregulated NKG2D e CD69 espressione (fig. 2 G e H). Hanno mostrato CD27 - CD45RA - fenotipo memoria effettore (Fig. 2 F). Le funzioni di γδ cellule T sono stati valutati per quanto riguarda la produzione di citochine e citotossicità. L'IFN-γ intracellulare colorazione γδ dimostrato che le cellule T prodotte IFN-γ in risposta alla PMA / ionomicina trattamento o Z-Daudi cellule che IPP accumulato dopo il trattamento con zoledronato (Fig. 4). Questi risultati indicano che zoledronato può efficacemente stimolare e ampliare funzionale delle cellule T γδ.
| tubo | FITC | PE | ECD | PE/Cy5 |
| 1 | CD3 | CD19 | CD45 | CD14 |
| 2 | CD3 | TCRαβ | CD4 | CD8 |
| 3 | CD3 | CD56 | ||
| 4 | TCR Vγ9 | TCRαβ | CD45 | CD3 |
| 5 | TCR Vγ9 | NKG2D | ||
| 6 | TCR Vγ9 | CD69 | ||
| 7 | TCR Vγ9 | del mouse IgG1 | ||
| 8 | TCR Vγ9 | CD45RA | CD27 | |
| 9 | TCR Vγ9 | del mouse IgG1 | del mouse IgG1 |
Tabella 1. Anticorpi monoclonali utilizzati in colorazione multicolore delle cellule T γδ. Un esempio di analisi fenotipica di cellule T γδ eseguiti nel nostro laboratorio è mostrato in fig. 2.
Figura 1. Separazione dei PBMC. Sangue (7,5-8,0 ml) è disegnato in un tubo BD Preparazione Vacutainer cella CPT con eparina di sodio e direttamente centrifugati per 20 min a 1800 x g. Dopo la centrifugazione, gli strati risultante come si è visto da cima a bottom: a) al plasma - b) PBMC e piastrine - c) soluzione di densità - d) gel poliestere - e) Granulociti - f) i globuli rossi.
Figura 2. Fenotipo superficie tipica delle cellule T γδ. PBMC sono stati stimolati con zoledronato e IL-2 per 14 giorni. Le cellule sono state colorate con FITC anti-TCR Vγ9 e PE/Cy5-labeled anti-CD3 di monitorare l'espansione della γδ cellule T (A ed E). γδ cellule T sono stati identificati dalla loro espressione di TCRVγ9, e la loro espressione di CD27 e CD45RA (B e F), NKG2D (C e G), o CD69 (D e H) è stata esaminata.
Figura 3. Rappresentante γδ colture di cellule T. PBMC sono stati stimolati con IL-2 (1000 UI / ml) e zoledronato (5 mM). Campi rappresentativi sono visibili (IX71 microscopio invertito [Olympus] x 200). Cluster e aggregati di cellule T γδ può essere osservato il giorno 3 (A) e il giorno 5 (B), quando γδ cellule T sono state espanse con successo. Al contrario, nessun cluster o aggregati sono stati osservati quando γδ crescita delle cellule T non era adeguata (C e D).
Figura 4. IFN-γ produzione. γδ cellule T sono state incubate con RPMI-10 solo (A) o PMA / ionomicina (B) o Z-Daudi (C) per 4 ore. In primo luogo, espressione di superficie di TCRVγ9 era macchiato e poi IFN-γ produzione è stata esaminata dal intracellulare IFN-γ colorazione.
Figura 5. Cinetica di γδ colture cellulari T. (A) il numero assoluto di cellule in coltura, (B) percentuale di γδ cellule T, e (C) numero assoluto di γδ cellule T nei punti di tempo indicato.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Il metodo presentato qui permette l'espansione delle cellule T efficiente γδ da PBMC. γδ cellule T attivate e ampliato da zoledronato e IL-2 sviluppano completa funzioni effettrici, riflessa dalla produzione di citochine e citotossicità. E 'stato riportato che il sintetico phosphoantigens pirofosfato bromohydrin (BrHPP) e 2-metil-3-butenyl-1-pirofosfato (2M3B1PP) anche espandere le cellule T γδ, tuttavia, non sono disponibili in commercio. Al contrario, zoledronato è già concesso in licenza per le applicazioni cliniche di Zometa. Pertanto, un reagente affidabile è facilmente disponibile.
La selezione dei terreni di coltura e siero è critica. Utilizzare terreni di coltura appropriati come ALyS203 (Cell Science & Technology Institute) o OpTmizer (Invitrogen) per il successo di espansione delle cellule T γδ. 11 Verificare che il plasma autologo, pool umano AB sieri o FCS in grado di supportare γδ cultura T cellulare. Ricordate anche che PBMC da alcuni donatori non rispondono alla stimolazione zoledronato indipendentemente reagenti altra cultura. Se ciò accade, l'unica opzione è quella di cambiare il donatore.
Come abbiamo dimostrato, l'arricchimento di γδ cellule T è stato raggiunto relativamente presto, quasi l'80% delle cellule in coltura sono state γδ cellule T di giorno 7. γδ cellule T hanno continuato a proliferare fino a 12-14 giorni (Fig. 5). Circa 2,2 x 10 8 cellule γδ T può essere ottenuto da 1 x 10 6
PBMC contenente 1,6 x 10 4 γδ cellule T. Questo metodo di coltura è stato utilizzato in fase I trial clinici che hanno valutato la sicurezza e la fattibilità di Zoledronato espanso terapia γδ trasferimento delle cellule T nei pazienti con mieloma multiplo o cancro ai polmoni. 12,13
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Nessun conflitto di interessi dichiarati.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| ZOMETA | Novartis AG | zoledronate | |
| PROLEUKIN | Novartis AG | human recombinant IL-2 | |
| BD Vacutainer CPT Cell Preparation Tube with Sodium Heparin | BD Biosciences | 362753 | |
| RPMI1640 | Invitrogen | 21870-076 | |
| ALyS203- medium | Cell Science & Technology Institute | 0301-7 | |
| OpTmizer | Invitrogen | 0080022SA | |
| brefeldin A | Sigma-Aldrich | B5936-200UL | |
| phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA) | Sigma-Aldrich | P1585-1MG | |
| ionomycin | Sigma-Aldrich | 13909-1ML | |
| IntraPrep | Beckman Coulter Inc. | A07803 | |
| anti-human CD3-FITC or PE/Cy5 | Beckman Coulter Inc. | A07746 FITC A07749 PE/Cy5 | |
| anti-human CD4-ECD | Beckman Coulter Inc. | 6604727 | |
| anti-human CD8-PE/Cy5 | Beckman Coulter Inc. | 6607011 | |
| anti-human CD14-PE/Cy5 | Beckman Coulter Inc. | A07765 | |
| anti-human CD19-PE | Beckman Coulter Inc. | A07769 | |
| anti-human CD45-ECD | Beckman Coulter Inc. | A07784 | |
| anti-human CD56-PE/Cy5 | Beckman Coulter Inc. | A07789 | |
| anti-human TCRαβ-PE | Beckman Coulter Inc. | A39499 | |
| anti-human TCR Vγ9-FITC | Beckman Coulter Inc. | IM1463 | |
| anti-human CD27-PE/Cy5 | Beckman Coulter Inc. | 6607107 | |
| anti-human CD45RA-ECD | Beckman Coulter Inc. | IM2711 | |
| anti-human CD69-PE | BD Biosciences | 555531 | |
| anti-human NKG2D-PE | Beckman Coulter Inc. | A08934 | |
| Anti-humal IFNγ-PE | Beckman Coulter Inc. | IM2717U | |
| Mouse IgG1 isotype control-PE | Beckman Coulter Inc. | A07796 | |
| Mouse IgG1 isotype control-ECD or PE/Cy5 | Beckman Coulter Inc. | A07797A07798 |
References
- Bonneville, M., O'Brien, R. L., Born, W. K. γ T cell effector functions: a blend of innate programming and acquired plasticity. Nat Rev Immunol. 10, 467-478 (2010).
- Hintz, M. Identification of (E)-4-hydroxy-3-methyl-but-2-enyl pyrophosphate as a major activator for human γδ T cells in Escherichia coli. FEBS Lett. 509, 317-322 (2001).
- Gober, H. J. Human T cell receptor γδ cells recognize endogenous mevalonate metabolites in tumor cells. J Exp Med. 197, 163-168 (2003).
- Kabelitz, D., Wesch, D., He, W. Perspectives of gammadelta T cells in tumor immunology. Cancer Res. 67, 5-8 (2007).
- Roelofs, A. J. Peripheral blood monocytes are responsible for gammadelta T cell activation induced by zoledronic acid through accumulation of IPP/DMAPP. Br J Haematol. 144, 245-250 (2009).
- Dieli, F. Induction of γδ T-lymphocyte effector functions by bisphosphonate zoledronic acid in cancer patients in vivo. Blood. 102, 2310-2311 (2003).
- Kondo, M. Zoledronate facilitates large-scale ex vivo expansion of functional γδ T cells from cancer patients for use in adoptive immunotherapy. Cytotherapy. 10, 842-856 (2008).
- Espinosa, E. Chemical synthesis and biological activity of bromohydrin pyrophosphate, a potent stimulator of human γδ T cells. J Biol Chem. 276, 18337-18344 (2001).
- Kobayashi, H. Safety profile and anti-tumor effects of adoptive immunotherapy using γδ T cells against advanced renal cell carcinoma: a pilot study. Cancer Immunol Immunother. 56, 469-476 (2007).
- Murali-Krishna, K. Counting antigen-specific CD8 T cells: a reevaluation of bystander activation during viral infection. Immunity. 8, 177-187 (1998).
- Sato, K. Impact of culture medium on the expansion of T cells for immunotherapy. Cytotherapy. 11, 936-946 (2009).
- Abe, Y. Clinical and immunological evaluation of zoledronate-activated Vγ9 γδT-cell-based immunotherapy for patients with multiple myeloma. Exp Hematol. 37, 956-968 (2009).
- Nakajima, J. A phase I study of adoptive immunotherapy for recurrent non-small-cell lung cancer patients with autologous γδ T cells. Eur J Cardiothorac Surg. 37, 1191-1197 (2010).
