Summary
Die Dissektionstechnik zeigt Enukleation der Maus Auge für Gewebefixierung um Phänotypisierung in Hochdurchsatz-Screening durchzuführen.
Abstract
Die Maus Auge ist ein wichtiges genetisches Modell für die translationale Erforschung der menschlichen Augenerkrankung. Blendende Erkrankungen beim Menschen, wie Makuladegeneration, Photorezeptordegeneration, Katarakt, Glaukom, Retinoblastom, und diabetische Retinopathie haben in transgenen Mäusen wurde rekapituliert. 1-5 meisten transgenen und Knockout-Mäuse von Laboratorien erzeugt wurden auf nicht-ophthalmologische Krankheiten zu studieren, aber Generhaltung zwischen Organsysteme lässt vermuten, dass viele der gleichen Gene können auch eine Rolle bei der Entwicklung und okulare Krankheit. Daher stellen diese Mäuse eine wichtige Ressource für die Entdeckung neuer Genotyp-Phänotyp-Korrelationen in die Augen. Da diese Mäuse auf der ganzen Welt verstreut sind, ist es schwierig, zu erwerben, zu halten und Phänotyp sie in eine effiziente, kostengünstige Weise. So sind die meisten High-Throughput-ophthalmologische Phänotypisierung Bildschirmen auf wenige Standorte, die vor Ort, ophthalmologische Know-how erfordern beschränkt Augen in lebenden Mäusen zu untersuchen. 6-9 Ein alternativer Ansatz in unserem Labor entwickelt wurde, ist eine Methode für Remote Gewebe-Übernahme, die in großen oder kleinen Erhebungen der transgenen Maus Augen verwendet werden können. Standardisierte Verfahren für Video-basierte chirurgische Fachwissen, Gewebefixierung und Versand ermöglichen jedem Labor zu ganzen Augen von mutierten Tiere zu sammeln und senden Sie sie für molekulare und morphologische Phänotypisierung. In diesem Video Artikel präsentieren wir Techniken, um entkernen und übertragen sowohl fixierten und Perfusion festen Mäuseaugen für Remote Phänotypisierung Analysen.
Protocol
Ein. Blunt Dissection: Enukleation der Maus Auge fixierten Proben
- Auseinanderziehen die Augenlider, um die Exposition und den Zugang zu den hinteren Globus (Augapfel) Oberfläche zu verbessern.
- Legen Sie eine gebogene Verband forcep hinter (unter) den Globus in der Umlaufbahn (Augenhöhle). Die Mahajan Sharptip Verband forcep ist ein Brauch Instrument mit Spitzen um diesen Schritt zu erleichtern (siehe Materialien und Reagenzien Tabelle).
- Schließen Sie die Zange und fassen Sie den Orbital Bindegewebe und Sehnerv hinter dem Globus, während sie vorsichtig, um zu vermeiden, drückte den Globus.
- Ziehen Sie die Zange nach oben und reißen den Augapfel aus der Augenhöhle. Die weißen Faden-ähnliches Gewebe ist der Sehnerv.
- Legen Sie das Auge in PBS. Mit einer 30-Gauge-Nadel, machen eine einzige Stichwunde unmittelbar hinter dem Limbus durch Einführen der Nadel 1-2 mm in den Augapfel. Dies ermöglicht Fixiermittel, wie Glutaraldehyd, die sonst nicht in der Lage, um das Auge Gewebe zu durchdringen sind, um direkt enter das Auge. Schaffung dieses Einstichwunde eventuell nicht notwendig, wenn ein Fixiermittel wie Paraformaldehyd oder Alkohol, in der Lage ist Diffundieren in Augengeweben von Interesse.
- Legen Sie das gesamte Auge sofort in Fixativ für Tauch-Fixierung.
2. Sharp Dissection: Enukleation der Maus eye folgenden Perfusionsfixierung
- Verwenden Sie eine gekrümmte colibri forcep um das Augenlid entfernt von der Welt zu halten.
- Orient gekrümmten Westcott Dissektion Schere parallel zu den Globus beim Zielen in Richtung der Rückseite der Bahn.
- Schneiden Sie die feste Bindegewebe, das die Welt umgibt aus den minderwertigen, medial, überlegen, und Seitenflächen.
- Legen Sie die gebogenen Pinzette hinter den Globus, fassen das Bindegewebe, ohne Druck auf der ganzen Welt, und nach vorne ziehen, um das Auge entkernen. Da die Orbital Bindegewebe steif Perfusionsfixierung können zusätzliche Schneiden von Orbital Gewebe notwendig sein, komplett loslassen globE.
3. Fixation und Verpackung
Versand von festen Geweben folgen müssen Ihren institutionellen und Postdienst Anforderungen einschließlich geeigneter Etiketten und Verpackungen. Das folgende Protokoll ist ein Beispiel des Versendens eines nicht-infektiösen biologischen Probe bei Umgebungstemperatur. Dies erfordert 3 Schichten der Verpackung, aber keine Klasse A / B biologische Substanz oder flüssigem Stickstoff Etiketten.
- Legen Sie das Auge in einer 5-mL Glasszintillationsröhrchen mit mindestens 3-mL Fixativ, oder post-Fixateur-Puffer, wenn die Fixierung ist kurz. Schreiben Sie die Tracking-Nummer auf dem Deckel des Fläschchens und verschließen Sie diese mit Parafilm.
- Ort Szintillationsgefäße in einer biologischen Probe geeigneten Behälter. Im Institut, erfordern zum Beispiel zugelassenen Behältern drei Schichten: einen abgedichteten Behälter, in dem die Probe platziert ist, eine absorbierende mittlere Schicht und eine schützende Deckschicht.
- Stellen Sie den Behälter in eine Luftpolsterfolie Paket und dann in einer Appschweiften Labor Transportbehälter zusammen mit den entsprechenden Unterlagen.
4. Repräsentative Ergebnisse
Die histologische Untersuchung der Augen können durch eine Vielfalt von Verfahren einschließlich Hämatoxylin und Eosin-Färbung, enzymatische Nachweis Expression, Transmissionselektronenmikroskopie und Immunhistochemie erfolgen. Nach dem Eintauchen Fixierung in 4% Paraformaldehyd wurde Gewebe in Paraffin und geschnitten auf einem Mikrotom eingebettet. In Hochdurchsatz-Phänotypisierung analysieren wir Schüler-Sehnervs Abschnitte, die Probe alle Gewebearten im Auge (Abbildung 1). Gewebestücke wurden auch für lacZ-Expression (Abbildung 2), Transmissionselektronenmikroskopie von Zellorganellen (Abbildung 3), und die Expression von spezifischen Molekülen mit Antikörpern (Abbildung 4) geprüft.
In unserem Phänotyp Screeningverfahren, war es nicht wichtig, Orientierung des Auges in Bezug auf die Nasen (medialen Augenwinkel) und zeitliche aufrechtzuerhalten (lateral Augenwinkel) Seiten. Es gibt mindestens zwei Optionen, wenn Auges Orientierung erforderlich ist. Nach Enukleation, haben wir Licht Kauter auf die zeitliche Hornhaut am 03.00 Position mit einem Handheld-Kauter Gerät. Die Läsion ist offensichtlich auf Histologie und nicht während der Verarbeitung, wie histologische Tinten verloren gehen. Der Nachteil ist, dass Kauter schädigt die Hornhaut, die eine kritische Gewebe für eine Untersuchung sein kann. Die andere Option erfordert einen erfahrenen Anatomen, die die Augenmuskeln Insertionen identifizieren können. Unter einem Stereomikroskop, markiert Identifizierung des unteren und oberen schrägen Muskel Einsetzen der unteren und oberen und Aspekt des Globus. 3 Mit jeder Orientierung Verfahrens ist es wichtig, die Probe als rechte oder linke Auge verfolgen. Gemeinsam werden diese Exact Globe Orientierung vor lassen Schneidens.
Abbildung 1. Maus Auge histologische Bilder afte r Remote-Akquisition. Maus Augen waren durch scharfe Dissektion nach Perfusionsfixierung mit 4% Paraformaldehyd enukleiert. A. Schüler-Sehnervs Abschnitt mit Hämatoxylin und Eosin gefärbt zeigt Erhaltung aller Gewebe Unterkonstruktionen. ON, Sehnerv. (Grün Maßstab = 500 Mikron) B. Eine stärkere Vergrößerung Ansicht des normalen Netzhaut zeigt seine Schichtstruktur: RGC, retinalen Ganglienzellen, IPL, inneren plexiformen Schicht; INL, innere Körnerschicht; OPL, plexiformen Schicht; ONL, äußere Körnerschicht (Sehzellen) (Pfeil); IS, Photorezeptor inneren Segmente (Pfeilspitze); OS, Photorezeptor äußeren Segmente, RPE, Pigmentepithel; C, Aderhaut. (Grün-Skala bar = 50 Mikron) C. der normalen Netzhaut ist im Vergleich dieser Probe dünner aufgrund Photorezeptordegeneration. Die ONL, IS und OS fehlen völlig (Pfeil). (Grün-Skala bar = 50 Mikron)
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Abbildung 2. LacZ-Expression in transgenen Mäusen. Augen wurden stumpf enukleiert und eingetaucht in 1 mg / ml X-gal-Lösung (5 mM K3Fe (CN) 6, 5 mM K4Fe (CN) 6, 2 mM MgCl2, 0,02% NP40 und 0,1% Natriumdesoxycholat) über Nacht bei 37 ° C. Augen wurden in 2% formaldehyde/0.2% Glutaraldehyd für 30 Minuten und auf einem Mikrotom geschnitten fixiert. X-gal Produkt (blau) Etiketten: A. Ziliarepithel, B. Hornhautepithel, und C. die retinalen Ganglienzellen (RGC) in der Netzhaut. INL, innere Körnerschicht; ONL, äußeren Körnerschicht.
Abbildung 3. Transmissionselektronenmikroskopie des retinalen Pigmentepithels (RPE). Nach stumpf und die Schaffung einer Stichwunde, waren Augen Eintauchen in 2,5% Paraformaldehyd / 2,5% Glutaraldehyd in 0,1 M Natriumphosphatpuffer fixiert. Augen waren gebrauchtdarily in 1% Osmium textroxide fixiert, schrittweise entwässert, und in Spurr das Harz. Gewebe wurde bei 90 nm geschnitten und gelegt auf Kupfer Schlitz Gittern in Formvar abgedeckt und abgebildet mit einem Transmissions-Elektronen-Mikroskop. Die Aufnahme zeigt, Photorezeptor äußeren Segmente des Neuroretina, Melanosomen (M) innerhalb des retinalen Pigmentepithels und der Bruch-Membran.
Abbildung 4. Immunhistochemische Kennzeichnung von Superoxiddismutase-3 (grün) in der Maus Glaskörper. Augen wurden durch stumpfe Dissektion entkernt und unterzog Eintauchen Fixierung in 4% Paraformaldehyd. Sie wurden in Paraffin und unter Verwendung eines Mikrotoms geschnitten eingebettet. Gewebeschnitte wurden mit polyklonalem Kaninchen-Antiserum inkubiert SOD3 1:50 verdünnt. SOD3 Expression wurde unter Verwendung eines Ziegen-Anti-Kaninchen-IgG (H + L)-Alexa Fluor 488 konjugierten sekundären Antikörper. Kennzeichnung von SOD3 in gre angezeigten.
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Discussion
Die meisten transgenen Mäusen gibt es in Laboratorien, die nicht prüfen müssen die Augen. Unsere Video-Technik stellt eine einfache, standardisierte Methode zur Remote-chirurgischen Fähigkeiten Übertragung von Gewebe Akquisition von Laboratorien mit wenig Erfahrung mit den Augen zu optimieren. Dieses Video-Technik hilft bei der Bewältigung einer großen Sünden in High-Throughput-Phänotypisierung, die Verwendung einer begrenzten Anzahl von Experten Standorten aufgrund der nicht-standardisierten Gewebe Sammlung und Fixierung Methoden, die aussagekräftige vergleichende phänotypischen und molekularen Untersuchungen zu verhindern. Zur Schaffung und Aufrechterhaltung der Qualitätskontrolle bei jeder neuen Remote-Labor und Techniker, ist es wichtig zu Wildtyp-Augen am Anfang und in regelmäßigen Abständen während der Studie gehören. Wir haben auch herausgefunden, dass ein Tracking-System ist wichtig, wenn mehrere Augen von verschiedenen Genotypen wurden transferiert, wie beispielsweise ein Web-basierten System, um eine eindeutige Identifikationsnummer für jedes Auge zuordnen. Obwohl höhere Qualität Fixierung und anschließender Gewebeschnitte mit erhaltenPerfusion-fixierten Tiere, finden wir, dass Proben von nicht fixierten Tieren enukleiert ausreichend für die meisten morphologischen und molekularen Studien sind. Außerdem kann Erwerb Augen von Tieren unfixierten deutlich einfacher in Hochdurchsatz-Untersuchungen von verschiedenen Quellen verarbeiten. Transgene Mäuse sind ein wichtiges Instrument für die Untersuchung von menschlichen Augenerkrankung, 10, 11 und Remote-Gewebe Akquisition für lokale Phänotypisierung macht das Beste aus dieser wertvollen Ressource. Die Anwendung einer ähnlichen Strategie für Gewebedissektion und Austausch können einen wichtigen Einfluss auf Hochdurchsatz-Phänotypisierung von nicht-ophthalmologische Gewebe.
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Disclosures
Keine Interessenskonflikte erklärt.
Acknowledgments
Forschung zur Erblindung verhindern; Bartly J. Mondino MD, Direktor des Jules Stein Eye Institute, UCLA, und Ramiro Ramirez-Solis, Jacqui White, and Jeanne Estabel am Sanger Institute, Wellcome Trust Genome Campus. Diese Forschung entspricht der ARVO Statement für die Verwendung von Tieren in Ophthalmic und Visual Research.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Curved Dressing Forcep | Storz Ophthalmics | E1408 | |
| Mahajan Sharptip dressing forcep | Storz Ophthalmics | E1406 (REF SP7-64520) | |
| Curved Westcott Scissors | Storz Ophthalmics | E3321 WH | |
| 15° BD Beaver Microsurgical Blade | BD Biosciences | 374881 | |
| 0.22 Fine-Castroviejo Suturing Forceps | Storz Ophthalmics | E1805 | |
| 0.12 Colibri forceps | Storz Ophthalmics | 2/132 | |
| 30-gauge needle | BD Biosciences | 305128 | |
| Biohazard Mailer | Fisher Scientific | 03-523-4 | |
| Parafilm | Fisher Scientific | 13-374-10 | |
| Glass scintillation vials | Wheaton | 4500413033 | |
| PBS, pH 7.4 | Invitrogen | 70011-044 | |
| 16% Paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 15700 | |
| 2.5% Paraformaldehyde/ 2.5% Glutaraldehyde in 0.1M sodium phosphate buffer | Electron Microscopy Sciences | 15700 & 16300 | Mixed in laboratory |
| 50% Glutaraldehyde | Electron Microscopy Sciences | 16300 | |
| 0.25% Formvar | Electron Microscopy Sciences | 15810 | |
| Copper Slot Grid | Electron Microscopy Sciences | M2010-CR | |
| 4% Osmium Tetroxide | Electron Microscopy Sciences | 19140 | |
| Anti-SOD3 antibody | Abcam | Ab21974 | |
| Goat anti-rabbit Alexa Fluor 488 | Invitrogen | A11070 | |
| Spurr’s embedding resin | Electron Microscopy Sciences | 14300 |
References
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