Summary
Γδ T hücreleri periferik kan mononükleer hücreleri (hücre) genişletmek için bir yöntem açıklanmıştır. Hücre-kökenli γδ T hücreleri uyarılır ve zoledronate ve interlökin-2 (IL-2) ile genişletilir. Γδ T hücrelerinin büyük ölçekli genişlemesi kanser otolog hücresel immünoterapi uygulanabilir.
Abstract
İnsan γδ T hücreleri tanımak ve stres kaynaklı antijenleri geniş bir yelpazede cevap, böylece doğuştan gelen geniş bir anti-tümör ve anti-enfektif aktivite gelişmekte olan 1, periferik kan γδ T hücrelerinin çoğunluğu Vγ9Vδ2 T hücre reseptör var . Bu hücreler, büyük doku uygunluk kompleksi-bağımsız bir şekilde antijeni tanıması ve güçlü sitolitik ve Th1 gibi efektör fonksiyonları gelişir. 1 Bu nedenle, γδ T hücrelerinin, kanser immünoterapi için cazip aday efektör hücreleri vardır. Vγ9Vδ2 T hücreleri gibi phosphoantigens cevap (E)-4-hidroksi-3-metil-ama-2-enyl pirofosfat (HMBPP), izoprenoid biyosentezi ile bakteriler sentezlenir; üretilen 2 ve izopentenil pirofosfat (IPP), mevalonata yolu 3 fizyolojik durumu ile ökaryot hücreler, IPP nontransformed hücre üretimi γδ T hücrelerinin aktivasyonu için yeterli değildir. Düzensizliği, tümör hücrelerinde mevalonata yolun IPP birikimi ve γδ T hücrelerinin aktivasyonu yol açar. 3 aminobisphosphonates (örneğin, pamidronat veya zoledronate) farnesil pirofosfat sentaz (SOP), mevalonata yolu IPP mansabında hareket eden enzim, hücre içi düzeylerini inhibe Çünkü γδ T hücreleri tanıma IPP ve sensitibity terapötik aminobisphosphonates artabilir. IPP birikimi nontransfomred hücreleri aminobisphosphonates ile γδ T hücreleri aktive ederek kanser için bize izin immünoterapi aminobisphosphonates farmakolojik ilgili bir konsantrasyon ile tümör hücrelerinin daha az verimlidir. PBMC aminobisphosphonates ile tedavi edildiklerinde 4 İlginçtir, IPP çünkü verimli, monositler birikir bu hücreler tarafından ilaç alımı. IPP antijen-sunan hücreler haline ve periferik kan Vγ9Vδ2 T hücreleri uyarmak birikir 5 Monositler 6 bu mekanizmalar dayanarak, biz γδ T hücre kültürleri zoledronate ve interlökin kullanarak büyük ölçekli genişlemesi için bir teknik geliştirdi -2 (IL-2). sentetik phosphoantigens bromohydrin pirofosfat (BrHPP) 8 ya da 2-metil-3-butenyl-1-pirofosfat (2M3B1PP) 7 γδ T hücrelerinin genişlemesi için diğer yöntemler kullanmaktadır. 9 Tüm bu yöntemlerin eski izin evlatlık immünoterapi kullanmak için γδ T hücrelerinin çok sayıda in vivo genişlemesi. Ancak, zoledronate sadece bir FDA onaylı piyasada bulunan reaktif. CD45RA - - Zoledronate-genişletilmiş γδ T hücreleri CD27 ekran efektör bellek fenotipi ve fonksiyonu IFN-γ üretimi tahlil 7 değerlendirilebilir.
Protocol
1. PBMC, izolasyon
- BD Vacutainer CPT Hücre Hazırlık Tüp Sodyum Heparin ile kan (7,5-8,0 ml) çizin. Tüp sodyum heparin, antikoagülan ve Ficoll Hypaque yoğunluğu sıvı, artı, iki sıvı ayıran bir polyester jel bariyer, içerir. 1800 x g'de 20 dakika boyunca yatay bir rotor (dışarıya başını) oda sıcaklığında (18 ° C - 25 ° C) tüp / kan örneği santrifüjleyin . Frenler santrifüj geçin.
- Santrifüj sonra, katmanlar dizisi (yukarıdan aşağıya doğru görülen) aşağıdaki gibi oluşur: a) plazma b) periferik kan mononükleer hücreleri (hücre) ve trombositler - c) yoğunluk çözüm - d) polyester jel - e) granülositler - f) kırmızı kan hücreleri (Şekil 1).
- Interfaz yukarıda plazma hücre katmanı bozmadan 5 ila 10 mm bırakarak, plazma tabakasının bir kısmını toplayın. Plazma kültür (bölüm 2.5) için kullanılabilir.
- Interfaz bir pipet ve 15 ml konik tüp transferi ile zenginleştirilmiş fraksiyonu (hücre) Hasat.
- 10 ml PBMC yıkayın fosfat tamponlu salin (PBS), tersine tüp ile 5 kez ve daha sonra x 400 g de 5 dakika süreyle santrifüj.
- Yıkama adımları iki kez tekrarlayın ve sonra 5 ml PBS içinde hücre pelletini tekrar süspansiyon haline getirin. Hücre sayısını belirler. Genellikle 6 hücreli 1,3 x10, 1 ml tam kan kurtarıldı .
- Frekans ve flow sitometri (Bölüm 3) (Şekil 2) tarafından hücre γδ T hücre fenotipi belirleyin.
2. Γδ T hücreleri, Genişleme
- 400 x g oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 15 ml konik tüpler hücre süspansiyonları Santrifüj ve süpernatantlar atın.
- Kültür vasatı (CM), sırasıyla 1000 IU / ml ve 5 mcM son konsantrasyonlarda insan IL-2 (IL-2) ve zoledronate (Zometa) ekleyerek hazırlayın. ALyS203 (Hücre Bilim ve Teknoloji Enstitüsü) veya OpTmizer (Invitrogen) medya γδ T hücreleri (6 ve 9 referanslar daha fazla bilgi) iyi bir genişleme destek. Zometa sıvı formda (4 mg/5-ml flakon) sağlanır. 5 mcM çözelti hazırlamak için, 30 ml kültür ortamı Zometa 50 ul ekleyin.
- Yeniden süspanse kültür ortamında hücre pelet ve 1x10 6 hücre / ml ayarlayabilirsiniz.
- 24 plaka her kuyuya 1x10 6 hücre içeren CM pipetleyin 1 ml. Büyük ölçekli kültürleri için, hücre plaka kuyuları, tabak, ya da balonun yüzey alanlarına göre 2, 0.5 x 10 6 hücre / cm az numaralı seribaşı olabilir.
- Kültür (24 plaka her bir kuyu için 100 ul) hacmi yaklaşık% 10 olduğunu otolog plazma (bölüm 1.3), toplanmış insan AB sera ya da FCS ekleyin. 37 nemlendirilmiş bir tabak koyun ° C,% 5 CO 2 kuvöz 24-48 saat.
- 0.5-2 x 10 6 hücre / ml bir hücre yoğunluğu kültür koruyun. Her 2-3 günde bir insan IL-2 (1000 IU / ml) (Zometa olmadan) içeren taze orta ekleyin ve hücre proliferasyonu derecesi (Şekil 3) göre, kültür hücreleri gerektiğinde yeni kuyu veya şişeler içine aktarmak . Kaynağı plazma veya serum konsantrasyonu en az% 1 korunabilir böylece orta serum.
- 12-14 gün ve sıklığı, fenotip ve flow sitometri γδ T hücreleri (aşağıya bakın) fonksiyonları belirlemek Hasat hücreleri.
3. Flow sitometri ile fenotipik analizi
- Floresan ile aktive olan hücre sıralama (FACS) boruları 2 x 10 5 hücre içeren 200 ul örnekleri aktarın.
- 2 ml soğuk PBS ekleyin ve 5 dakika boyunca 400 x g santrifüj. Ardından, 50 ul FACS tamponu (PBS +% 1 FCS +% 0.1 sodyum azid) pelet tekrar süspansiyon haline getirin. Örnekleri (monoklonal antikorlar Tablo 1'de yer alan) her antikorların 5 ul ekleyin.
- 20 dakika süreyle karanlıkta buz üzerinde inkübe edin.
- Her bir numune için 2 ml FACS tampon ekleyin ve sonra vorteks. 4 x 400 g ° C 5 dakika Santrifüj örnekleri Süpernatantı dikkatlice süzün.
- 300 ul FACS tampon ve vorteks hücrelerin tekrar (Şekil 2) bir akış sitometresinin örnekleri analiz.
4. IFN-γ üretimi tahlil 10
- RPMI 1640 orta artı Zometa (5 mcM) (bundan sonra Z DAUDI belirlenen) ile bir gecede% 10 FCS (RPMI-10) gün önce tahlil, kültür 3-5 x10 5 DAUDI hücre / ml stimülatörü hücreleri hazırlar.
- 2x10 6 hücre / ml RPMI-10 Z-DAUDI ve tekrar süspansiyon toplayın. Yuvarlak bir alt 96 plaka her bir kuyu için 100, Z-DAUDI 5) (2x10 ul ekleyin .
- RPMI-10 A 20 mg / ml Brefeldin içeren 2x10 6 hücre / ml γδ T hücreleri hazırlayın. Her bir kuyunun Z-DAUDI hücreleri içeren γδ T hücre süspansiyonu (2x10 5) 100 ul transferi veya kuyulardan (100 sadece RPMI-10 ul, ya da phorbol 20 ng / ml, 12-miristat 13-asetat ile RPMI- 10 kontrol[PMA] artı 2 mcg / ionomycin ml).
- Birkaç kez aşağı yukarı pipetleme karıştırın. 37 ° C,% 5 CO2 inkübatör 4 saat süreyle inkübe edin.
- 4 ° C'de 5 dakika boyunca 400 x g plaka Santrifüj ve soğuk PBS 200 ul pelet tekrar süspansiyon haline getirin.
- FACS tüpler örnekleri aktarın. 4 ml soğuk PBS ekleyin ve 4 x 400 gr az 5 dakika süreyle tüpler santrifüj ° C
- FITC-konjuge anti-TCRVγ9 (5 ul) ve anti-CD3 PE/Cy5-conjugated mAb (ul 2.5) ile 50 ul FACS tampon pelet tekrar Oda sıcaklığında 15 dakika inkübe ışıktan korunmalıdır.
- IntraPrep reaktif 1 100 ul ekleyin ve oda sıcaklığında 15 dakika inkübe edin. 400 x g oda sıcaklığında 5 dakika boyunca her santrifüj tüpü ve 4 ml PBS ekleyin.
- Aspirasyon ile süpernatantı ve IntraPrep reaktif 2 100 ul ekleyin. Titreme olmadan oda sıcaklığında 5 dakika inkübe edin.
- PE-konjuge anti-IFN-γ mAb test tüpüne 5 ul ekleyin. Oda sıcaklığında 15 dakika inkübe ışıktan korunmalıdır.
- 400 x g oda sıcaklığında 5 dakika boyunca her santrifüj tüpü ve 4 ml PBS ekleyin. Aspirasyon ile süpernatantı ve FACS tampon 0.5 ml hücre pelletini tekrar süspansiyon haline getirin.
- Akış sitometresinde hücreleri analiz edin. CD3 + TCRVγ9 + hücreler Kapısı ve IFN-γ (Şekil 4) ifadesidir incelemek.
5. Temsilcisi Sonuçlar:
Hücre kültür başlangıcında γδ T hücrelerinin yüzdesini belirlemek için önemlidir. Şekil. 2 A, CD3 + TCRVγ9 yüzdesi + γδ T hücreleri, hücre içinde 0. günde% 1.6 idi . Merkezi bellek fenotipleri - baskın popülasyonları CD27 + CD45RA + naif ya da CD27 + CD45RA . Γδ T hücreleri etkin bir şekilde uyarılır, (Şekil 3 A ve B) gün 3-5 kümeler oluşturdu. Küme oluşumu gecikir, büyüme gibi diğer hücre türleri, CD4 + veya CD8 + αβ T hücreleri ve NK hücreleri γδ T hücreleri (Şekil 3 C ve D) büyüme hakim olabilir. 14 gün sonra kültür, γδ T hücrelerinin sıklığı% 93.8 başarılı γδ T hücre kültürleri (Şekil 2 E) kültür hücreleri daha fazla arttı. Kültürlü γδ T hücreleri upregüle NKG2D ve CD69 ekspresyonu (Şekil 2 G ve H). CD27 görüntülenir - CD45RA - efektör bellek fenotipi (Şekil 2 F). Sitokin üretimi ve sitotoksisiteye ilişkin γδ T hücrelerinin fonksiyonları değerlendirildi. Hücre içi IFN-γ boyama γδ T hücreleri PMA / ionomycin tedavi veya Z-DAUDI hücreleri IFN-γ üretilen olduğunu göstermiştir zoledronate tedavi sonrası biriken IPP (Şekil 4). Bu sonuçlar, bu zoledronate verimli bir şekilde uyaran ve fonksiyonel γδ T hücreleri genişletebilirsiniz göstermektedir.
| tüp | FITC | PE | EÇG | PE/Cy5 |
| 1 | CD3 | CD19 | CD45 | CD14 |
| 2 | CD3 | TCRαβ | CD4 | CD8 |
| 3 | CD3 | CD56 | ||
| 4 | TCR Vγ9 | TCRαβ | CD45 | CD3 |
| 5 | TCR Vγ9 | NKG2D | ||
| 6 | TCR Vγ9 | CD69 | ||
| 7 | TCR Vγ9 | fare IgG1 | ||
| 8 | TCR Vγ9 | CD45RA | CD27 | |
| 9 | TCR Vγ9 | fare IgG1 | fare IgG1 |
Tablo 1 γδ T hücrelerinin çok renkli boyama kullanılan monoklonal antikorlar. Laboratuvarımızda yapılan γδ T hücrelerinin fenotipik analiz bir örnek Şekil. 2.
Şekil 1 PBMC ayrılması. Kan (7,5-8,0 ml) BD Vacutainer CPT Hücre Hazırlık Tüp Sodyum Heparin içine çekilir ve doğrudan 1800 x g de 20 dakika süreyle santrifüj edildi. Olarak çıkan katmanları santrifüj sonra, üstten bo görüldüttom: a) Plazma - b) hücre ve trombositler - c) Yoğunluk çözüm, d) Polyester jel e) Granülositler - f) Kırmızı kan hücreleri.
Şekil 2 γδ T hücreleri tipik yüzey fenotipi. PBMC 14 gün boyunca zoledronate ve IL-2 ile uyarılır. Hücreleri ile boyandı FITC etiketli anti-TCR Vγ9 ve γδ T hücreleri (A ve E) genişlemesi izlemek için anti-CD3 PE/Cy5-labeled. γδ T hücreleri TCRVγ9 kendi ifadesi ile tespit edildi ve CD27 ve CD45RA (B ve F), NKG2D (C ve G) ve CD69 (D ve H) kendi ifadesi incelenmiştir.
Şekil 3 Temsilcisi γδ T hücre kültürleri. Hücre IL-2 (1000 IU / ml) ve zoledronate (5 mcM) ile uyarılır. Temsilcisi alanları (IX71 inverted mikroskop [Olympus] x 200) gösterilmiştir. Γδ T hücre kümeleri ve agrega γδ T hücreleri başarılı bir şekilde genişletilmiş 3. günde (A) ve 5. gün (B) görülebilir. Γδ T hücre büyümesi (C ve D) yeterli değildi, aksine, hiçbir kümeleri veya agrega gözlendi.
Şekil 4, IFN-γ üretimi . γδ T hücreleri sadece RPMI-10 (A) ya da PMA / ionomycin (B) veya 4 saat Z-DAUDI (C) ile inkübe edildi. İlk olarak, TCRVγ9 yüzey ekspresyonu boyandı ve daha sonra IFN-γ üretimi hücre içi IFN-γ boyama ile incelendi.
Şekil 5 γδ T hücre kültürü Kinetiği. (A) kültür hücrelerinin mutlak sayısı, (B) γδ T hücreleri, ve (C) belirtilen zaman noktalarında γδ T hücrelerinin mutlak sayısı yüzdesi.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Burada sunulan yöntem PBMC γδ T hücrelerinin verimli genişleme sağlar. γδ T hücrelerinin etkinleştirilmesi ve geliştirilmesi zoledronate ve IL-2 sitokin üretim ve sitotoksisiteye yansıyan tam efektör fonksiyonları, geliştirmek. Bildirilmiştir sentetik phosphoantigens bromohydrin pirofosfat (BrHPP) ve 2-metil-3-butenyl-1-pirofosfat (2M3B1PP) γδ T hücreleri genişletmek, ancak ticari olarak mevcut değildir. Buna karşılık, zoledronate zaten Zometa gibi klinik uygulamalar için lisanslıdır. Bu nedenle, güvenilir reaktif, kolay ulaşılabilir.
Kültür ortamı ve serum seçimi kritik bir noktadır. ALyS203 (Hücre Bilim ve Teknoloji Enstitüsü) veya başarılı γδ T hücre genişlemesi için OpTmizer (Invitrogen) gibi uygun bir kültür ortamı kullanın 11 bu otolog plazma doğrulayın, toplanmış insan AB sera veya FCS γδ T hücre kültürü destek olabilir. Ayrıca, ne olursa olsun diğer kültür reaktiflerin zoledronate stimülasyonuna yanıt Bazı donörler başarısız gelen bu PBMC hatırlıyorum. Eğer bu gerçekleşirse, donör değiştirmek için tek seçenek.
Gösterdiği gibi, γδ T hücreleri zenginleştirilmesi nispeten erken sağlandı; kültür hücrelerinin yaklaşık% 80, 7 gün γδ T hücreleri. γδ T hücreleri 12-14 gün (Şekil 5) kadar sayısı hızla artmaya devam etti. Yaklaşık 2.2 x 10 8 γδ T hücreleri, 1 x 10 6 elde edilebilir
PBMC 1.6 x 10 4 γδ T hücreleri içeren. Bu kültür yöntemi aşamasında kullanılan olmuştur değerlendiren klinik çalışmalarda multipl miyelom ya da akciğer kanseri olan hastalarda, güvenlik ve Zoledronate-genişletilmiş γδ T hücre transferi tedavi fizibilite. 12,13
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Çıkar çatışması ilan etti.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| ZOMETA | Novartis AG | zoledronate | |
| PROLEUKIN | Novartis AG | human recombinant IL-2 | |
| BD Vacutainer CPT Cell Preparation Tube with Sodium Heparin | BD Biosciences | 362753 | |
| RPMI1640 | Invitrogen | 21870-076 | |
| ALyS203- medium | Cell Science & Technology Institute | 0301-7 | |
| OpTmizer | Invitrogen | 0080022SA | |
| brefeldin A | Sigma-Aldrich | B5936-200UL | |
| phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA) | Sigma-Aldrich | P1585-1MG | |
| ionomycin | Sigma-Aldrich | 13909-1ML | |
| IntraPrep | Beckman Coulter Inc. | A07803 | |
| anti-human CD3-FITC or PE/Cy5 | Beckman Coulter Inc. | A07746 FITC A07749 PE/Cy5 | |
| anti-human CD4-ECD | Beckman Coulter Inc. | 6604727 | |
| anti-human CD8-PE/Cy5 | Beckman Coulter Inc. | 6607011 | |
| anti-human CD14-PE/Cy5 | Beckman Coulter Inc. | A07765 | |
| anti-human CD19-PE | Beckman Coulter Inc. | A07769 | |
| anti-human CD45-ECD | Beckman Coulter Inc. | A07784 | |
| anti-human CD56-PE/Cy5 | Beckman Coulter Inc. | A07789 | |
| anti-human TCRαβ-PE | Beckman Coulter Inc. | A39499 | |
| anti-human TCR Vγ9-FITC | Beckman Coulter Inc. | IM1463 | |
| anti-human CD27-PE/Cy5 | Beckman Coulter Inc. | 6607107 | |
| anti-human CD45RA-ECD | Beckman Coulter Inc. | IM2711 | |
| anti-human CD69-PE | BD Biosciences | 555531 | |
| anti-human NKG2D-PE | Beckman Coulter Inc. | A08934 | |
| Anti-humal IFNγ-PE | Beckman Coulter Inc. | IM2717U | |
| Mouse IgG1 isotype control-PE | Beckman Coulter Inc. | A07796 | |
| Mouse IgG1 isotype control-ECD or PE/Cy5 | Beckman Coulter Inc. | A07797A07798 |
References
- Bonneville, M., O'Brien, R. L., Born, W. K. γ T cell effector functions: a blend of innate programming and acquired plasticity. Nat Rev Immunol. 10, 467-478 (2010).
- Hintz, M. Identification of (E)-4-hydroxy-3-methyl-but-2-enyl pyrophosphate as a major activator for human γδ T cells in Escherichia coli. FEBS Lett. 509, 317-322 (2001).
- Gober, H. J. Human T cell receptor γδ cells recognize endogenous mevalonate metabolites in tumor cells. J Exp Med. 197, 163-168 (2003).
- Kabelitz, D., Wesch, D., He, W. Perspectives of gammadelta T cells in tumor immunology. Cancer Res. 67, 5-8 (2007).
- Roelofs, A. J. Peripheral blood monocytes are responsible for gammadelta T cell activation induced by zoledronic acid through accumulation of IPP/DMAPP. Br J Haematol. 144, 245-250 (2009).
- Dieli, F. Induction of γδ T-lymphocyte effector functions by bisphosphonate zoledronic acid in cancer patients in vivo. Blood. 102, 2310-2311 (2003).
- Kondo, M. Zoledronate facilitates large-scale ex vivo expansion of functional γδ T cells from cancer patients for use in adoptive immunotherapy. Cytotherapy. 10, 842-856 (2008).
- Espinosa, E. Chemical synthesis and biological activity of bromohydrin pyrophosphate, a potent stimulator of human γδ T cells. J Biol Chem. 276, 18337-18344 (2001).
- Kobayashi, H. Safety profile and anti-tumor effects of adoptive immunotherapy using γδ T cells against advanced renal cell carcinoma: a pilot study. Cancer Immunol Immunother. 56, 469-476 (2007).
- Murali-Krishna, K. Counting antigen-specific CD8 T cells: a reevaluation of bystander activation during viral infection. Immunity. 8, 177-187 (1998).
- Sato, K. Impact of culture medium on the expansion of T cells for immunotherapy. Cytotherapy. 11, 936-946 (2009).
- Abe, Y. Clinical and immunological evaluation of zoledronate-activated Vγ9 γδT-cell-based immunotherapy for patients with multiple myeloma. Exp Hematol. 37, 956-968 (2009).
- Nakajima, J. A phase I study of adoptive immunotherapy for recurrent non-small-cell lung cancer patients with autologous γδ T cells. Eur J Cardiothorac Surg. 37, 1191-1197 (2010).
