Summary
En metod att expandera γδ T-celler från perifera mononukleära blodceller (PBMC) beskrivs. PBMC-derived γδ T-celler stimuleras och byggas ut med zoledronate och interleukin-2 (IL-2). Storskalig utbyggnad av γδ T-celler kan användas för autolog cellulär immunterapi av cancer.
Abstract
Mänskliga γδ T-celler kan känna igen och reagera på ett brett utbud av stress-inducerade antigener, och därmed utveckla medfödda bred anti-tumör och anti-infektiösa aktivitet. 1 Majoriteten av γδ T-celler i perifert blod har Vγ9Vδ2 T cell receptorn. Dessa celler känner igen antigen i ett större histocompatibility komplex-oberoende sätt och utveckla starka cytolytisk och Th1-liknande effektorfunktioner. 1 Därför γδ T-cellerna är attraktiv kandidat effektorceller celler för immunterapi. Vγ9Vδ2 T-celler svarar på phosphoantigens t.ex. (E)-4-hydroxi-3-metyl-men-2-enyl pyrofosfat (HMBPP), som bildas i bakterier via isoprenoid biosyntes, 2 och isopentenyl pyrofosfat (IPP), som produceras i eukaryota celler genom mevalonat vägen. 3 i fysiologiska tillstånd är generering av IPP i nontransformed cellen inte tillräckligt för aktivering av γδ T-celler. Dysreglering av mevalonat vägen i tumörceller leder till ansamling av IPP och γδ T celler aktiveras. 3 Eftersom aminobisphosphonates (såsom pamidronat eller zoledronate) hämmar farnesylpyrofosfatsyntas (FPP), det enzym som agerar nedströms IPP i mevalonat väg, intracellulära nivåer av IPP och sensitibity att γδ T-celler erkännande kan vara terapeutiskt ökas med aminobisphosphonates. IPP ackumulering är mindre effektiv i nontransfomred celler än tumörceller med en farmakologiskt relevant koncentration av aminobisphosphonates, som tillåter oss immunterapi för cancer genom att aktivera γδ T-celler med aminobisphosphonates. 4 Intressant ackumuleras IPP i monocyter när PBMC behandlas med aminobisphosphonates, på grund av effektiva drog upptag av dessa celler. 5 Monocyter att IPP ackumuleras blir antigen-presenterande celler och stimulera Vγ9Vδ2 T-celler i perifert blod. 6 Baserat på dessa mekanismer, utvecklade vi en teknik för storskalig expansion av γδ T cellkulturer med zoledronate och interleukin -2 (IL-2). 7 Andra metoder för expansion av γδ T-celler utnyttja syntetiska phosphoantigens bromohydrin pyrofosfat (BrHPP) 8 eller 2-metyl-3-butenyl-1-pyrofosfat (2M3B1PP). 9 Alla dessa metoder gör ex vivo expansion, vilket resulterar i ett stort antal γδ T-celler för användning i adoptiv immunterapi. Det är dock endast zoledronate ett FDA-godkända kommersiellt tillgängliga reagens. Zoledronate-expanderade γδ T-celler visa CD27 - CD45RA - effektor minne fenotyp och dess funktion kan utvärderas av IFN-γ produktion analys 7.
Protocol
1. Isolering av PBMC
- Rita blod (7,5-8,0 ml) i en BD Vacutainer CPT cellberedningen Tube med natrium heparin. Röret innehåller en antikoagulans natriumheparin och en Ficoll-Hypaque densitet vätska, plus en polyester gel barriär, som skiljer de två vätskorna. Centrifugrör / blodprov vid rumstemperatur (18 ° C till 25 ° C) i en horisontell rotor (swing-out huvud) i 20 min vid 1800 x g.. Slå centrifugen obromsad.
- Efter centrifugering, inträffar den sekvens av lager enligt följande (sett uppifrån och ned): a) plasma - b) perifera mononukleära blodceller (PBMC) och blodplättar - c) densitet lösning - d) polyester gel - e) granulocyter - f) röda blodkroppar (Fig. 1).
- Samla en bråkdel av plasma-skiktet medan 5 till 10 mm av plasma ovanför interfas utan att störa cellager. Plasma kan användas för kultur (avsnitt 2.5).
- Harvest det anrikade fraktionen (PBMC) vid faserna med en pipett och överför till en 15 ml koniska rör.
- Tvätta PBMC med 10 ml fosfatbuffrad saltlösning (PBS), genom att vända röret 5 gånger, och centrifugera sedan i 5 min vid 400 x g..
- Upprepa tvätt stegen två gånger och sedan resuspendera cellpelleten i 5 ml PBS. Bestäm mobilnummer. Vanligtvis 1,3 x10 6 celler återhämtat sig från 1 ml helblod.
- Bestäm frekvens och fenotyp γδ T-celler i PBMC med flödescytometri (avsnitt 3) (Fig. 2).
2. Utbyggnad av γδ T-celler
- Centrifugera cellsuspensioner i 15 ml koniska rör i 5 min på 400 x g vid rumstemperatur, och kasta supernatanterna.
- Förbered odlingssubstrat (CM) genom att lägga till humant IL-2 (IL-2) och zoledronate (Zometa) till slutliga koncentrationer på 1000 IE / ml och 5 mikroM, respektive. ALyS203 (Cell Science & Technology Institute) eller OpTmizer (Invitrogen) media stödja en god expansion av γδ T-celler (mer information på referenser 6 och 9). Zometa ges i flytande form (4 mg/5-ml injektionsflaska). För att förbereda en 5 mikroM lösning, tillsätt 50 ìl av Zometa till 30 ml odlingsmedium.
- Resuspendera cellpelleten i odlingsmedium och anpassa sig till 1x10 6 celler / ml.
- Pipettera 1 ml av CM innehåller 1x10 6 celler i varje brunn på en 24-brunnar. För storskaliga kulturer, kan cellerna seedas på 0,5 x 10 6 celler / cm 2 beroende på ytor av plåt brunnar, fat, eller flaskan.
- Lägg autolog plasma (avsnitt 1.3), poolade humana AB sera eller FCS så att det är cirka 10% av volymen av den kultur (100 l för varje brunn på en 24-brunnar). Placera plattorna i en fuktig 37 ° C, 5% CO 2 inkubator i 24-48 tim.
- Bibehålla kulturen på en cell täthet av 0,5-2 x 10 6 celler / ml. Lägg till nya medium som innehåller humant IL-2 (1000 IE / ml) endast (utan Zometa) var 2-3 dagar, och överföra odlade celler till nya brunnar eller flaskor som behövs, beroende på graden av cellproliferation (Fig. 3). Supply plasma eller serum för mediet så att serumkoncentrationen kan bibehållas på minst 1%.
- Harvest celler på dag 12-14 och bestämma frekvens, fenotyp, och funktioner γδ T-celler med flödescytometri (se nedan).
3. Fenotypisk analys med flödescytometri
- Överför 200 l prover som innehåller 2 x 10 5 celler till fluorescens-aktiverad cell sortering (FACS) rör.
- Tillsätt 2 ml kallt PBS och centrifugera i 5 min vid 400 x g.. Sedan resuspendera pellets i 50 l FACS buffert (PBS + 1% FCS + 0,1% natriumazid). Tillsätt 5 l varje antikroppar mot de prover (de monoklonala antikroppar finns i tabell 1).
- Inkubera på is i mörker i 20 minuter.
- Tillsätt 2 ml FACS buffert i varje prov, och sedan skaka. Centrifugera prover för 5 min på 400 x g vid 4 ° C. Försiktigt dekantera supernatanten.
- Resuspendera cellerna i 300 l FACS buffert och skaka. Analysera prover på en flödescytometer (Fig. 2).
4. IFN-γ produktion analys 10
- Dagen innan analysen, förbereda stimulatorn celler genom odling 3-5 x10 5 Daudi celler / ml i RPMI 1640 medelstora plus 10% FCS (RPMI-10) över natten med Zometa (5 mikroM) (nedan angivna Z-Daudi).
- Samla Z-Daudi och återsuspendera i RPMI-10 i 2x10 6 celler / ml. Tillsätt 100 l av Z-Daudi (2x10 5) i varje brunn på en rundbottnad 96-brunnar.
- Förbered γδ T-celler på 2x10 6 celler / ml i RPMI-10 innehåller Brefeldin A vid 20 mikrogram / ml. Överför 100 ìl γδ T-cell fjädring (2x10 5) till varje brunn som innehåller Z-Daudi celler eller för att styra brunnar (100 ìl av RPMI-10 enbart, eller RPMI-10 med 20 ng / ml phorbol 12-myristate 13-acetat[PMA] plus 2 mikrogram / ml ionomycin).
- Blanda genom att pipettera upp och ned flera gånger. Inkubera i 4 tim i 37 ° C, 5% CO 2 inkubator.
- Centrifugera plattan i 5 minuter vid 400 x g vid 4 ° C och resuspendera pellets i 200 l av kall PBS.
- Överför proverna till FACS rör. Tillsätt 4 ml kall PBS och centrifugera rören i 5 minuter vid 400 x g vid 4 ° C.
- Resuspendera pellets i 50 ìl FACS buffert med FITC-konjugerat anti-TCRVγ9 (5 l) och PE/Cy5-conjugated anti-CD3 mAb (2,5 l). Inkubera skyddas mot ljus i 15 minuter vid rumstemperatur.
- Tillsätt 100 ìl IntraPrep reagens 1 och inkubera i 15 minuter vid rumstemperatur. Tillsätt 4 ml PBS till varje rör och centrifugera i 5 min på 400 x g vid rumstemperatur.
- Avlägsna supernatanten genom aspiration och tillsätt 100 ìl IntraPrep reagens 2. Inkubera i 5 minuter i rumstemperatur utan att skaka.
- Tillsätt 5 ìl av PE-konjugerat anti-IFN-γ mAb till provröret. Inkubera skyddas mot ljus i 15 minuter vid rumstemperatur.
- Tillsätt 4 ml PBS till varje rör och centrifugera i 5 min på 400 x g vid rumstemperatur. Avlägsna supernatanten genom aspiration och resuspendera cellpelleten i 0,5 ml FACS buffert.
- Analysera cellerna genom flödescytometern. Gate på CD3 + TCRVγ9 + celler och undersöka uttrycket av IFN-γ (bild 4).
5. Representativa resultat:
Det är viktigt att bestämma andelen γδ T-celler i PBMC i början av kulturen. Som visas i figur. 2 A har andelen CD3 + TCRVγ9 + γδ T-celler i PBMC var 1,6% dag 0. Den dominerande befolkningen var CD27 + CD45RA + naiv eller CD27 + CD45RA - centrala minne fenotyper. När γδ T-celler effektivt stimulerades, bildade de kluster på dag 3-5 (Fig. 3 A och B). När klusterbildning var försenad, tillväxten av andra celltyper, såsom CD4 + och CD8 + αβ T-celler eller NK-celler skulle kunna dominera tillväxten av γδ T-celler (bild 3 C och D). Efter 14 dagar av kultur, ökad frekvens av γδ T-celler till mer än 93,8% av de odlade cellerna i framgångsrika γδ T cellkulturer (Fig. 2 E). Den odlade γδ T-celler uppregleras NKG2D och CD69 uttryck (Fig. 2 G och H). De visade CD27 - CD45RA - effektor minne fenotyp (Fig. 2 F). Funktionerna i γδ T-celler utvärderades med avseende på cytokin produktion och cytotoxicitet. Den intracellulära IFN-γ färgning visade att γδ T-celler producerade IFN-γ som svar på PMA / ionomycin behandling eller Z-Daudi celler som samlats IPP efter zoledronate behandlingen (bild 4). Dessa resultat indikerar att zoledronate effektivt kan stimulera och utveckla funktionella γδ T-celler.
| röret | FITC | PE | ECD | PE/Cy5 |
| 1 | CD3 | CD19 | CD45 | CD14 |
| 2 | CD3 | TCRαβ | CD4 | CD8 |
| 3 | CD3 | CD56 | ||
| 4 | TCR Vγ9 | TCRαβ | CD45 | CD3 |
| 5 | TCR Vγ9 | NKG2D | ||
| 6 | TCR Vγ9 | CD69 | ||
| 7 | TCR Vγ9 | mus IgG1 | ||
| 8 | TCR Vγ9 | CD45RA | CD27 | |
| 9 | TCR Vγ9 | mus IgG1 | mus IgG1 |
Tabell 1. Monoklonala antikroppar används i multicolor färgning av γδ T-celler. Ett exempel på fenotypisk analys av γδ T-celler som utförs i vårt laboratorium visas i figur. 2.
Figur 1. Separation av PBMC. Blod (7,5-8,0 ml) dras in i en BD Vacutainer CPT cellberedningen Tube med natriumheparin och direkt centrifugeras i 20 minuter vid 1800 x g.. Efter centrifugering, den resulterande lager sedd från toppen till Bottom: a) Plasma - b) PBMC och blodplättar - c) Densitet lösning - d) Polyester gel - e) Granulocyter - f) röda blodkroppar.
Figur 2. Typisk yta fenotyp av γδ T-celler. PBMC stimuleras med zoledronate och IL-2 i 14 dagar. Cellerna färgades med FITC-märkt anti-TCR Vγ9 och PE/Cy5-labeled anti-CD3 att övervaka utbyggnaden av γδ T-celler (A och E). γδ T-celler identifierades genom deras uttryck av TCRVγ9, och deras uttryck av CD27 och CD45RA (B och F), NKG2D (C och G), eller CD69 (D och H) undersöktes.
Figur 3. Representant γδ T-cell kulturer. PBMC stimulerades med IL-2 (1000 IE / ml) och zoledronate (5 M). Representant fält visas (IX71 inverterat mikroskop [Olympus] x 200). Kluster och aggregat av γδ T-celler kan observeras på dag 3 (A) och dag 5 (B), då γδ T-celler med framgång expanderat. Däremot fanns inga kluster eller aggregat observerades när γδ T-cellernas tillväxt var inte tillräcklig (C och D).
Figur 4. IFN-γ produktion. γδ T-celler inkuberades med RPMI-10 bara (A) eller PMA / ionomycin (B) eller Z-Daudi (C) i 4 tim. Först var yta uttryck för TCRVγ9 färgade och sedan IFN-γ produktion undersöktes av intracellulära IFN-γ färgning.
Figur 5. Kinetik γδ T cellkultur. (A) absoluta antalet odlade celler, (B) procent av γδ T-celler, och (C) absoluta antalet γδ T-celler vid den angivna tidpunkter.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Den metod som presenteras här möjliggör en effektiv expansion av γδ T-celler från PBMC. γδ T-celler aktiveras och utökas med zoledronate och IL-2 utveckla kompletta effektorfunktioner, reflekteras av cytokin produktion och cytotoxicitet. Det har rapporterats att den syntetiska phosphoantigens bromohydrin pyrofosfat (BrHPP) och 2-metyl-3-butenyl-1-pyrofosfat (2M3B1PP) också utöka γδ T-celler, men de är inte kommersiellt tillgängliga. Däremot är zoledronate redan licensierad för kliniska tillämpningar som Zometa. Därför är en pålitlig reagens lätt tillgängliga.
Urvalet av kultur media och serum är kritisk. Använd lämplig kultur media såsom ALyS203 (Cell Science & Technology Institute) eller OpTmizer (Invitrogen) för framgångsrik γδ T-cell expansion. 11 Kontrollera att autolog plasma kan poolade humana AB serum eller FCS stöd γδ T cellkultur. Kom också ihåg att PBMC från vissa givare inte svarar på zoledronate stimulans oavsett annan kultur reagenser. Om det händer är det enda alternativet för att ändra givaren.
Som vi har visat, var anrikning av γδ T-celler uppnås relativt tidigt, nästan 80% av odlade celler γδ T-celler för dag 7. γδ T-celler fortsatte att föröka sig upp till 12-14 dagar (bild 5). Cirka 2,2 x 10 8 γδ T-celler kan erhållas från 1 x 10 6
PBMC med 1,6 x 10 4 γδ T-celler. Denna kultur Metoden har använts i kliniska fas I studier som utvärderar säkerheten och genomförbarheten av zoledronate-expanderade γδ T-cell överföra patienter med multipelt myelom eller lungcancer. 12,13
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Inga intressekonflikter deklareras.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| ZOMETA | Novartis AG | zoledronate | |
| PROLEUKIN | Novartis AG | human recombinant IL-2 | |
| BD Vacutainer CPT Cell Preparation Tube with Sodium Heparin | BD Biosciences | 362753 | |
| RPMI1640 | Invitrogen | 21870-076 | |
| ALyS203- medium | Cell Science & Technology Institute | 0301-7 | |
| OpTmizer | Invitrogen | 0080022SA | |
| brefeldin A | Sigma-Aldrich | B5936-200UL | |
| phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA) | Sigma-Aldrich | P1585-1MG | |
| ionomycin | Sigma-Aldrich | 13909-1ML | |
| IntraPrep | Beckman Coulter Inc. | A07803 | |
| anti-human CD3-FITC or PE/Cy5 | Beckman Coulter Inc. | A07746 FITC A07749 PE/Cy5 | |
| anti-human CD4-ECD | Beckman Coulter Inc. | 6604727 | |
| anti-human CD8-PE/Cy5 | Beckman Coulter Inc. | 6607011 | |
| anti-human CD14-PE/Cy5 | Beckman Coulter Inc. | A07765 | |
| anti-human CD19-PE | Beckman Coulter Inc. | A07769 | |
| anti-human CD45-ECD | Beckman Coulter Inc. | A07784 | |
| anti-human CD56-PE/Cy5 | Beckman Coulter Inc. | A07789 | |
| anti-human TCRαβ-PE | Beckman Coulter Inc. | A39499 | |
| anti-human TCR Vγ9-FITC | Beckman Coulter Inc. | IM1463 | |
| anti-human CD27-PE/Cy5 | Beckman Coulter Inc. | 6607107 | |
| anti-human CD45RA-ECD | Beckman Coulter Inc. | IM2711 | |
| anti-human CD69-PE | BD Biosciences | 555531 | |
| anti-human NKG2D-PE | Beckman Coulter Inc. | A08934 | |
| Anti-humal IFNγ-PE | Beckman Coulter Inc. | IM2717U | |
| Mouse IgG1 isotype control-PE | Beckman Coulter Inc. | A07796 | |
| Mouse IgG1 isotype control-ECD or PE/Cy5 | Beckman Coulter Inc. | A07797A07798 |
References
- Bonneville, M., O'Brien, R. L., Born, W. K. γ T cell effector functions: a blend of innate programming and acquired plasticity. Nat Rev Immunol. 10, 467-478 (2010).
- Hintz, M. Identification of (E)-4-hydroxy-3-methyl-but-2-enyl pyrophosphate as a major activator for human γδ T cells in Escherichia coli. FEBS Lett. 509, 317-322 (2001).
- Gober, H. J. Human T cell receptor γδ cells recognize endogenous mevalonate metabolites in tumor cells. J Exp Med. 197, 163-168 (2003).
- Kabelitz, D., Wesch, D., He, W. Perspectives of gammadelta T cells in tumor immunology. Cancer Res. 67, 5-8 (2007).
- Roelofs, A. J. Peripheral blood monocytes are responsible for gammadelta T cell activation induced by zoledronic acid through accumulation of IPP/DMAPP. Br J Haematol. 144, 245-250 (2009).
- Dieli, F. Induction of γδ T-lymphocyte effector functions by bisphosphonate zoledronic acid in cancer patients in vivo. Blood. 102, 2310-2311 (2003).
- Kondo, M. Zoledronate facilitates large-scale ex vivo expansion of functional γδ T cells from cancer patients for use in adoptive immunotherapy. Cytotherapy. 10, 842-856 (2008).
- Espinosa, E. Chemical synthesis and biological activity of bromohydrin pyrophosphate, a potent stimulator of human γδ T cells. J Biol Chem. 276, 18337-18344 (2001).
- Kobayashi, H. Safety profile and anti-tumor effects of adoptive immunotherapy using γδ T cells against advanced renal cell carcinoma: a pilot study. Cancer Immunol Immunother. 56, 469-476 (2007).
- Murali-Krishna, K. Counting antigen-specific CD8 T cells: a reevaluation of bystander activation during viral infection. Immunity. 8, 177-187 (1998).
- Sato, K. Impact of culture medium on the expansion of T cells for immunotherapy. Cytotherapy. 11, 936-946 (2009).
- Abe, Y. Clinical and immunological evaluation of zoledronate-activated Vγ9 γδT-cell-based immunotherapy for patients with multiple myeloma. Exp Hematol. 37, 956-968 (2009).
- Nakajima, J. A phase I study of adoptive immunotherapy for recurrent non-small-cell lung cancer patients with autologous γδ T cells. Eur J Cardiothorac Surg. 37, 1191-1197 (2010).
