Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Medicine
Click here for the English version

Medicine

Hyperinsulinemic - سوي سكر الدم في الفئران المشابك ، وإدراكا بلا حدود

Published: November 16, 2011 doi: 10.3791/3188
Automatic Translation
1, 2,3, 3, 2,3, 3, 4, 2,3, 2,3
1Diabetes and Obesity Research Center, Sanford-Burnham Medical Research Institute at Lake Nona, 2Department of Molecular Physiology and Biophysics, Vanderbilt University School of Medicine, 3Vanderbilt Mouse Metabolic Phenotyping Center, Vanderbilt University School of Medicine, 4Department of Pediatrics and Cellular and Integrative Physiology, Indiana University School of Medicine

Summary

المشبك hyperinsulinemic - سوي سكر الدم ، أو المشبك الانسولين ، هي المعيار الذهبي لتقييم عمل الانسولين

Abstract

ويتميز السكري من النوع 2 من خلل في عمل الأنسولين. ويعتبر على نطاق واسع ، المشبك hyperinsulinemic سوي سكر الدم ، أو المشبك الانسولين ، و "المعيار الذهبي" لتقييم طريقة عمل الانسولين في الجسم الحي. خلال المشبك الانسولين ، ويتحقق من فرط ضخ الانسولين ثابتا. يتم الاحتفاظ سوائية سكر الدم عن طريق ضخ الجلوكوز يصاحب ذلك بمعدل متغير. ويحدد هذا المتغير معدل ضخ الجلوكوز (جير) عن طريق قياس نسبة السكر في الدم على فترات قصيرة في كافة مراحل التجربة وضبط جير تبعا لذلك. وجير يدل على عمل الانسولين في الجسم بأكمله ، والفئران مع تعزيز عمل الانسولين تتطلب أكبر جير. يمكن أن تدمج الإدارة المشبك الأنسولين من 2 النظائر [14 جيم] deoxyglucose لتقييم الأنسجة محددة امتصاص الغلوكوز و[3-3 H] الجلوكوز لتقييم قدرة الانسولين لقمع معدل ظهور الجلوكوز الذاتية (endoRa) ، وهو علامة على إنتاج السكر في الكبد ، وحفزمعدل السكر في اختفاء كامل الجسم (الثالثة).

أدى التصغير من المشبك الانسولين لاستخدامها في نماذج الماوس الجيني للأمراض الأيضية لتقدم كبير في مجال البحوث السكري. طرق لأداء المشابك الأنسولين تتفاوت بين المختبرات. ومن المهم أن نلاحظ أن الطريقة التي يتم تنفيذ المشبك الانسولين يمكن أن تؤثر بشكل كبير على النتائج التي تم الحصول عليها. لقد نشرنا تقييم شامل لمناهج مختلفة لأداء المشابك الأنسولين في الفئران واعية 1 وكذلك تقييم الاستجابة الأيضية شيوعا من أربعة سلالات الفطرية الماوس باستخدام تقنيات مختلفة المشبك 2. هنا نطرح على بروتوكول لأداء الأنسولين المشابك على الفئران ، واعية الجامحة التي وضعها مركز فاندربيلت ماوس Phenotyping الاستقلابية (MMPC ؛ URL : www.mc.vanderbilt.edu / mmpc). وهذا يشمل وصفا للطريقة التي استخدمت خلال زرع القسطرة المشبك الانسولين. البروتوكول التي يستخدمهافاندربيلت MMPC يستخدم نظام فريد لمدة 3 القسطرة. يتم إدخال القسطرة واحدة في الوريد الوداجي لدفعات. يتم إدخال القسطرة الثانية في الشريان السباتي ، والذي يسمح لأخذ عينات الدم من دون الحاجة إلى كبح أو التعامل مع الماوس. هذه التقنية توفر ميزة كبيرة إلى الأسلوب الأكثر شيوعا للحصول على عينات من الدم أثناء المشابك الأنسولين الذي هو نموذج من طرف قطعت الذيل. خلافا لهذا الأسلوب الأخير ، وأخذ العينات من القسطرة الشريانية ليست ضاغطة على الماوس 1. وصفنا أيضا أساليب لاستخدام النظائر ضخ التتبع لتقييم الأنسجة محددة عمل الانسولين. كما نقوم بتوفير مبادئ توجيهية مناسبة لعرض النتائج التي تم الحصول عليها من المشابك الانسولين.

Protocol

1. إعداد القسطرة والفأر هوائي للحصول أخذ العينات (افتتحته TM)

  1. تعد القسطرة الشريانية عن طريق إدخال قطعة من الطول 1.3 PE - 10 (0.011 بوصة قطرها الداخلي) في قطعة 6 سم من أنبوب silastic (0،012 قطرها الداخلي بوصة) كما هو مبين في الشكل 1A. شطبة غيض من PE - 10 مع مشرط حتى طولها من نهاية silastic إلى غيض من شطبة هو 0.9 سم.
  2. تعد القسطرة الوريدية عن طريق تحريك قطعة 1 ملم من أنابيب silastic (0.020 بوصة قطرها الداخلي) 1.1 سم من نهاية مشطوف من قطعة 6 سم من أنبوب silastic (0،012 قطرها الداخلي بوصة) كما هو مبين في الشكل 1B. يتم استخدام قطعة من 1 مم silastic كما حبة زجرية.
  3. لإعداد TM افتتحته ، إدراج كل من قطعتين من الطول 1.3 موصلات قياس 25 الفولاذ المقاوم للصدأ في كل من القطع سم 3 من البولي ايثيلين two - 20 (0.015 بوصة قطرها الداخلي).
  4. تأمين PE-20/connectors لبعضها البعض عن طريق تحريك قطعة 5 ملم silasticأنابيب (0،040 قطرها الداخلي بوصة) فوق المنطقة حيث أنابيب الصلب وتلبية PE 20.
  5. ثني أنابيب الصلب إلى زاوية 120 ° ~ ومنفصلة لكل أنبوب بواسطة ~ 45 درجة.
  6. أكمل مكان تلاعب في الكمشه سيليكون لاصقة طبية بحيث PE - 20 الأنابيب الرأسية وينتهي من أنابيب الفولاذ المقاوم للصدأ تتجاوز اصقة (الشكل 1C). يسمح هذا لتعيين ل24H.

2. القسطرة الجراحية

  1. قبل الجراحة ، وتعقيم القسطرة مع الايثانول 70 ٪ ، وملء لهم المالحة heparinized (200 U الهيبارين / المالحة مل) ، وإدراج سدادات الفولاذ المقاوم للصدأ.
  2. تخدير الماوس ، ويفضل استخدام وسيلة من شأنها أن توفر باستمرار عامل مخدر (مثل isoflurane استنشاقه).
  3. باستخدام تقنية معقمة ، إزالة الشعر من شق المواقع باستخدام مقص و / أو كريم مزيل الشعر وتطهير الجلد مع الكحول يعقبه فرك betadine. لالإدراج القسطرة ، إزالة الشعر علىمنطقة تمتد من الفك السفلي إلى الجزء العلوي من القفص الصدري ، وبين الترقوة. للتخارج من القسطرة وراء الرأس ، وإزالة الشعر في المنطقة الواقعة بين قاعدة الجمجمة والمنطقة بين الكتفين وتطهير الجلد مع الكحول يعقبه فرك betadine.
  4. وضع الماوس على ظهره على سطح الاحترار وتحت منطقة عرضها المجهر الجراحي. تأمين الذيل والأطراف مع الشريط الجراحية. تأمين الرأس في مخروط الأنف تسليم التخدير.
  5. إجراء شق صغير خط الوسط العمودي 5 مم رأسي إلى القص. باستخدام ملقط ، كليلة تشريح الأنسجة العضلية لفضح القصي الخشائي اليسار. وتعكس هذه العضلة لفضح الشريان السباتي الأيسر. ندف بلطف النسيج الضام من الشريان. من المهم في هذه المرحلة لعزل العصب المبهم من الشريان دون الإضرار إما الشريان أو العصب.
  6. عزل الشريان وligate نهاية الرأس مع خياطة الحرير. عقدة أخرى فضفاضةقطعة من الخيط على النهاية الذيلية للسفينة تتعرض لها.
  7. المشبك المشبك مع السفينة الصغيرة مليقط على النهاية الذيلية وقطع أقل بقليل من نهاية ligated مع مقص الربيع. ادخال قسطرة بعناية بقدر ما المشبك. الافراج بعناية المشبك الصغير مليقط ودفع القسطرة إلى مفترق silastic - PE.
  8. تعادل كل من الحروف المركبة بشكل آمن إلى القسطرة والتأكد من أن العينات القسطرة من خلال ربط نهاية الحرة للقسطرة لحقنة أخذ العينات.
  9. جعل شق آخر 5 ملم على يمين خط الوسط وحوالي 2 ملم الذيلية إلى الشق الأول. باستخدام ملقط ، كليلة تشريح الأنسجة لفضح وعزل الوريد الوداجي الحق.
  10. ligate بعناية نهاية الرأس مع خياطة وربطة عنق من الحرير فضفاضة آخر قطعة من الخيط في نهاية الذيلية.
  11. مجرد قطع رأسي دون ربطة مع مقص الربيع وادخال القسطرة حتى حبة زجرية. ربطة عنق خياطة وراء حبة وتؤكد أن عينات القسطرة.
  12. توآر الماوس فوق وإجراء شق صغير بين لوحي الكتف.
  13. نفق إبرة عيار 14 تحت الجلد من شق لقسطرة الشرايين ، وعلى الجبهة من الفأرة ، إلى شق بين الكتفين على ظهره. الصفحات القسطرة الشريانية عن طريق إبرة لexteriorize ذلك في الجزء الخلفي من الماوس. كرر هذا للقسطرة الوريد الوداجي من خلال انفاق إبرة عيار 14 تحت الجلد على الجانب الأيمن من الفأرة من موقع شق على الجبهة إلى شق بين الكتفين على ظهره.
  14. المشبك القسطرة الشريانية مع المشبك الصغير مليقط في موقع شق بين لوحي الكتف. قطع القسطرة ~ 1 سم فوق هذا المشبك. ضع TM افتتحته مع الفولاذ المقاوم للصدأ الموصلات التي تواجه نحو الرأس من الفأرة. توصيل القسطرة الشريانية للموصل الفولاذ المقاوم للصدأ وأشار إلى الجانب الأيسر من الماوس. الحرص على ضمان عدم وجود ثقوب أو مكامن الخلل في القسطرة. تكرار للقسطرة وريدية ،توصيله بموصل الفولاذ المقاوم للصدأ لافتا إلى الجانب الأيمن من الفأرة.
  15. إدراج TM افتتحته في شق بين لوحي الكتف. ينبغي للأنابيب PE - 20 المقابلة لقسطرة الوريد الوداجي يكون على الجانب الأيمن من الفأرة وأنابيب PE - 20 المقابلة لقسطرة الشرايين وينبغي الى اليسار.
  16. إغلاق الشقوق بطني وظهري مع الدرز النايلون. لإغلاق الظهرية ، ويمكن تشغيل خياطة من خلال السيليكون صلابة من TM افتتحته لضمان الحصول عليها في المكان. تأكيد سالكية من القسطرة باستخدام محلول ملحي بيغ تحتوي على المضادات الحيوية وheparinized an لتقليل خطر العدوى. الماوس مكان في قفص ، تحسنت نظيفة لتحقيق الانتعاش الفوري. الشكل 2 يوضح المنتج النهائي.
  17. السماح الماوس لاسترداد ما لا يقل عن 5 أيام. مراقبة الوزن والصحة العامة. الاستفادة من مناسبة بعد الجراحة نظام المسكنات التي وافقت عليها المؤسسة رعاية الحيوان واستخدام اللجنة.

3. Hyperinsulinemic - المشبك سوي سكر الدم

  1. سرعة الماوس ل6H - 5. كمرجع ، في الوقت = 0 ر دقيقة تشير إلى نهاية سريعة وبداية ضخ الانسولين والجلوكوز (أي المشبك الفترة).
  2. ويظهر خط الإعداد والوقت لتجربة نموذجية في الشكل 3. استخدام الأنابيب الصغيرة Renathane أو ما يعادلها للتسريب وخطوط أخذ العينات. تعلق قطب ثنائي القناة فوق الماوس. هذا يخدم كمركز بين الماوس والحقن الحقن / أخذ العينات. أثناء التجربة ، ويظل الفأر في قفص المنزل أو حاوية مماثلة ومصطفة على قطب.
  3. قبل توصيل الماوس ، وملء خط المياه المالحة مع أخذ العينات الشريانية heparinized (10 U الهيبارين / المالحة مل) ، ووضع الرابط الفولاذ المقاوم للصدأ في نهاية الجزء السفلي من على خط المرمى. ترك المحاقن مع heparinized المالحة (المقاصة حقنة) متصلا أعلى من خط أخذ العينات. وسوف تستخدم هذه لوضع عصيدة الدمليه.
  4. ملء خط التسريب الوريدي مع المنظمات غير heparinized المالحة بدءا من ميناء التسريب للقطب (الجزء A في الشكل 3A) طوال الطريق إلى أسفل السطر. وصل النهاية أعلى من خط ومكان موصل الفولاذ المقاوم للصدأ (أو موصل Y - بلعة إذا هو أن تدار) في نهاية الجزء السفلي من على خط المرمى. إذا كان التتبع الجلوكوز النظائر (مثلا [3-3 H] الجلوكوز) مصبوب يجري ، وتأمين حقنة 1 مل يحتوي على التتبع لحقنة التسريب. ملء خط التسريب الوريدي مع التتبع بدلا من المياه المالحة (الشكل 3B).
  5. ثلاث ساعات في الصيام ، تزن الماوس وتوصيل PE - 20 لحبل الوريد والقسطرة الشريانية إلى ضخ وخطوط أخذ العينات ، على التوالي.
  6. إذا بالإدارة [3-3 H] الجلوكوز التتبع ، تبدأ ضخ التتبع المستمر في معبي - T = -90 دقيقة (الشكل 3C). جرعة فتيلة نموذجية هي 1 μCi. إعداد μCi 0.05 / ميكروليتر [3-3 H] محلول الغلوكوزn في غير heparinized المالحة. تحميل الحل في حقنة 1 مل وتأمين حقنة في مضخة الحقن في الوريد. إدارة جرعة فتيلة عن طريق غرس 20 ميكروليتر / دقيقة لمدة 1 دقيقة. اتبع مع استمرار تدفق قدره 0.05 μCi / دقيقة (1 ميكروليتر / دقيقة) لمدة دقيقة موازنة 90.
  7. إعداد infusates من الأنسولين والغلوكوز. مستعدة الانسولين في غير heparinized المالحة التي تحتوي على 3 ٪ البلازما باعتبارها الناقل (يمكن أيضا التركيز المناسب من جيش صرب البوسنة أن تستخدم). infusates الجلوكوز متاحة تجاريا في مجموعة متنوعة من تركيزات (5 و 20 و 50 ٪).
  8. تعد المياه المالحة التي يجرفها infusate erythorocyte عن طريق الحصول على الدم الكامل من الجهات المانحة ماوس ، ويفضل من خلفية نفس السلالة الماوس التجريبية. وهناك حاجة عادة 1 مل من الدم الكامل لكل الماوس الدراسة. الطرد المركزي لكريات الدم الحمراء في الدم منفصلة. تغسل مع المياه المالحة الكريات الحمراء يو / 10 مل heparinized والطرد المركزي لتجاهل المالحة. تحديد حجم الكريات الحمراء وresuspend في حجم مساو من 10 U / مل heparinized المالحة.
  9. رسم كل infusate في حقنة 1 مل وتأمين كل حقنة لمضخة التسريب الفردية. ربط كل حقنة لموصل 4 - الطريقة (الشكل 3).
  10. ر = -15 في دقيقة أخذ عينة الدم عن طريق الرسم ببطء 5-10 ميكروليتر من الدم إلى المحقنة المقاصة. المشبك خط أخذ العينات الشرايين وإزالة المحقنة المقاصة. استخدام الجلوكوز متر باليد ، واتخاذ قراءة السكر في الدم عن طريق إزالة المشبك على خط أخذ العينات الشريانية والسماح للدم بالتدفق إلى قطاع الجلوكوز متر.
  11. بمجرد اتخاذ قياس الغلوكوز ، المشبك خط أخذ العينات والشرايين اضافة الى وجود حقنة ذات إبرة حادة (المحاقن أخذ العينات) في خط أخذ العينات الشرياني. إزالة المشبك ورسم حجم الدم (انظر الملاحظة) في المحاقن أخذ العينات. المشبك خط أخذ العينات الشرايين وإزالة المحقنة أخذ العينات. إدراج الحقنة المقاصة مرة أخرى إلى خط أخذ العينات الشرياني. وضع على المكبس لإزالة أي فقاعات الهواء ، وإعادة ضخ ، و5-10 ميكروليتر من الدم التي تم استخلاصها في الأصل.

ملاحظة : حجم عينات من الدم يعتمد على التحليلات التي يؤدونها. على سبيل المثال ، وتحليل [3-3 H] تركيز السكر يتطلب 10 ميكرولتر من البلازما ، لذلك يتم رسمها 50 ميكرولتر من الدم. هذه الغلة 20-30 ميكرولتر من البلازما ، وهو ما يكفي لتحليل البلازما زائد إضافية إذا لزم الأمر. قياسات الهرمونات والأيضات الأخرى (مثل الانسولين ، والأحماض الدهنية الحرة) تتطلب أخذ عينات من دم إضافية.

  1. الاستغناء عن الدم في المحاقن أخذ العينات الى microtube EDTA المغلفة. الطرد المركزي وجمع البلازما. إبقاء البلازما على الجليد حتى نهاية الدراسة أو تخزين فورا على -20 درجة مئوية.
  2. كرر الخطوات من خلال 3،10 3،12 في دقيقة -5 ر =. الحصول على دم إضافية (50 ميكرولتر) لقياس مستويات خط الأساس الانسولين البلازما. قياس الهيماتوكريت الأساس بواسطة سحب الدم في أنبوب شعري هيبارين أو EDTA المعاملة. الحصول على قياسات الابام -15 في عينات البلازما = t و دقيقة -5 تمثل الأساس (أي الصيام) القيم.
  3. بعد العينة في دقيقة -5 ر = ، وملء خطوط ضخ لكريات الدم الحمراء الجلوكوز والأنسولين والمالحة غسلها حتى موصل 4 - الطريقة. توصيل موصل 4 - الطريق إلى الأنابيب التي تعلق على منفذ التسريب قطب (أو الأنبوب متصلا موصل - Y إذا غرس [3-3 H] الجلوكوز) كما هو مبين في الشكل 3.
  4. يبدأ غرس في الكريات الحمراء المالحة التي يجرفها الأولى. تعيين معدل التسريب لتحل محل الحجم الكلي للعينات الدم يجري خلال مدة الدراسة (على سبيل المثال إذا أخذ عينات مما مجموعه 500 ميكروليتر من الدم أكثر من 120 دقيقة من الدراسة ، تعيين معدل التسريب الى 4.2 ميكروليتر / دقيقة). على النقيض من infusates الأخرى ، والحل هو أحمر كرات الدم الحمراء. غرس هذا الحل يسمح الأولى لأي مقاومة محتملة أو أي عوائق في خطوط ضخ لتحديدها وتصحيحها.
  5. بمجرد أن تصل إلى كرات الدم الحمراء infusate الماوس ، يبدأ الانسولين وضخ الجلوكوز. هذه هي الحال الآن ر = 0 دقيقة. هي التي غرست الأنسولين بمعدل ثابت محدد مسبقا. معدل ضخ الانسولين من 4 مو • سوف • كجم -1 -1 دقيقة عادة قمع الذاتية إنتاج الجلوكوز عن طريق 80-100 ٪ ، وتحفيز اختفاء السكر بنسبة 2-3 أضعاف. وتشير التقديرات الأولية لمعدل ضخ الجلوكوز (جير) استنادا إلى مستويات خط الأساس السكر في الدم والخبرات السابقة.
  6. إذا غرس [3-3 H] الجلوكوز ، ويمكن للمرء أن يختار لزيادة معدل ضخ التتبع لتتناسب مع الزيادة المقدرة في دوران الجلوكوز (عادة زيادة 2-3 أضعاف).
  7. بالنظر إلى ارتفاع معدل دوران الجلوكوز في الماوس ، يجب الحصول على عينات دم من خط الشرايين ما لا يقل عن 10 دقيقة كل لقياس تركيز السكر في خلال مدة التجربة. ضبط جير لتحقيق الهدف والحفاظ على سوائية سكر الدم (الشكل 3C). هذا الهدف يمكن أن تختلف تبعا لنموذج أو أهداف الدراسة. وهدف جيد GLucose تركيز هي 150 ملغ • دل - 1 لأن هذا هو نمطي 6H مستوى الجلوكوز صام عن ماوس C57Bl/6J تشاو التي تغذيها.
  8. الهدف هو تحقيق سوائية سكر الدم بسرعة ، وبشكل مثالي داخل 40-50 دقيقة الأولى ، والحصول على الجلوكوز ومستقرة جير قبل بداية فترة ثابتة للدولة (ر = 80 دقيقة).
  9. إذا غرس [3-3 H] الجلوكوز ، والحصول على دم إضافية في ر = 80 ، 90 ، 100 ، 110 و 120 دقيقة لقياس البلازما [3-3 H] النشاط الجلوكوز محددة.
  10. جمع الدم إضافية في ر = 100 و 120 دقيقة لقياس الانسولين البلازما وغيرها من أي هرمون (ق) أو الأيض (ق). في دقيقة ر 110 = ، سحب الدم في أنبوب شعري هيبارين أو EDTA المعاملة لقياس الهيماتوكريت المشبك.
  11. بعد العينة في اتخاذ ر = 120 دقيقة ، 2 [14 جيم] يمكن أن تدار deoxyglucose لقياس الأنسجة محددة امتصاص الغلوكوز. تدير 12 μCi بلعة البلعة في خط متصل إلى خط أخذ العينات الوداجي (الشكل 3B
  12. الحصول على عينات من الدم (50 ميكرولتر) من سطر أخذ العينات في الشرايين ر = 2 و 15 و 25 و 35 دقيقة بعد إدارة البلعة لقياس البلازما 2 [14 جيم] deoxyglucose المستويات.
  13. بعد العينة الماضي ، تخدير الماوس مع ضخ بنتوباربيتال تعطى مباشرة في الخط الشرياني. تشريح الأنسجة بسرعة أي حاجة لتقييم امتصاص الغلوكوز (مثلا عضلات الهيكل العظمي من مختلف الأنواع ، والأنسجة الدهنية والقلب والدماغ) وأية أنسجة أخرى (مثل الكبد والطحال والكليتين). تجميد الأنسجة الإضافية في النيتروجين السائل وتخزينه في -80 درجة مئوية حتى تحليلها. ويتم تحليل الأنسجة عن طريق قياس نسبة الجلوكوز في تراكم فسفرته 2 [14 جيم] deoxyglucose في الأنسجة المجمدة واختفاء من 2 [14 جيم] deoxyglucose من البلازما.

4. ممثل النتائج

ويرد مثال على النتائج التي تم الحصول عليها من الانسولين تجربة المشبك في الشكل 4.هذا المثال يدل على قدرة عالية من الدهون نظام غذائي للمقاومة الانسولين يعجل في الفئران. يجب على جميع العروض من النتائج المشبك الأنسولين ما يلي أن يكون التأويل : دورة الوقت لمستويات السكر في الدم ، وهو بالطبع الوقت الذي جير ومستويات الانسولين البلازما (خط الأساس والمشبك). كما هو موضح هنا ، السكر الصائم (الشكل 4A) والانسولين (الشكل 4C) مستويات أعلى في الفئران تغذت على وجبات عالية الدهون ، مما يدل على مقاومة الانسولين. تقديم دوام مستويات الجلوكوز طوال فترة الدراسة المشبك (الشكل 4A) تتيح للقارئ لتقييم مدى ما حافظ على سوائية سكر الدم ، مما يدل على نوعية المشبك. وبالمثل ، وهو بالطبع الوقت الذي جير (الشكل 4B) يسمح للقارئ لتحديد مدى سرعة تم التوصل إلى حالة مستقرة. كما تظهر هذه البيانات دوام بشكل ملحوظ أكثر إفصاحا من الممارسة التقليدية في الأدب المشبك الماوس الانسولين لتقديم تجربة 2 ساعةكنقطة مسند واحد يمثل متوسط ​​القيم غير معروف من فترة "المشبك" (13/04). في المثال الحالي ، وكانت مستويات السكر في السيطرة على قدم المساواة بين الجماعات وارتفاع الدهون التي تغذيها ، ولكن جير كان أقل من ذلك بكثير في الدهون عالية تغذيها مجموعة الشكل (4B). هذا يدل على وجود ضعف في عمل الانسولين في الجسم بأكمله. وكانت مستويات الأنسولين المشبك أعلى أيضا في المجموعة التي تتغذى على الدهون عالية (الشكل 4C) ، ودعم مزيد من وجود مقاومة للانسولين النمط الظاهري في هذه الفئران. استخدام النظائر ضخ التتبع يسمح لتقييم عمل الانسولين في أنسجة معينة. يستخدم الجلوكوز لتقدير معدل ظهور الجلوكوز الذاتية (endoRa) ، الذي هو مؤشر الانتاج الجلوكوز الكبدي (المجين البشري) ومعدل اختفاء كامل الجسم الجلوكوز (الثالثة) -- [3 H 3]. في حين يقمع الأنسولين تماما المجين البشري في السيطرة على الفئران ، وضعف ذلك في الفئران تغذت على وجبات عالية الدهون (الشكل 4D). وبالمثل ، فإن قدرة فيهو خطر sulin لتحفيز الثالثة في الفئران التحكم في تغذية الفئران نظاما غذائيا غنيا الدهون (4E الشكل). 2 [14 جيم] deoxyglucose يستخدم لتقييم مؤشر الجلوكوز الأيض (RG) ، وهو مقياس لأنسجة محددة امتصاص الغلوكوز. كما رأينا في هذا المثال ، هو ضعف الانسولين حفز امتصاص الغلوكوز في العضلات والهيكل العظمي في الفئران تغذت على وجبات عالية الدهون (4F الشكل).

الشكل 1
الشكل 1 : إعداد الشرياني (A) والقسطرة الوريدية (B) و (C) TM افتتحته. مستعدون القسطرة الشريانية بإدخال قطعة من الطول 1.3 PE - 10 ملم حوالي 3 إلى 6 سم قطعة من 0،012 silastic معرف ". مشطوف هو غيض PE - 10 على ان يكون طولها من شطبة إلى silastic هو 0.9 سم. ريدي تتم القسطرة عن طريق تحريك قطعة صغيرة من 0.020 "الطول 1.1 معرف silastic من نهاية مشطوف من قطعة 6 سم من 0،012" silastic معرف ، و0.020 "قطعة رقم أعمال silastic كما حبة لكبح جماح ذاتها علاج القسطرة في الوريد الوداجي. لتجميع TM افتتحته ، كل من الطول 1،3 اثنين من عيار 25 إدراج الروابط في كل من القطع سم 3 من البولي ايثيلين two - 20. وتعقد هذه معا بواسطة قطعة صغيرة من 0،040 silastic معرف ". يعكفون الموصلات لزاوية 120 درجة وفصل بزاوية 45 درجة. غارق الجمعية بأكملها في سيليكون لاصقة طبية.

الشكل 2
الشكل 2 : مقسطر الماوس. يتم زرعها جراحيا القسطرة في الشريان السباتي الأيسر والوريد الوداجي الحق. وتخريجها نهايات خالية من القسطرة وراء الرأس ومتصلة بنسق افتتحته. يتم إدراج TM افتتحته تحت الجلد بين لوحي الكتف. وهذا يسمح للوصول إلى الأوعية الدموية خلال التجارب المشبك الأنسولين دون الحاجة إلى ضبط النفس والتعامل مع تخدير أو الماوس.

JPG "/>
الشكل 3 : رسم خط الإعداد والوقت للحصول على الأنسولين تجربة المشبك. غير المربوطة الماوس إلى قطب ثنائي القناة التي يعمل كمركز للتسريب والمحاقن أخذ العينات. الاجهزة لاجراء تجارب نموذجية لا تستخدم ضخ التتبع (A) وباستخدام كل من [3-3 H] الجلوكوز و 2 [14 جيم] ترد deoxyglucose (B). ويظهر أيضا خط الزمن من الإجراءات لإعداد وتنفيذ المشبك الانسولين (C). خلال المشبك ، وعينات الدم ( دم ) تؤخذ كل 10 دقيقة لقياس السكر في الدم. يتم ضبط جير وفقا لذلك للحفاظ على سوائية سكر الدم. يتم أخذ الجلوكوز في ر = -15 ودقيقة -5 -- عينات لغلوكوز الدم الأساسية ، والانسولين البلازما ، والبلازما [3 H 3]. يتم أخذ الجلوكوز في ر = 80 ، 90 ، 100 ، 110 و 120 و للأنسولين في المشبك ر = 100 و 120 دقيقة -- عينات لبلازما المشبك [3 H 3]. 2 [14 جيم] يدار deoxyglucose بعد دقيقة على عينة ر 120 = بيتم جمعها في lood = ر 2 و 15 و 25 و 35 دقيقة بعد. يتم أخذ عينة الأنسجة بعد 35 دقيقة = ر.

الشكل 4
الشكل 4 : النتائج من الانسولين تجربة المشبك مقارنة الفئران على نظام غذائي التحكم (تشاو) إلى الفئران على الحمية عالية الدهون (HFD). وترد دوام الجلوكوز الشرياني (A) وجير (B) ، والأساس المشبك الانسولين (C) ، EndoRa (D) ، والثالثة (E) والعضلات والهيكل العظمي (الساق والعضلة المتسعة الوحشية) RG (F). جميع النتائج تشير إلى تأثير التغذية عالية الدهون للحث على مقاومة الانسولين.

Discussion

ويعتبر على نطاق واسع ، المشبك hyperinsulinemic سوي سكر الدم ، أو المشبك الانسولين ، و "المعيار الذهبي" لتقييم طريقة عمل الانسولين في الجسم الحي. وقد تم تطبيق هذه التقنية على العديد من الأنواع ، بما في ذلك البشر الفئران والكلاب والفئران. نظرا للعدد المتزايد من نماذج الماوس المعدلة وراثيا لعلاج الاضطرابات الأيضية ، وفرت تقنية التصغير لاستخدامها في الماوس تقدما كبيرا للبحث عن التمثيل الغذائي.

في حين أن المفاهيم الكامنة وراء الشبك الأنسولين هي واضحة ، في الممارسة العملية هناك أساليب مختلفة لأداء التجارب المشبك الانسولين. هذه ليست نقطة تافهة ، لأن الطريقة التي يتم تنفيذ التجربة يؤثر على النتائج التي تم الحصول عليها 1. هنا نقدم البروتوكول المستخدم من قبل MMPC فاندربيلت. الفرق الرئيسي بين البروتوكول ورأينا أن الآخرين هو أننا استخدام القسطرة الشريانية للحصول على عينات الدم. هذا هو على النقيض من نهج أكثر تستخدم على نطاق واسع من OBTaining عينات الدم عن طريق قطع غيض من الذيل 4 ، 7 ، 11 ، 12 ، 14-17. ميزة لأخذ العينات من القسطرة الشريانية هي أن تجري التجربة في ماوس واعية وغير المقيد. أخذ العينات من الذيل وغالبا ما يتطلب ضبط النفس ويزيد من مؤشرات التوتر عندما يتم الحصول على عينات دم كبيرة 1. هرمونات الاجهاد تحفيز إنتاج السكر المحلية وتضعف التخلص من الجلوكوز 18 و 19 مما قد يعطي مظهر الأنسولين مقاومة النمط الظاهري. قد أخذ العينات من الذيل قطعت خاصة تتطلب رعاية الحيوان المؤسسية واستخدم موافقة اللجنة بسبب طبيعته المجهدة. وقد وضعت إجراءات القسطرة الشريانية لتجنب الضغط على الفأرة لقطع الذيل.

أحد الجوانب الرئيسية لأداء المشابك الانسولين هو القدرة على الحفاظ على سوائية سكر الدم. لا توجد الخوارزميات التي يمكن أن يتنبأ بشكل صحيح كيف ينبغي تعديل جير استنادا قراءات السكر في الدم. مثل الجراحة ،وسوف تجري تجارب الأفراد المشبك الانسولين إتقان في الحفاظ على سوائية سكر الدم معقولة إلا من خلال التجربة. ومن المهم أن نلاحظ أنه بسبب ارتفاع معدل الأيض البيانات التي تم الحصول عليها من دراسات الماوس سوف تكون صاخبة بطبيعتها. هذا يجعل العرض الشامل للبيانات ، بما في ذلك الدورات وقت الجلوكوز وجير والقيم المطلقة للأنسولين البلازما ، endoRa ، شارع وRg وحاسمة بالنسبة لقدرة أي قارئ لتفسير النتائج. تدفق الجلوكوز في ارتفاع معدلات الماوس (حوالي 5 مرات أعلى من المعدل في البشر) تبرر ارتفاع وتيرة أخذ العينات الجلوكوز. في حين يقتصر حجم الدم من الفأرة ، وتردد لا تقل عن مرة واحدة كل 10 دقيقة من الضروري أن تكون على يقين من أنه قد تم حققت المشبك كافية.

كما هو مبين في الشكل (4) ، يمكن لمستويات الانسولين المشبك تكون مختلفة بين المجموعات. ويمكن لعوامل مثل النظام الغذائي التدخلات ، التلاعب وراثيا أو الاختلافات في سلالات الخلفية تؤثر فاسمستويات الانسولين تينغ ، والتي يمكن أن تؤثر على مستويات الانسولين في وقت لاحق المشبك. ويمكن تفسير النتائج عند مستويات الانسولين المشبك مختلفة يكون إشكاليا. ويمكن تناول هذه التجربة من خلال إجراء التجارب الرائدة لتحديد معدلات ضخ الانسولين التي تحقق ما يعادل مستويات الانسولين المشبك بين المجموعات. بدلا من ذلك ، يمكن استخدام السوماتوستاتين لتثبيط إفراز هرمون البنكرياس ، ويمكن استبدال الأنسولين والجلوكاجون بمعدلات تسيطر تجريبيا. هو الأكثر شيوعا القيام به في هذا النهج الأخير المشابك الانسولين على الفئران من الفئران. اذا لم يتم اتخاذ هذه الأساليب التجريبية ، يمكن تطبيع جير الحالة المستقرة إلى المشبك مستوى الانسولين ، أو يمكن اشتقاق مؤشر الحساسية للانسولين (S I) من البيانات كما المشبك S I = جير / (G • ΔI) ، حيث G هو تركيز السكر المطرد للدولة وΔI هو الفرق بين الصيام وتركيزات الانسولين المشبك. افتراض واحد إما مع النهج هو أن مستوى الأنسولين تحقيقه هو المشبكضمن النطاق حيث يرتبط خطيا الحساسية للانسولين لمستوى الانسولين وفقا للمجموعة التي تجري دراستها. قد يكون هذا الافتراض الأخير لا ينطبق عند المقارنة بين مقاومة الانسولين والانسولين المجموعات الحساسة. من الناحية المثالية ، ينبغي إنشاء منحنى الاستجابة للجرعة الانسولين لتحديد ضخ الانسولين المناسبة. ومع ذلك ، بسبب الحاجة إلى مزيد من التجارب ، ويتم هذا إلا نادرا.

براعة تقدمها قسطرة الشرايين يمتد إلى ما بعد النهج التجريبي المشابك سوي سكر الدم. على سبيل المثال ، يمكن استخدام المشابك فرط سكر الدم ، التي غرست الجلوكوز في معدل متغير للحفاظ على ارتفاع السكر في الدم بالنسبة للغلوكوز الصوم ، لتقييم وظيفة البنكرياس الذاتية في الجسم الحي 2 و 20 و 21. قياس إفراز الأنسولين في المرحلة الأولى خلال هذا الاختبار يتطلب اكتساب المتكرر للعينات الدم (أي كل دقيقة 2-5) ، والتي ليس من الممكن الحصول على عينات من عند طرف الذيل. علاوة على ذلك ،يمكن الكاتيكولامينات مرتفعة الناتجة عن أخذ العينات الذيل يضعف افراز الانسولين والجلوكاجون تعزيز إفراز 22. ويمكن أيضا بروتوكول المشبك الانسولين يمكن تعديل للسماح لمستويات الجلوكوز في الانخفاض النسبي لنقص السكر في الدم لتقييم مكافحة التنظيمية استجابة 2 ، 23 ، 24. ويمكن أيضا قسطرة الشرايين يمكن استخدامها لتقييم ديناميات استقلاب الجلوكوز أثناء ممارسة 25-30. هذا هو مفيد بشكل كبير خلال الأساليب التقليدية التي أجريت في نقاط مرة واحدة قبل وبعد ممارسة معزولة أو في فيفو السابقين العضلات. ويمكن أيضا التقنيات المقدمة هنا يمكن استخدامها لتقييم ليس فقط الجلوكوز ، ولكن أيضا الدهنية استقلاب حمض 31.

Disclosures

الإعلان عن أي تضارب في المصالح.

Acknowledgments

وأيد هذا العمل عن طريق المنح - 5 - U24 DK059637 - 10 في مركز فاندربيلت ماوس Phenotyping الأيض.

References

  1. Ayala, J. E., Bracy, D. P., McGuinness, O. P., Wasserman, D. H. Considerations in the design of hyperinsulinemic-euglycemic clamps in the conscious mouse. Diabetes. 55, 390-397 (2006).
  2. Berglund, E. D., Li, C. Y., Poffenberger, G., Ayala, J. E., Fueger, P. T., Willis, S. E., Jewell, M. M., Powers, A. C., Wasserman, D. H. Glucose metabolism in vivo in four commonly used inbred mouse strains. Diabetes. 57, 1790-1799 (2008).
  3. Niswender, K. D., Shiota, M., Postic, C., Cherrington, A. D., Magnuson, M. A. Effects of increased glucokinase gene copy number on glucose homeostasis and hepatic glucose metabolism. J. Biol. Chem. 272, 22570-22575 (1997).
  4. Kim, H. J., Higashimori, T., Park, S. Y., Choi, H., Dong, J., Kim, Y. J., Noh, H. L., Cho, Y. R., Cline, G., Kim, Y. B., Kim, J. K. Differential effects of interleukin-6 and -10 on skeletal muscle and liver insulin action in vivo. Diabetes. 53, 1060-1067 (2004).
  5. Kim, J. K., Fillmore, J. J., Chen, Y., Yu, C., Moore, I. K., Pypaert, M., Lutz, E. P., Kako, Y., Velez-Carrasco, W., Goldberg, I. J., Breslow, J. L., Shulman, G. I. Tissue-specific overexpression of lipoprotein lipase causes tissue-specific insulin resistance. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 98, 7522-7527 (2001).
  6. Kim, J. K., Fillmore, J. J., Gavrilova, O., Chao, L., Higashimori, T., Choi, H., Kim, H. J., Yu, C., Chen, Y., Qu, X., Haluzik, M., Reitman, M. L., Shulman, G. I. Differential effects of rosiglitazone on skeletal muscle and liver insulin resistance in A-ZIP/F-1 fatless mice. Diabetes. 52, 1311-1318 (2003).
  7. Kim, J. K., Fillmore, J. J., Sunshine, M. J., Albrecht, B., Higashimori, T., Kim, D. W., Liu, Z. X., Soos, T. J., Cline, G. W., O'Brien, W. R., Littman, D. R., Shulman, G. I. PKC-theta knockout mice are protected from fat-induced insulin resistance. J. Clin. Invest. 114, 823-827 (2004).
  8. Kim, J. K., Gavrilova, O., Chen, Y., Reitman, M. L., Shulman, G. I. Mechanism of insulin resistance in A-ZIP/F-1 fatless mice. J. Biol. Chem. 275, 8456-8460 (2000).
  9. Kim, J. K., Gimeno, R. E., Higashimori, T., Kim, H. J., Choi, H., Punreddy, S., Mozell, R. L., Tan, G., Stricker-Krongrad, A., Hirsch, Inactivation of fatty acid transport protein 1 prevents fat-induced insulin resistance in skeletal muscle. J. Clin. Invest. 113, 756-763 (2004).
  10. Kim, J. K., Kim, H. J., Park, S. Y., Cederberg, A., Westergren, R., Nilsson, D., Higashimori, T., Cho, Y. R., Liu, Z. X., Dong, J., Cline, G. W., Enerback, S., Shulman, G. I. Adipocyte-specific overexpression of FOXC2 prevents diet-induced increases in intramuscular fatty acyl CoA and insulin resistance. Diabetes. 54, 1657-1663 (2005).
  11. Kim, J. K., Kim, Y. J., Fillmore, J. J., Chen, Y., Moore, I., Lee, J., Yuan, M., Li, Z. W., Karin, M., Perret, P., Shoelson, S. E., Shulman, G. I. Prevention of fat-induced insulin resistance by salicylate. J. Clin. Invest. 108, 437-446 (2001).
  12. Kim, J. K., Michael, P. revis, Peroni, S. F., Mauvais-Jarvis, O. D., Neschen, F., Kahn, S., Kahn, B. B., R, C., Shulman, G. I. Redistribution of substrates to adipose tissue promotes obesity in mice with selective insulin resistance in muscle. J. Clin. Invest. 105, 1791-1797 (2000).
  13. Kim, J. K., Zisman, A., Fillmore, J. J., Peroni, O. D., Kotani, K., Perret, P., Zong, H., Dong, J., Kahn, C. R., Kahn, B. B., Shulman, G. I. Glucose toxicity and the development of diabetes in mice with muscle-specific inactivation of GLUT4. J. Clin. Invest. 108, 153-160 (2001).
  14. Haluzik, M., Gavrilova, O., LeRoith, D. Peroxisome proliferator-activated receptor-alpha deficiency does not alter insulin sensitivity in mice maintained on regular or high-fat diet: hyperinsulinemic-euglycemic clamp studies. Endocrinology. 145, 1662-1667 (2004).
  15. Haluzik, M., Yakar, S., Gavrilova, O., Setser, J., Boisclair, Y., LeRoith, D. Insulin resistance in the liver-specific IGF-1 gene-deleted mouse is abrogated by deletion of the acid-labile subunit of the IGF-binding protein-3 complex: relative roles of growth hormone and IGF-1 in insulin resistance. Diabetes. 52, 2483-2489 (2003).
  16. Haluzik, M. M., Lacinova, Z., Dolinkova, M., Haluzikova, D., Housa, D., Horinek, A., Vernerova, Z., Kumstyrova, T., Haluzik, M. Improvement of insulin sensitivity after peroxisome proliferator-activated receptor-alpha agonist treatment is accompanied by paradoxical increase of circulating resistin levels. Endocrinology. 147, 4517-4524 (2006).
  17. Kim, H., Haluzik, M., Asghar, Z., Yau, D., Joseph, J. W., Fernandez, A. M., Reitman, M. L., Yakar, S., Stannard, B., Heron-Milhavet, L., Wheeler, M. B., LeRoith, D. Peroxisome proliferator-activated receptor-alpha agonist treatment in a transgenic model of type 2 diabetes reverses the lipotoxic state and improves glucose homeostasis. Diabetes. 52, 1770-1778 (2003).
  18. Deibert, D. C., DeFronzo, R. A. Epinephrine-induced insulin resistance in man. J. Clin. Invest. 65, 717-721 (1980).
  19. Rizza, R. A., Cryer, P. E., Haymond, M. W., Gerich, J. E. Adrenergic mechanisms for the effects of epinephrine on glucose production and clearance in man. J. Clin. Invest. 65, 682-689 (1980).
  20. Nunemaker, C. S., Wasserman, D. H., McGuinness, O. P., Sweet, I. R., Teague, J. C., Satin, L. S. Insulin secretion in the conscious mouse is biphasic and pulsatile. Am. J. Physiol. Endocrinol. Metab. 290, 523-529 (2006).
  21. Nunemaker, C. S., Zhang, M., Wasserman, D. H., McGuinness, O. P., Powers, A. C., Bertram, R., Sherman, A., Satin, L. S. Individual mice can be distinguished by the period of their islet calcium oscillations: is there an intrinsic islet period that is imprinted in vivo. Diabetes. 54, 3517-3522 (2005).
  22. Halter, J. B., Beard, J. C., Jr, P. orte, D, Islet function and stress hyperglycemia: plasma glucose and epinephrine interaction. Am. J. Physiol. 247, 47-52 (1984).
  23. Jacobson, L., Ansari, T., McGuinness, O. P. Counterregulatory deficits occur within 24 h of a single hypoglycemic episode in conscious, unrestrained, chronically cannulated mice. Am. J. Physiol. Endocrinol. Metab. 290, 678-684 (2006).
  24. Jacobson, L., Ansari, T., Potts, J., McGuinness, O. P. Glucocorticoid-deficient corticotropin-releasing hormone knockout mice maintain glucose requirements but not autonomic responses during repeated hypoglycemia. Am. J. Physiol. Endocrinol. Metab. 291, 15-22 (2006).
  25. Ayala, J. E., Bracy, D. P., James, F. D., Julien, B. M., Wasserman, D. H., Drucker, D. J. The glucagon-like peptide-1 receptor regulates endogenous glucose production and muscle glucose uptake independent of its incretin action. Endocrinology. 150, 1155-1164 (2009).
  26. Fueger, P. T., Bracy, D. P., Malabanan, C. M., Pencek, R. R., Granner, D. K., Wasserman, D. H. Hexokinase II overexpression improves exercise-stimulated but not insulin-stimulated muscle glucose uptake in high-fat-fed C57BL/6J mice. Diabetes. 53, 306-314 (2004).
  27. Fueger, P. T., Bracy, D. P., Malabanan, C. M., Pencek, R. R., Wasserman, D. H. Distributed control of glucose uptake by working muscles of conscious mice: roles of transport and phosphorylation. Am. J. Physiol. Endocrinol. Metab. 286, 77-84 (2004).
  28. Fueger, P. T., Heikkinen, S., Bracy, D. P., Malabanan, C. M., Pencek, R. R., Laakso, M., Wasserman, D. H. Hexokinase II partial knockout impairs exercise-stimulated glucose uptake in oxidative muscles of mice. Am. J. Physiol. Endocrinol. Metab. 285, 958-963 (2003).
  29. Fueger, P. T., Hess, H. S., Posey, K. A., Bracy, D. P., Pencek, R. R., Charron, M. J., Wasserman, D. H. Control of exercise-stimulated muscle glucose uptake by GLUT4 is dependent on glucose phosphorylation capacity in the conscious mouse. J. Biol. Chem. , (2004).
  30. Fueger, P. T., Li, C. Y., Ayala, J. E., Shearer, J., Bracy, D. P., Charron, M. J., Rottman, J. N., Wasserman, D. H. Glucose kinetics and exercise tolerance in mice lacking the GLUT4 glucose transporter. J. Physiol. 582, 801-812 (2007).
  31. Shearer, J., Coenen, K. R., Pencek, R. R., Swift, L. L., Wasserman, D. H., Rottman, J. N. Long chain fatty acid uptake in vivo: comparison of [125I]-BMIPP and [3H]-bromopalmitate. Lipids. 43, 703-711 (2008).

Tags

الطب ، العدد 57 ، الجلوكوز والأنسولين ، المشبك ، والفئران ، ومقاومة الانسولين والسكري والكبد والعضلات ، واعية ، خالية من ضبط النفس ، وعدم وشدد
Hyperinsulinemic - سوي سكر الدم في الفئران المشابك ، وإدراكا بلا حدود
Play Video
PDF DOI

Cite this Article

Ayala, J. E., Bracy, D. P.,… More

Ayala, J. E., Bracy, D. P., Malabanan, C., James, F. D., Ansari, T., Fueger, P. T., McGuinness, O. P., Wasserman, D. H. Hyperinsulinemic-euglycemic Clamps in Conscious, Unrestrained Mice. J. Vis. Exp. (57), e3188, doi:10.3791/3188 (2011).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter