Summary
扩大γδT细胞从外周血单个核细胞（PBMC）的一个方法来描述。外周血单核细胞衍生的γδT细胞受到刺激和扩大使用zoledronate和白细胞介素2（IL - 2）。 γδT细胞的大规模扩张，可应用于自体肿瘤细胞免疫疗法。
Abstract
人类γδT细胞能够识别和响应到多种应激性抗原，从而开发先天广泛的抗肿瘤和抗感染活性。1外周血中大多数γδT细胞的Vγ9Vδ2T细胞受体。这些细胞识别抗原在主要组织相容性复合体独立的方式，并发展强大的杀伤和Th1样的效应功能。因此，γδT细胞是肿瘤免疫治疗的有吸引力的候选人的效应细胞。 Vγ9Vδ2T细胞响应，如phosphoantigens（E）4 -羟基- 3 -甲基- 2 -己烯焦磷酸（HMBPP），这是通过类异戊二烯生物合成的细菌合成;和异戊烯基焦磷酸（IPP），这是生产在真核细胞通过甲羟戊酸途径，在生理条件下 ，3中，IPP的nontransformed细胞的生成是没有足够的γδ T细胞的活化。甲羟戊酸途径在肿瘤细胞失调， 导致3，因为IPP的积累和γδT细胞的活化。aminobisphosphonates（如帕米膦酸或zoledronate）抑制法尼基焦磷酸合成酶（制剂），酶的作用IPP的甲羟戊酸途径下游，细胞内水平IPP和sensitibityγδT细胞识别，可以治疗由aminobisphosphonates增加。 IPP的积累是低效率的nontransfomred细胞比肿瘤细胞，使我们对癌症与aminobisphosphonatesγδT细胞通过激活免疫药理相关浓度的aminobisphosphonates，4有趣的是，IPP的积累在单核细胞的PBMC与aminobisphosphonates治疗，因为高效，这些细胞的药物摄取。积累的IPP成为抗原提呈细胞和Vγ9Vδ2T细胞刺激外周血单核细胞。基于这些机制，我们制定了一个大规模扩张γδT细胞zoledronate文化和白细胞介素的技术-2（IL - 2）7其他方法扩大γδT细胞利用合成phosphoantigens bromohydrin焦（BrHPP）8或2 -甲基-3 -丁烯- 1 -焦磷酸（2M3B1PP）9，所有这些方法允许前体外扩增，γδT细胞过继免疫治疗中使用的大量产生。然而，只有zoledronate是一个FDA批准的市售试剂。 Zoledronate扩大γδT细胞显示CD27 - CD45RA -效应记忆体的表型和它们的功能可以通过干扰素γ的生产检测7评估。
Protocol
1。隔离的PBMC
- 绘制成一个BD真空采血管彩管的细胞与肝素钠的制备管血（7.5-8.0毫升）。管含有钠抗凝和聚蔗糖Hypaque密度流体，加上聚酯凝胶屏障，这两种液体分开。在一个水平旋翼为20分钟1800 × 克 （摇摆头），在室温（18℃至25℃）离心管/血液样本。切换离心机刹车关闭。
- 离心后，层的顺序发生如下（从上到下看到）：一）等离子体 - B）外周血单个核细胞（PBMC）和血小板 - C）密度解决方案 - D）聚酯凝胶 - E），粒细胞 - F）红血细胞（ 图1）。
- 收集的等离子层的一小部分，离开，而不会干扰细胞层的5至10毫米以上相间的血浆。血浆可用于文化（2.5节）。
- 收获丰富的分数（PBMC），用吸管转移到一个15毫升的锥形管相间。
- 洗净用10毫升的外周血单个核细胞的磷酸盐缓冲液（PBS），颠倒离心管5次，然后离心5分钟400 ×克。
- 两次重复洗涤步骤，然后在5毫升的PBS重悬细胞沉淀。确定细胞数量。一般1.3 × 10 6个细胞，恢复从1毫升全血。
- 确定γδT在外周血单个核细胞，通过流式细胞仪（第三部分）（ 图2）的频率和表型。
2。扩大γδT细胞
- 细胞悬浮液15 ml锥形管离心5 min，室温400 X克，丢弃上清液。
- 准备加入人IL - 2（IL - 2）和zoledronate（择泰）1000 IU / ml和5微米的终浓度分别培养基（CM）。 ALyS203（细胞科技职业学院）或OpTmizer（Invitrogen公司）媒体支持γδT细胞（参考文献6日和9的更多信息）良好的扩展。择泰（4 mg/5-ml小瓶）以液态的形式提供。为了准备5微米的解决方案，30毫升培养液中添加50μL择泰。
- 悬浮颗粒细胞在培养液中，并调整到1 × 10 6细胞/ ml 。
- 吸取1毫升含有1 × 10 6个细胞，每孔24孔板的CM。大型文化，细胞可以接种0.5 × 10 6细胞/厘米2，根据板块井，盘，或烧瓶表面积。
- 添加自体血浆（1.3节），汇集人类AB血清，或FCS因此，它是文化的体积（100μL每孔24孔板）的约10％。广场板块，在加湿37℃，5％二氧化碳培养箱中培养24-48小时。
- 保持在0.5-2 × 10 6细胞/ ml的细胞密度的文化。添加新鲜培养基中含有人IL - 2（1000 IU / ml）的（不择泰）每2-3天，并转移到新井或在必要时烧瓶的培养细胞，根据细胞的增殖程度（ 图3） 。供应血浆或血清中的介质，使血药浓度可维持至少1％。
- 每天12-14和确定的频率，表型和γδT的流式细胞仪检测细胞功能（见下文）收获细胞。
3。表型分析流式细胞仪
- 转移200μL的样品含有2 × 10 5细胞荧光激活细胞分选（FACS）管。
- 加入2毫升冷PBS离心5分钟400 × 克 。然后，重新悬浮颗粒在50μL流式细胞仪缓冲液（PBS + 1％FCS + 0.1％的叠氮化钠）。添加5μL的每个抗体样品（ 表1中列出的单克隆抗体）。
- 冰上放置在20分钟的黑暗。
- 每个样品中加入2毫升流式细胞仪缓冲，然后涡。离心机样本为400 × 克在4 ° C 5分钟小心倒出上清液。
- 细胞重悬于300μL流式细胞仪缓冲区和涡流。流式细胞仪（ 图2）分析样品。
4。 IFN -γ的生产检测10
- 检测前一天，准备刺激细胞培养3-5 X10 5 Daudi细胞/ ml的RPMI 1640培养液加10％FCS（RPMI - 10）择泰（5微米）（以下简称指定的Z -达乌迪姆瓦）过夜。
- 在2 × 10 6细胞/ ml，收集在RPMI - 10的Z - Daudi和重悬。加入100μL的Z -达乌迪姆瓦（2X10 5）以及每一个圆底96孔板。
- 准备在2 × 10 6细胞/ ml的RPMI - 10包含在20微克/毫升BrefeldinγδT细胞。转移100μLγδT细胞悬液（2 × 10 5）每孔含有的Z - Daudi细胞或控制井（100μLRPMI - 10，或20毫微克/毫升的佛波醇-12 -肉豆蔻13醋酸RPMI - 10[PMA]加2微克/毫升的离子霉素）。
- 混合移液器向上和向下几次。在37℃，5％CO2培养箱孵育4小时。
- 在4 ° C离心5分钟400 × 克板，并在200μL冷PBS重悬的颗粒。
- 转移的样本，以流式细胞仪管。添加4毫升的冷PBS离心5分钟400 × 克管4 ° C。
- 重悬在50μLFITC标记的抗TCRVγ9（5μL）和PE/Cy5-conjugated抗CD3 mAb（2.5μL）流式细胞仪缓冲颗粒。避光孵育室温为15分钟。
- 加入100μL试剂1 IntraPrep和孵化在室温为15分钟。每管和离心5 min，室温400 X克加入4毫升的PBS。
- 取出吸上清液，加100μLIntraPrep试剂2。为在室温下5分钟孵育无晃动。
- 添加5μLPE标记的抗IFN -γ单克隆抗体的试管。避光孵育室温为15分钟。
- 每管和离心5 min，室温400 X克加入4毫升的PBS。移除吸上清，重悬在0.5毫升流式细胞仪缓冲的细胞沉淀。
- 流式细胞仪分析细胞。门上的CD3 +TCRVγ9+细胞研究干扰素-γ（ 图4）的表达。
5。代表性的成果：
重要的是要确定在启动文化PBMC中γδT细胞百分比。 如图所示。 2，CD3 +TCRVγ9的百分比 +γδT在外周血单个核细胞为1.6％0天。优势种群CD27 + CD45RA +幼稚或CD27 + CD45RA -中央记忆体的表型。 γδT细胞的有效刺激时，便形成了第3-5天的集群（图3 A和 B） 。当集群的形成被推迟，增长的其他类型的细胞，如CD4 +或CD8 +αβT细胞或NK细胞可以主宰的γδT细胞（ 图3 C和D）的生长。经过14天的文化，γδT细胞的频率增加超过93.8％的培养细胞中成功的γδT细胞的文化（图 2五）。培养γδT细胞上调NKG2D及CD69的表达（ 图2 G和H）。他们显示CD27 - CD45RA -效应记忆体的表型（ 图2架F）。 γδT细胞的功能与细胞因子的产生和细胞毒性方面进行了评价。细胞内IFN -γ染色表明，γδT细胞产生的PMA /离子霉素治疗或Z - Daudi细胞中IFN -γ，积累的IPP zoledronate治疗后（ 图4）。这些结果表明，zoledronate可以有效地刺激和扩大功能γδT细胞。
| 管 | FITC标记 | 体育 | 幼儿发展 | PE/Cy5 |
| 1 | CD3 | CD19 | CD45 | CD14的 |
| 2 | CD3 | TCRαβ | CD4 + | CD8 + |
| 3 | CD3 | CD56 | ||
| 4 | TCRVγ9 | TCRαβ | CD45 | CD3 |
| 5 | TCRVγ9 | NKG2D | ||
| 6 | TCRVγ9 | CD69的 | ||
| 7 | TCRVγ9 | 鼠IgG1 | ||
| 8 | TCRVγ9 | CD45RA | CD27 | |
| 9 | TCRVγ9 | 鼠IgG1 | 鼠IgG1 |
表1。多色染色γδT细胞单克隆抗体。在我们的实验室进行的γδT细胞的表型分析的一个例子是如图所示。 2。
图1。PBMC的分离。绘制成一个BD真空采血管彩管的细胞与肝素钠的制备管血（7.5-8.0毫升），直接为20分钟，1800 X克离心。离心后，造成层从顶部博ttom：一）等离子体 - B）外周血单个核细胞和血小板 - C）密度的解决方案 - D）聚酯凝胶 - E），粒细胞 - F）红血细胞。
图2典型的表面γδT细胞表型。 PBMC的刺激zoledronate和IL - 2为14天。细胞染色，用FITC标记的抗- TCRVγ9PE/Cy5-labeled抗CD3监察γδT细胞（A和E）的扩展。 γδT细胞识别他们的表达TCRVγ9，CD27和CD45RA（B型和F），NKG2D的（C和G），或CD69的（D和H）的表达研究。
图3。代表γδT细胞的培养。 PBMC的刺激与IL - 2（1000国际单位/毫升）和zoledronate（5微米）。代表领域（IX71倒置显微镜[奥林巴斯] × 200）。集群和γδT细胞的聚集，可以观察到的第3天（A）和（二）5天，当γδT细胞，成功地扩大了。相比之下，没有集群或聚集γδT细胞的生长观察是不够的（C和D）。
图4。γ-干扰素的生产。 γδT细胞培养，RPMI - 10只（A）或PMA /离子霉素（B）或Z -达乌迪姆瓦（C）为4小时。首先，表面TCRVγ9表达染色，然后IFN -γ的生产是通过细胞内IFN -γ染色检查。
图5。γδT细胞文化的动力学。 （一）培养细胞的绝对数量，（二）γδT细胞，（三）在指定的时间点γδT细胞的绝对数量的百分比。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
这里介绍的方法，使γδT细胞从外周血单个核细胞的有效扩张。 γδT细胞激活，并通过zoledronate扩大和IL - 2制定完整的效应功能，细胞因子的产生和细胞毒性反映。据报道，合成phosphoantigens bromohydrin焦（BrHPP）和2 - 甲基3 - 丁烯-1 - 焦磷酸（2M3B1PP）也扩大γδT细胞，但是，他们不市售。相比之下，zoledronate已经授权作为择泰的临床应用。因此，一个可靠的试剂是容易获得。
培养基和血清的选择是至关重要的。使用ALyS203（细胞科技职业学院）或OpTmizer（Invitrogen）的成功γδT细胞扩张，如适当的培养基。11验证自体血浆，汇集人AB血清或FCS可以支持γδT细胞文化。还记得外周血单个核细胞，从一些捐助者不回应zoledronate刺激，无论其他文化试剂。如果出现这种情况，唯一的选择就是改变捐助。
正如我们已经证明，γδT细胞的富集是比较早的实现;近80％的培养细胞，γδT细胞第7天。 γδT细胞继续增殖可达12-14天（ 图5）。约2.2 × 10 8γδT细胞，可从1 × 10 6
PBMC中含有1.6 × 10 4γδT细胞。这种培养方法已被用于在第二阶段我评估在多发性骨髓瘤或肺癌患者的安全性和可行性Zoledronate膨胀γδT细胞转移疗法的临床试验。 12,13
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
没有利益冲突的声明。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| ZOMETA | Novartis AG | zoledronate | |
| PROLEUKIN | Novartis AG | human recombinant IL-2 | |
| BD Vacutainer CPT Cell Preparation Tube with Sodium Heparin | BD Biosciences | 362753 | |
| RPMI1640 | Invitrogen | 21870-076 | |
| ALyS203- medium | Cell Science & Technology Institute | 0301-7 | |
| OpTmizer | Invitrogen | 0080022SA | |
| brefeldin A | Sigma-Aldrich | B5936-200UL | |
| phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA) | Sigma-Aldrich | P1585-1MG | |
| ionomycin | Sigma-Aldrich | 13909-1ML | |
| IntraPrep | Beckman Coulter Inc. | A07803 | |
| anti-human CD3-FITC or PE/Cy5 | Beckman Coulter Inc. | A07746 FITC A07749 PE/Cy5 | |
| anti-human CD4-ECD | Beckman Coulter Inc. | 6604727 | |
| anti-human CD8-PE/Cy5 | Beckman Coulter Inc. | 6607011 | |
| anti-human CD14-PE/Cy5 | Beckman Coulter Inc. | A07765 | |
| anti-human CD19-PE | Beckman Coulter Inc. | A07769 | |
| anti-human CD45-ECD | Beckman Coulter Inc. | A07784 | |
| anti-human CD56-PE/Cy5 | Beckman Coulter Inc. | A07789 | |
| anti-human TCRαβ-PE | Beckman Coulter Inc. | A39499 | |
| anti-human TCR Vγ9-FITC | Beckman Coulter Inc. | IM1463 | |
| anti-human CD27-PE/Cy5 | Beckman Coulter Inc. | 6607107 | |
| anti-human CD45RA-ECD | Beckman Coulter Inc. | IM2711 | |
| anti-human CD69-PE | BD Biosciences | 555531 | |
| anti-human NKG2D-PE | Beckman Coulter Inc. | A08934 | |
| Anti-humal IFNγ-PE | Beckman Coulter Inc. | IM2717U | |
| Mouse IgG1 isotype control-PE | Beckman Coulter Inc. | A07796 | |
| Mouse IgG1 isotype control-ECD or PE/Cy5 | Beckman Coulter Inc. | A07797A07798 |
References
- Bonneville, M., O'Brien, R. L., Born, W. K. γ T cell effector functions: a blend of innate programming and acquired plasticity. Nat Rev Immunol. 10, 467-478 (2010).
- Hintz, M. Identification of (E)-4-hydroxy-3-methyl-but-2-enyl pyrophosphate as a major activator for human γδ T cells in Escherichia coli. FEBS Lett. 509, 317-322 (2001).
- Gober, H. J. Human T cell receptor γδ cells recognize endogenous mevalonate metabolites in tumor cells. J Exp Med. 197, 163-168 (2003).
- Kabelitz, D., Wesch, D., He, W. Perspectives of gammadelta T cells in tumor immunology. Cancer Res. 67, 5-8 (2007).
- Roelofs, A. J. Peripheral blood monocytes are responsible for gammadelta T cell activation induced by zoledronic acid through accumulation of IPP/DMAPP. Br J Haematol. 144, 245-250 (2009).
- Dieli, F. Induction of γδ T-lymphocyte effector functions by bisphosphonate zoledronic acid in cancer patients in vivo. Blood. 102, 2310-2311 (2003).
- Kondo, M. Zoledronate facilitates large-scale ex vivo expansion of functional γδ T cells from cancer patients for use in adoptive immunotherapy. Cytotherapy. 10, 842-856 (2008).
- Espinosa, E. Chemical synthesis and biological activity of bromohydrin pyrophosphate, a potent stimulator of human γδ T cells. J Biol Chem. 276, 18337-18344 (2001).
- Kobayashi, H. Safety profile and anti-tumor effects of adoptive immunotherapy using γδ T cells against advanced renal cell carcinoma: a pilot study. Cancer Immunol Immunother. 56, 469-476 (2007).
- Murali-Krishna, K. Counting antigen-specific CD8 T cells: a reevaluation of bystander activation during viral infection. Immunity. 8, 177-187 (1998).
- Sato, K. Impact of culture medium on the expansion of T cells for immunotherapy. Cytotherapy. 11, 936-946 (2009).
- Abe, Y. Clinical and immunological evaluation of zoledronate-activated Vγ9 γδT-cell-based immunotherapy for patients with multiple myeloma. Exp Hematol. 37, 956-968 (2009).
- Nakajima, J. A phase I study of adoptive immunotherapy for recurrent non-small-cell lung cancer patients with autologous γδ T cells. Eur J Cardiothorac Surg. 37, 1191-1197 (2010).
