Summary
Een methode om γδ T-cellen uit het perifere bloed mononucleaire cellen (PBMC) uit te breiden wordt beschreven. PBMC-afgeleide γδ T-cellen worden gestimuleerd en uitgebreid met behulp van zoledronaat en interleukine-2 (IL-2). Grootschalige uitbreiding van γδ T-cellen kunnen worden toegepast op autologe cellulaire immunotherapie van kanker.
Abstract
Menselijke γδ T-cellen kunnen herkennen en reageren op een breed scala van stress-geïnduceerde antigenen, waardoor het ontwikkelen van aangeboren brede anti-tumor-en anti-infectueuze activiteit. 1 De meerderheid van de γδ T-cellen in het perifere bloed hebben de Vγ9Vδ2 T-cel-receptor. Deze cellen herkennen antigeen in een grote histocompatibiliteitscomplex-onafhankelijke wijze en ontwikkelen van sterke cytolytische en Th1-like effector functies. 1 Daarom, γδ T-cellen zijn aantrekkelijke kandidaat effector cellen voor immunotherapie van kanker. Vγ9Vδ2 T-cellen reageren op phosphoantigens zoals (E)-4-hydroxy-3-methyl-but-2-enyl pyrofosfaat (HMBPP), dat wordt gesynthetiseerd in bacteriën via isoprenoide biosynthese, 2 en isopentenyl pyrofosfaat (IPP), dat wordt geproduceerd in eukaryote cellen door middel van de mevalonate pad. 3 In fysiologische toestand, de generatie van het IPP in nontransformed cel is niet voldoende voor de activatie van γδ T-cellen. Ontregeling van mevalonaat route in tumorcellen leidt tot een ophoping van IPP en γδ T-cellen te activeren. 3 Omdat aminobifosfonaat (zoals pamidronaat of zoledronaat) remmen farnesyl pyrofosfaat synthase (FPP), het enzym optreedt stroomafwaarts van IPP in de mevalonate route, intracellulaire niveaus van IPP en sensitibity te γδ T-cellen erkenning kan therapeutisch worden verhoogd door aminobifosfonaat. IPP accumulatie is minder efficiënt in nontransfomred cellen dan tumorcellen met een farmacologisch relevante concentratie van aminobifosfonaat, die ons in staat immunotherapie voor kanker door het activeren van γδ T-cellen met aminobifosfonaat. 4 Interessant, IPP zich ophoopt in monocyten wanneer PBMC worden behandeld met aminobifosfonaat, omwille van een efficiënte drug opname door deze cellen. 5 Monocyten die IPP accumuleren worden antigeen-presenterende cellen en stimuleren Vγ9Vδ2 T-cellen in het perifere bloed. 6 Op basis van deze mechanismen, hebben we een techniek ontwikkeld voor grootschalige uitbreiding van γδ T-celculturen met behulp van zoledronaat en interleukine -2 (IL-2). 7 Andere methoden voor de uitbreiding van γδ T-cellen maken gebruik van de synthetische phosphoantigens bromohydrin pyrofosfaat (BrHPP) 8 of 2-methyl-3-butenyl-1-pyrofosfaat (2M3B1PP). 9 Al deze methoden ex toelaten vivo-expansie, wat resulteert in grote aantallen γδ T-cellen voor gebruik in de adoptieve immunotherapie. Echter alleen zoledronaat is een FDA-goedgekeurde commercieel verkrijgbaar reagens. Zoledronaat-geëxpandeerde γδ T-cellen weer te geven CD27 - CD45RA - effector geheugen fenotype en hun functie kan worden geëvalueerd door IFN-γ productie test 7.
Protocol
1. Isolatie van PBMC
- Draw bloed (7.5-8.0 ml) in een BD Vacutainer CPT celpreparaat Tube met Sodium Heparine. De buis bevat een natrium-heparine en een Ficoll-Hypaque dichtheid vloeistof, plus een polyester gel barrière die de twee vloeistoffen scheidt. Centrifugebuis / bloed bij kamertemperatuur (18 ° C tot 25 ° C) in een horizontale rotor (swing-out head) gedurende 20 min bij 1800 x g. Schakel centrifuge remmen uit.
- Na het centrifugeren, de volgorde van lagen gebeurt als volgt (van boven naar beneden): a) plasma - b) perifere bloed mononucleaire cellen (PBMC) en bloedplaatjes - c) dichtheid oplossing - d) polyester gel - e) granulocyten - f) rode bloedcellen (afb. 1).
- Verzamel een fractie van het plasma laag, waardoor 5 tot 10 mm van plasma boven de interfase zonder de cellaag. Het plasma kan worden gebruikt voor de cultuur (paragraaf 2.5).
- Oogst de verrijkte fractie (PBMC) aan de interfase met een pipet en over te dragen aan een 15 ml conische buis.
- Was de PBMC met 10 ml fosfaat-gebufferde zoutoplossing (PBS), door het omkeren van de buis 5 keer, en centrifugeer 5 minuten bij 400 x g.
- Tweemaal herhalen wassen stappen uit, waarna resuspendeer de celpellet in 5 ml PBS. Bepaal het aantal cellen. Meestal 1,3 x10 6 cellen worden gewonnen uit een ml volbloed.
- Bepaal de frequentie en fenotype van γδ T-cellen in PBMC door flowcytometrie (deel 3) (afb. 2).
2. Uitbreiding van γδ T-cellen
- Centrifuge celsuspensies in 15 ml conische buizen gedurende 5 min bij 400 x g bij kamertemperatuur, en gooi de supernatant.
- Bereid kweekmedium (CM) door het toevoegen van humaan IL-2 (IL-2) en zoledronaat (Zometa) tot eindconcentraties van 1000 IU / ml en 5 uM, respectievelijk. ALyS203 (Cell Science & Technology Institute) of OPTMIZER (Invitrogen) media ondersteunen een goede uitbreiding van γδ T-cellen (meer informatie in de referenties 6 en 9). Zometa wordt geleverd in vloeibare vorm (4 mg/5-ml flacon). Ter voorbereiding op een 5 uM oplossing, voeg 50 ul van Zometa tot 30 ml kweekmedium.
- Resuspendeer celpellet in kweekmedium en aan te passen aan 1x10 6 cellen / ml.
- Pipetteer 1 ml van de CM met 1x10 6 cellen in elke well van een 24-well plaat. Voor grootschalige culturen, kunnen cellen worden gezaaid op 0,5 x 10 6 cellen / cm 2 op basis van de oppervlakte van de plaat putten, gerecht, of de kolf.
- Dus voeg autoloog plasma (paragraaf 1.3), gepoolde humane AB sera, of FCS dat het ongeveer 10% van het volume van de cultuur (100 pi voor elk putje van een 24-wells plaat). Leg de platen in een vochtige 37 ° C, 5% CO 2 incubator gedurende 24-48 uur.
- Handhaving van de cultuur op een cel dichtheid van 0,5 tot 2 x 10 6 cellen / ml. Voeg vers medium met humaan IL-2 (1000 IU / ml) alleen (zonder Zometa) om de 2-3 dagen, en overdracht van gekweekte cellen in nieuwe putten of flessen nodig, afhankelijk van de mate van celproliferatie (afb. 3). Levering plasma of serum aan het medium, zodat de serumconcentratie kan worden gehandhaafd ten minste 1%.
- Oogst cellen op dag 12-14 en bepalen de frequentie, fenotype, en de functies van γδ T-cellen door flowcytometrie (zie hieronder).
3. Fenotypische analyse door flowcytometrie
- Transfer 200 ul monsters die 2 x 10 5 cellen om fluorescentie-geactiveerde cel sortering (FACS) buizen.
- Voeg 2 ml koud PBS en centrifugeer 5 minuten bij 400 x g. Dan, resuspendeer de pellets in 50 ul FACS buffer (PBS + 1% FCS + 0,1% natriumazide). Voeg 5 ul van elk antilichamen tegen de monsters (de monoklonale antilichamen zijn vermeld in tabel 1).
- Incubeer op ijs in het donker gedurende 20 minuten.
- Voeg 2 ml FACS buffer aan elk monster, en vervolgens vortex. Centrifuge monsters gedurende 5 min bij 400 x g bij 4 ° C. Decanteer zorgvuldig het supernatant.
- Resuspendeer de cellen in 300 ul FACS buffer en vortex. Analyseer monsters op een flowcytometer (afb. 2).
4. IFN-γ productie test 10
- De dag voor test, voor te bereiden stimulator cellen door het kweken van 3-5 x10 5 Daudi cellen / ml in RPMI 1640 medium plus 10% FCS (RPMI-10) 's nachts met Zometa (5 uM) (hierna aangeduid Z-Daudi).
- Verzamel Z-Daudi en resuspendeer in RPMI-10 op 2x10 6 cellen / ml. Voeg 100 ul van de Z-Daudi (2x10 5) aan elk putje van een ronde bodem 96-well plaat.
- Bereid γδ T-cellen op 2x10 6 cellen / ml in RPMI-10 bevat Brefeldine A bij 20 ug / ml. Breng 100 ul van γδ T-cel suspensie (2x10 5) aan elk putje met Z-Daudi cellen of om putten (100 ul RPMI-10 alleen, of RPMI-10 met 20 ng / ml forbol 12-myristaat 13-acetaat controle[PMA] plus 2 ug / ml van ionomycine).
- Meng door en neer te pipetteren meerdere malen. Incubeer gedurende 4 uur in een 37 ° C, 5% CO 2 incubator.
- Centrifugeer de plaat gedurende 5 minuten bij 400 x g bij 4 ° C en resuspendeer de pellets in 200 ul van koude PBS.
- Breng de monsters naar FACS buizen. Voeg 4 ml van de koude PBS en centrifugeer de buizen gedurende 5 min bij 400 x g bij 4 ° C.
- Resuspendeer de pellets in 50 ul van de FACS-buffer met FITC-geconjugeerd anti-TCRVγ9 (5 pl) en PE/Cy5-conjugated anti-CD3 mAb (2,5 pl). Incubeer beschermd tegen licht gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur.
- Voeg 100 ul van IntraPrep reagens 1 en incubeer gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur. Voeg 4 ml PBS aan elke buis en centrifugeer gedurende 5 minuten bij 400 x g bij kamertemperatuur.
- Verwijder de bovenstaande vloeistof door aspiratie en voeg 100 ul van IntraPrep reagens 2. Incubeer 5 min bij kamertemperatuur zonder schudden.
- Voeg 5 ul van PE-geconjugeerd anti-IFN-γ mAb aan de reageerbuis. Incubeer beschermd tegen licht gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur.
- Voeg 4 ml PBS aan elke buis en centrifugeer gedurende 5 minuten bij 400 x g bij kamertemperatuur. Verwijder de bovenstaande vloeistof door aspiratie en resuspendeer de cel pellet in 0,5 ml FACS buffer.
- Analyseer de cellen door flowcytometer. Poort op CD3 + TCRVγ9 + cellen en onderzoekt de expressie van IFN-γ (afb. 4).
5. Representatieve resultaten:
Het is belangrijk om het percentage van γδ T-cellen in PBMC bepalen aan het begin van de cultuur. Zoals getoond in Fig. 2 A, het percentage van de CD3 + + TCRVγ9 γδ T-cellen in PBMC was 1,6% op dag 0. De dominante bevolkingsgroepen werden CD27 + + CD45RA naïef of CD27 + CD45RA - centrale geheugen fenotypes. Wanneer γδ T-cellen efficiënt gestimuleerd werden, vormden zij clusters op dag 3-5 (afb. 3 A en B). Toen clustervorming werd uitgesteld, de groei van andere celtypen, zoals CD4 + en CD8 + T-cellen of αβ NK-cellen kunnen de groei van γδ T-cellen (Fig. 3 C en D) domineren. Na 14 dagen van de cultuur, de frequentie van γδ T-cellen steeg tot meer dan 93,8% van de gekweekte cellen in een succesvolle γδ T-celculturen (fig. 2 E). De gekweekte γδ T-cellen opgereguleerd NKG2D en CD69 expressie (afb. 2 G en H). Ze worden weergegeven CD27 - CD45RA - effector geheugen fenotype (afb. 2 F). De functies van γδ T-cellen werden geëvalueerd met betrekking tot de cytokine productie en cytotoxiciteit. De intracellulaire IFN-γ vlekken aangetoond dat γδ T-cellen IFN-γ geproduceerd in reactie op de PMA / ionomycine behandeling of Z-Daudi cellen die opgebouwd IPP na zoledronaat behandeling (afb. 4). Deze resultaten geven aan dat zoledronaat efficiënt kunnen stimuleren en uit te breiden functionele γδ T-cellen.
| buis | FITC | PE | ECD | PE/Cy5 |
| 1 | CD3 | CD19 | CD45 | CD14 |
| 2 | CD3 | TCRαβ | CD4 | CD8 |
| 3 | CD3 | CD56 | ||
| 4 | TCR Vγ9 | TCRαβ | CD45 | CD3 |
| 5 | TCR Vγ9 | NKG2D | ||
| 6 | TCR Vγ9 | CD69 | ||
| 7 | TCR Vγ9 | muis IgG1 | ||
| 8 | TCR Vγ9 | CD45RA | CD27 | |
| 9 | TCR Vγ9 | muis IgG1 | muis IgG1 |
Tabel 1. Monoklonale antilichamen gebruikt in de meerkleurige kleuring van γδ T-cellen. Een voorbeeld van de fenotypische analyse van γδ T-cellen uitgevoerd in ons laboratorium wordt getoond in Fig. 2.
Figuur 1. Scheiding van PBMC. Bloed (7,5-8,0 ml) wordt getrokken in een BD Vacutainer CPT celpreparaat Tube met natriumheparine en direct gecentrifugeerd gedurende 20 min bij 1800 x g. Na het centrifugeren, de resulterende lagen gezien vanaf boven naar bottom: a) Plasma - b) PBMC en bloedplaatjes - c) Dichtheid oplossing - d) Polyester gel - e) Granulocyten - f) rode bloedcellen.
Figuur 2. Typische oppervlakte fenotype van γδ T-cellen. PBMC werden gestimuleerd met zoledronaat en IL-2 voor 14 dagen. Cellen werden gekleurd met FITC-gelabeld anti-TCR Vγ9 en PE/Cy5-labeled anti-CD3 aan de uitbreiding van γδ T-cellen (A en E) monitor. γδ T-cellen werden geïdentificeerd door hun expressie van TCRVγ9, en hun expressie van CD27 en CD45RA (B en F), NKG2D (C en G), of CD69 (D en H) werd onderzocht.
Figuur 3. Vertegenwoordiger γδ T-cel-culturen. PBMC werden gestimuleerd met IL-2 (1000 IU / ml) en zoledronaat (5 uM). Representatieve velden worden weergegeven (IX71 omgekeerde microscoop [Olympus] x 200). Clusters en aggregaten van γδ T-cellen kunnen worden waargenomen op dag 3 (A) en dag 5 (B), wanneer γδ T-cellen met succes werden uitgebreid. Daarentegen werden er geen clusters of aggregaten waargenomen wanneer γδ T-cel-groei is niet voldoende (C en D).
Figuur 4. IFN-γ productie. γδ T-cellen werden geïncubeerd met RPMI-10 alleen (A) of PMA / ionomycine (B) of Z-Daudi (C) voor 4 uur. Eerst werd oppervlakte-expressie van TCRVγ9 gekleurd en IFN-γ toen de productie werd onderzocht door IFN-γ intracellulaire kleuring.
Figuur 5. Kinetiek van γδ T-cel cultuur. (A) Absoluut aantal van de gekweekte cellen, (B) percentage van de γδ T-cellen, en (C) absolute aantal γδ T-cellen op de aangegeven tijdstippen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De hier gepresenteerde methode maakt een efficiënte uitbreiding van γδ T-cellen uit PBMC. γδ T-cellen geactiveerd en uitgebreid door zoledronaat en IL-2 te ontwikkelen compleet effector functies, weergegeven door cytokine productie en cytotoxiciteit. Het is gemeld dat de synthetische phosphoantigens bromohydrin pyrofosfaat (BrHPP) en 2-methyl-3-butenyl-1-pyrofosfaat (2M3B1PP) ook uit te breiden γδ T-cellen, maar ze zijn niet commercieel beschikbaar. In tegenstelling, is zoledronaat al een licentie voor klinische toepassingen als Zometa. Daarom is een betrouwbare reagens is gemakkelijk beschikbaar zijn.
De selectie van de cultuur media en serum is van cruciaal belang. Gebruik de juiste cultuur media zoals ALyS203 (Cell Science & Technology Institute) of OPTMIZER (Invitrogen) voor een succesvolle γδ T-cel expansie. 11 Controleer of autoloog plasma, kan gepoolde humane AB sera of FCS ondersteuning γδ T-cel-cultuur. Bedenk ook dat PBMC van een aantal donoren niet reageren op zoledronaat stimulatie, ongeacht andere cultuur reagentia. Als dat gebeurt, de enige optie is het wijzigen van de donor.
Zoals we hebben laten zien, was de verrijking van γδ T-cellen relatief vroeg bereikt, bijna 80% van de gekweekte cellen werden γδ T-cellen op dag 7. γδ T-cellen blijven prolifereren tot 12-14 dagen (afb. 5). Ongeveer 2,2 x 10 8 γδ T-cellen kunnen worden verkregen bij 1 x 10 6
PBMC met 1,6 x 10 4 γδ T-cellen. Deze cultuur methode is gebruikt in de fase I klinische studies ter beoordeling van de veiligheid en de haalbaarheid van zoledronaat-geëxpandeerde γδ T-cel-overdracht therapie bij patiënten met multipel myeloom of longkanker. 12,13
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Geen belangenconflicten verklaard.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| ZOMETA | Novartis AG | zoledronate | |
| PROLEUKIN | Novartis AG | human recombinant IL-2 | |
| BD Vacutainer CPT Cell Preparation Tube with Sodium Heparin | BD Biosciences | 362753 | |
| RPMI1640 | Invitrogen | 21870-076 | |
| ALyS203- medium | Cell Science & Technology Institute | 0301-7 | |
| OpTmizer | Invitrogen | 0080022SA | |
| brefeldin A | Sigma-Aldrich | B5936-200UL | |
| phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA) | Sigma-Aldrich | P1585-1MG | |
| ionomycin | Sigma-Aldrich | 13909-1ML | |
| IntraPrep | Beckman Coulter Inc. | A07803 | |
| anti-human CD3-FITC or PE/Cy5 | Beckman Coulter Inc. | A07746 FITC A07749 PE/Cy5 | |
| anti-human CD4-ECD | Beckman Coulter Inc. | 6604727 | |
| anti-human CD8-PE/Cy5 | Beckman Coulter Inc. | 6607011 | |
| anti-human CD14-PE/Cy5 | Beckman Coulter Inc. | A07765 | |
| anti-human CD19-PE | Beckman Coulter Inc. | A07769 | |
| anti-human CD45-ECD | Beckman Coulter Inc. | A07784 | |
| anti-human CD56-PE/Cy5 | Beckman Coulter Inc. | A07789 | |
| anti-human TCRαβ-PE | Beckman Coulter Inc. | A39499 | |
| anti-human TCR Vγ9-FITC | Beckman Coulter Inc. | IM1463 | |
| anti-human CD27-PE/Cy5 | Beckman Coulter Inc. | 6607107 | |
| anti-human CD45RA-ECD | Beckman Coulter Inc. | IM2711 | |
| anti-human CD69-PE | BD Biosciences | 555531 | |
| anti-human NKG2D-PE | Beckman Coulter Inc. | A08934 | |
| Anti-humal IFNγ-PE | Beckman Coulter Inc. | IM2717U | |
| Mouse IgG1 isotype control-PE | Beckman Coulter Inc. | A07796 | |
| Mouse IgG1 isotype control-ECD or PE/Cy5 | Beckman Coulter Inc. | A07797A07798 |
References
- Bonneville, M., O'Brien, R. L., Born, W. K. γ T cell effector functions: a blend of innate programming and acquired plasticity. Nat Rev Immunol. 10, 467-478 (2010).
- Hintz, M. Identification of (E)-4-hydroxy-3-methyl-but-2-enyl pyrophosphate as a major activator for human γδ T cells in Escherichia coli. FEBS Lett. 509, 317-322 (2001).
- Gober, H. J. Human T cell receptor γδ cells recognize endogenous mevalonate metabolites in tumor cells. J Exp Med. 197, 163-168 (2003).
- Kabelitz, D., Wesch, D., He, W. Perspectives of gammadelta T cells in tumor immunology. Cancer Res. 67, 5-8 (2007).
- Roelofs, A. J. Peripheral blood monocytes are responsible for gammadelta T cell activation induced by zoledronic acid through accumulation of IPP/DMAPP. Br J Haematol. 144, 245-250 (2009).
- Dieli, F. Induction of γδ T-lymphocyte effector functions by bisphosphonate zoledronic acid in cancer patients in vivo. Blood. 102, 2310-2311 (2003).
- Kondo, M. Zoledronate facilitates large-scale ex vivo expansion of functional γδ T cells from cancer patients for use in adoptive immunotherapy. Cytotherapy. 10, 842-856 (2008).
- Espinosa, E. Chemical synthesis and biological activity of bromohydrin pyrophosphate, a potent stimulator of human γδ T cells. J Biol Chem. 276, 18337-18344 (2001).
- Kobayashi, H. Safety profile and anti-tumor effects of adoptive immunotherapy using γδ T cells against advanced renal cell carcinoma: a pilot study. Cancer Immunol Immunother. 56, 469-476 (2007).
- Murali-Krishna, K. Counting antigen-specific CD8 T cells: a reevaluation of bystander activation during viral infection. Immunity. 8, 177-187 (1998).
- Sato, K. Impact of culture medium on the expansion of T cells for immunotherapy. Cytotherapy. 11, 936-946 (2009).
- Abe, Y. Clinical and immunological evaluation of zoledronate-activated Vγ9 γδT-cell-based immunotherapy for patients with multiple myeloma. Exp Hematol. 37, 956-968 (2009).
- Nakajima, J. A phase I study of adoptive immunotherapy for recurrent non-small-cell lung cancer patients with autologous γδ T cells. Eur J Cardiothorac Surg. 37, 1191-1197 (2010).
