Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Medicine
Click here for the English version

Medicine

Hyperinsulinemic-euglycemic Clamps ב, עכברים מודעת בלתי מרוסנת

Published: November 16, 2011 doi: 10.3791/3188
Automatic Translation
1, 2,3, 3, 2,3, 3, 4, 2,3, 2,3
1Diabetes and Obesity Research Center, Sanford-Burnham Medical Research Institute at Lake Nona, 2Department of Molecular Physiology and Biophysics, Vanderbilt University School of Medicine, 3Vanderbilt Mouse Metabolic Phenotyping Center, Vanderbilt University School of Medicine, 4Department of Pediatrics and Cellular and Integrative Physiology, Indiana University School of Medicine

Summary

מהדק hyperinsulinemic-euglycemic, או מהדק אינסולין, הוא תקן הזהב להערכת פעילות האינסולין

Abstract

סוכרת מסוג 2 מאופיינת על ידי פגם פעילות האינסולין. מהדק hyperinsulinemic-euglycemic, או מהדק האינסולין, הוא שנחשב את "תקן הזהב" שיטה להערכת פעילות האינסולין in vivo. במהלך מהדק אינסולין, hyperinsulinemia מושגת על ידי עירוי אינסולין קבועה. Euglycemia נשמר באמצעות עירוי גלוקוז במקביל בקצב משתנה. גלוקוז זה משתנה קצב עירוי (Gir) נקבעת על ידי מדידת רמת הסוכר בדם בפרקי זמן קצרים במהלך הניסוי והתאמת Gir בהתאם. Gir מעיד על פעולה כל הגוף לאינסולין, כמו עכברים עם פעילות האינסולין משופרת דורשים Gir יותר. מהדק אינסולין יכול לשלב ניהול 2 איזוטופים [14 C] deoxyglucose להעריך רקמה ספציפית ספיגת הגלוקוז [3-3-H] גלוקוז כדי להעריך את היכולת של אינסולין כדי לדכא את קצב הופעת גלוקוז אנדוגני (endoRa), סמן ייצור הגלוקוז בכבד, וכדי לעורר אתקצב היעלמות כל הגוף גלוקוז (Rd).

המזעור של מהדק את האינסולין לשימוש במודלים של עכברים גנטי של מחלה מטבולית הוביל להתקדמות משמעותית בחקר הסוכרת. שיטות לביצוע מלחציים אינסולין להשתנות בין מעבדות. חשוב לציין, כי האופן שבו תפס אינסולין מתבצע יכול להשפיע משמעותית על התוצאות שהושגו. פרסמנו הערכה מקיפה של גישות שונות לביצוע מלחציים האינסולין בעכברים מודע 1, כמו גם הערכה של התגובה המטבולית של ארבעה זנים נפוצים עכבר מולדת באמצעות טכניקות שונות מהדק 2. כאן אנו מציגים פרוטוקול לביצוע מלחציים אינסולין על, עכברים מודע רסן שפותחה על ידי עכבר ונדרבילט מטבולית Phenotyping מרכז (MMPC: כתובת: www.mc.vanderbilt.edu / mmpc). זה כולל תיאור של השיטה עבור להשתיל צנתרים בשימוש במהלך מהדק את האינסולין. פרוטוקול המועסקים על ידיונדרבילט MMPC מנצל 3 ייחודי של שתי קטטר המערכת. אחת מוכנס קטטר לווריד הצוואר של חליטות. קטטר שנייה מוכנס לתוך עורק הצוואר, המאפשר דגימת דם ללא צורך לרסן או להתמודד עם העכבר. טכניקה זו מספקת יתרון משמעותי לשיטה הנפוצה ביותר לקבלת דגימות דם במהלך מהדק אינסולין המהווה מדגם מקצה הכרות של הזנב. בניגוד לשיטה זו האחרונה, דגימה מן קטטר עורקי לא מלחיץ את העכבר 1. כמו כן, אנו מתארים את שיטות באמצעות חליטות נותב איזוטופי להעריך רקמות ספציפיות פעילות האינסולין. כמו כן אנו מספקים הנחיות במצגת המתאימה לתוצאות שהתקבלו מלחציים אינסולין.

Protocol

1. הכנת צנתרים אנטנה עכבר עבור Access דגימה (מסע tm)

  1. הכן קטטר עורקי ידי הוספת חתיכת 1.3 ס"מ PE-10 (0.011 קוטר פנימי אינץ') לתוך חתיכת 6 ס"מ של צינורות silastic (0.012 קוטר פנימי אינץ') כפי שמוצג באיור 1 א. שפוע קצה של PE-10 עם אזמל כך אורך מקצה silastic אל קצה שפוע הוא 0.9 ס"מ.
  2. הכן צנתר ורידי ידי הזזה חתיכת 1 מ"מ של צינורות silastic (0.020 קוטר פנימי אינץ') 1.1 ס"מ מהקצה משופעים של פיסת 6 ס"מ של צינורות silastic (0.012 קוטר פנימי אינץ') כפי שמוצג באיור 1 ב. היצירה 1 מ"מ של silastic משמש חרוז הרחקה.
  3. כדי להכין tm מסע, להכניס כל אחד משני החלקים 1.3 ס"מ של 25 מחברים מד נירוסטה אל תוך כל אחד משני החלקים 3 ס"מ של PE-20 (0.015 קוטר פנימי אינץ').
  4. אבטח את PE-20/connectors זה לזה על ידי הזזה פיסת 5 מ"מ של silasticצינורות (0.040 קוטר פנימי אינץ') מעל האזור שבו צינורות פלדה PE-20 נפגשים.
  5. לכופף את צינורות פלדה לזווית של ° 120 ~ והפרד צינור על ידי ~ 45 °.
  6. המקום השלים המתקן בטיפת דבק סיליקון רפואי כזה צינורות PE-20 הוא אנכי ואת הקצוות של צינורות נירוסטה להרחיב מעבר דבק (תרשים 1C). אפשר להגדיר את זה עבור 24 שעות.

2. ניתוח צנתור

  1. לפני הניתוח, לעקר צנתרים עם אתנול 70%, למלא אותם עם מלח heparinized (200 הפרין U / ml מלוחים) ולהוסיף תקעים נירוסטה.
  2. הרדימי עכבר, רצוי בשיטה ברציפות מספק את סוכן הרדמה (למשל isoflurane בשאיפה).
  3. שימוש בטכניקה סטרילית, להסיר שיער מן האתרים חתך באמצעות קוצץ ו / או קרם מקריח ולחטא את העור עם אלכוהול ואחריו לשפשף בבטאדין. עבור החדרת קטטר, להסיר שיער עלהאזור המשתרע מן הלסת התחתונה לחלק העליון של כלוב הצלעות ובין הבריח. עבור החצנה של צנתרים מאחורי הראש, להסיר שיער באזור שבין בסיס הגולגולת לבין אזור interscapular ולחטא את העור עם אלכוהול ואחריו לשפשף בבטאדין.
  4. הנח את העכבר על גבו על גבי משטח להתחממות תחת אזור התצוגה של מיקרוסקופ כירורגי. אבטח את הזנב הגפיים בעזרת פלסטר. אבטח את ראש קונוס האף מתן הרדמה.
  5. לעשות חתך קטן קו האמצע האנכי 5 מ"מ cephalic אל עצם החזה. בעזרת מלקחיים, בוטה לנתח את הרקמה על מנת לחשוף את השריר sternomastoid שמאל. לשקף את השריר כדי לחשוף את העורק הראשי השמאלי. בעדינות להקניט את רקמת החיבור של העורק. חשוב בשלב זה על מנת לבודד את העצב התועה מן העורק מבלי לפגוע או העורק או העצב.
  6. לבודד את העורק ולקשור את הקצה cephalic עם תפר משי. רופף הקשר אחרחתיכת תפר בקצה הזנב של הספינה חשוף.
  7. קלאמפ כלי עם מהדק מיקרו serrefine על קצה הזנב וחתכו ממש מתחת בסוף ligated במספריים האביב. בזהירות להכניס קטטר ככל מהדק. בזהירות לשחרר את מהדק מיקרו serrefine ולקדם את הקטטר לצומת silastic-PE.
  8. עניבה הן חיבורי אותיות מאובטח הקטטר ולוודא כי דגימות קטטר על ידי חיבור קצה ללא קטטר כדי מזרק הדגימה.
  9. תארגנו עוד 5 מ"מ חתך מימין לקו האמצע ו - 2 מ"מ על הזנב עד החתך הראשון. בעזרת מלקחיים, בוטה לנתח את רקמת לחשוף ולבודד את וריד הצוואר הימני.
  10. בזהירות ולקשור את הקצה cephalic עם תפר משי רופף לקשור עוד פיסת תפר בקצה הזנב.
  11. גזור ממש מתחת המיתר cephalic במספריים האביב להכניס את הקטטר עד חרוז הרחקה. עניבה תפר מאחורי חרוז ולוודא כי דגימות קטטר.
  12. ט"וrn את העכבר מעל ולעשות חתך קטן בין השכמות.
  13. מנהרת מחט 14-מד מתחת לעור מן החתך של העורקים קטטר, על החלק הקדמי של העכבר, כדי החתך interscapular על הגב. נושא קטטר עורקי דרך המחט אל exteriorize זה בחלק האחורי של העכבר. חזור על פעולה זו עבור קטטר וריד על ידי מנהור את המחט 14-מד מתחת לעור בצד הימני של העכבר מהאתר חתך בחזית אל החתך interscapular על הגב.
  14. הצמד את הקטטר עורקי עם מהדק מיקרו serrefine באתר חתך בין השכמות. חותכים את הקטטר ~ 1 ס"מ מעל תפס את זה. מניחים את tm מסע עם מחברי נירוסטה פונה לכיוון ראשו של העכבר. חיבור קטטר עורקי למחבר נירוסטה הצביע לעבר הצד השמאלי של העכבר. תשמרי על עצמך כדי לוודא שאין חורים או סטיות של הקטטר. חזור על הפעולה עבור קטטר ורידי,לחבר אותו למחבר נירוסטה מצביע על הצד הימני של העכבר.
  15. הכנס את tm מסע לתוך החתך בין השכמות. צינורות PE-20 המתאים קטטר וריד הצוואר צריך להיות בצד הימני של העכבר ואת צינורות PE-20 המתאים קטטר העורקים צריכה להיות שמאלה.
  16. סגור חתכים הגחון ועל הגב עם תפר ניילון. לסגירת הגבי, תפר ניתן להפעיל באמצעות סיליקון מוקשה של tm מסע לאבטח אותו במקומו. אשר patency של צנתרים באמצעות פתרון שטיפה המכילה תמיסת מלח heparinized ו אנטיביוטיקה כדי למזער את הסיכון לזיהום. עכבר המקום בכלוב, חימם נקי להתאוששות מיידית. תרשים 2 מציג את המוצר המוגמר.
  17. אפשר בעכבר כדי לשחזר לפחות 5 ימים. צג המשקל ועל הבריאות הכללית. לנצל את הטיפול המתאים לאחר הניתוח כאבים כפי שאושר על ידי טיפול בבעלי חיים של המוסד והשתמש הוועדה.

3. Hyperinsulinemic-euglycemic מהדק

  1. מהיר בעכבר עבור 5-6 שעות. כנקודת התייחסות, הזמן t = 0 מתייחס דקות לסיום הצום ותחילת עירוי אינסולין וגלוקוז (נקודה כלומר מהדק).
  2. קו הגדרת זמן עבור ניסוי טיפוסי מוצגים באיור 3. השתמש בצינור Micro-Renathane או שווה ערך עבור עירוי קווי הדגימה. להשעות מסתובב ערוץ כפול מעל העכבר. זה משמש כמרכז בין העכבר עירוי / דגימה מזרקים. במהלך הניסוי, העכבר נשאר בכלוב בבית או מיכל דומה, והוא קשור המסתובב.
  3. לפני חיבור העכבר, למלא את קו הדגימה עורקי עם מלוחים heparinized (10 הפרין U / ml מלוחים) ומקום מחבר נירוסטה בקצה התחתון של הקו. השאירו מזרק עם סליין heparinized (ניקוי המזרק) מחובר לחלק העליון של קו הדגימה. זה ישמש להכין דם samples.
  4. מלאו את עירוי ורידי קו עם מלוחים שאינם heparinized החל הנמל עירוי של המסתובב (קטע ב איור 3A) כל הדרך אל החלק התחתון של הקו. חבר את הקצה העליון של הקו מקום מחבר נירוסטה (או ה-Y, אם מחבר בולוס הוא להיות מנוהל) בקצה התחתון של הקו. אם נותב גלוקוז איזוטופי (למשל [3-3-H] גלוקוז) הוא להיות חדורים, מאובטח מזרק 1 מ"ל המכיל את נותב אל מזרק אינפוזיה. מלאו את עירוי ורידי קו עם נותב במקום מלוחים (איור 3B).
  5. שלוש שעות אל תוך הצום, לשקול את העכבר ולחבר את PE-20 עבור עורק הצוואר צנתרים עורקי כדי העירוי קווי הדגימה, בהתאמה.
  6. אם מתן [3-3-H] נותב גלוקוז, להתחיל עירוי דרוך רציפה נותב ב t = -90 דקות (איור 3 ג). מנה טיפוסית היא תחול μCi 1. הכן 0.05 μCi / μl [3-3-H] גלוקוז solution ב מליחים שאינם heparinized. טען את הפתרון לתוך מזרק 1 מ"ל ומאובטח את המזרק משאבת אינפוזיה. נהל את המינון תחול על ידי יציקת 20 μl / min דקות 1. עקוב אחר עם עירוי מתמשך של 0.05 μCi / min (1 μl / min) לתקופה איזון 90 דקות.
  7. הכן infusates של אינסולין וגלוקוז. אינסולין הוא הכין מליחים שאינם heparinized המכיל פלזמה 3% כנשא (ריכוז מתאים של BSA יכול לשמש גם). Infusates גלוקוז זמינים מסחרית במגוון ריכוזים (% 5, 20 ו - 50).
  8. הכן מלוחים שטף infusate erythorocyte על ידי קבלת דם שלם עכבר התורם, רצוי רקע המתח כמו עכבר הניסוי. בדרך כלל 1 מ"ל של דם מלא נחוצה לכל מחקר העכבר. צנטריפוגה לדם אריתרוציטים נפרד. לשטוף עם אריתרוציטים מלוחים U / ml 10 heparinized ו צנטריפוגות כדי למחוק את מלח. קבע את עוצמת הקול של אריתרוציטים ו resuspend בנפח שווה של 10 U / ml heparinized מלוחים.
  9. צייר כל infusate לתוך מזרק 1 מ"ל ומאובטח בכל מזרק כדי לשאוב אינפוזיה בודדים. חיבור כל מזרק למחבר 4-way (איור 3).
  10. ב t = -15 דקות לקחת דגימת דם על ידי ציור לאט עד 5-10 μl של דם לתוך המזרק ניקוי. הצמד את קו הדגימה עורקים ולהסיר את המזרק ניקוי. באמצעות מד כף יד גלוקוז, לקחת קריאת הגלוקוז בדם על ידי הסרת מהדק על הקו הדגימה בעורקים ומאפשר לדם לזרום לתוך רצועת מד הגלוקוז.
  11. לאחר מדידת גלוקוז הוא נלקח, מהדק את הקו הדגימה עורקים להוסיף מזרק בוטה מחט (מזרק הדגימה) לתוך קו הדגימה עורקים. הסר את מהדק וצייר נפח הדם (ראה הערה) לתוך מזרק הדגימה. הצמד את קו הדגימה עורקים ולהסיר את המזרק הדגימה. הכנס את המזרק ניקוי חזרה לתוך קו הדגימה עורקים. צייר על הבוכנה כדי להסיר בועות אוויר מחדש להחדיר את50-100 μl הדם נמשך במקור.

הערה: נפח הדם שנדגמו תלוי הניתוח מתבצע. לדוגמה, ניתוח [3-3 ח'] ריכוז הגלוקוז דורש 10 μl של פלסמה, אז 50 μl של דם נמשכים. זה מניב 20-30 μl של פלזמה, וזה מספיק לניתוח פלוס פלזמה נוספים במידת הצורך. מדידות של הורמונים מטבוליטים אחרים (כגון אינסולין, חומצות שומן חופשיות) לדרוש דגימת דם נוספת.

  1. לוותר הדם במזרק הדגימה לתוך microtube EDTA מצופה. צנטריפוגה ולאסוף את הפלסמה. שמור את הפלזמה על הקרח עד סוף המחקר או מיד לחנות ב -20 ° C.
  2. חזור על שלבים 3.10 עד 3.12 ב -5 דק 't =. להשיג דם נוסף (50 μl) למדידת רמות הבסיס של פלזמה אינסולין. מדד הבסיס המטוקריט ידי זוב דם לתוך צינור נימי הפרין או EDTA שטופלו. המדידות שהתקבלו frאום דגימות פלסמה ב t = -15 ו -5 דקות לייצג את הבסיס (כלומר, צום) ערכים.
  3. אחרי המדגם ב -5 דקות = t, למלא את השורות אינפוזיה עבור אריתרוציטים, גלוקוז אינסולין מלוחים שנשטפו למחבר 4-הדרך. חבר את מחבר 4 דרך צינור המחובר ליציאת עירוי המסתובב (או צינור המחובר למחבר ה-Y אם יציקת [3-3-H] גלוקוז) כפי שמוצג באיור 3.
  4. בגין יציקת מלוחים שטף אריתרוציטים הראשון. הגדר את קצב העירוי כדי להחליף את הנפח הכולל של הדם להיות שנדגמו על משך הזמן של המחקר (למשל, אם סך של 500 μl של דם נדגמים מעל 120 דק 'של המחקר, להגדיר את קצב העירוי כדי 4.2 μl / min). בניגוד infusates אחרים, הפתרון כדורית אדומה הוא אדום. יציקת זה הפתרון הראשון מאפשר התנגדות או מכשולים פוטנציאליים קווי עירוי להיות מזוהה ותיקן.
  5. לאחר infusate כדורית אדומה מגיע העכבר, להתחיל אינסוליןגלוקוז חליטות. זהו עכשיו t = 0 דקות. אינסולין הוא החדיר את שיעור קבוע שנקבע מראש,. עירוי אינסולין בקצב של 4 MU -1 ק"ג • • min -1 יהיו בדרך כלל לדכא ייצור גלוקוז אנדוגני על ידי% 80-100 וממריץ היעלמות גלוקוז על ידי קיפול 2-3. גלוקוז הראשונית קצב עירוי (Gir) מוערך על בסיס רמות הגלוקוז בדם המחקר והניסיון הקודם.
  6. אם יציקת [3-3 ח'] גלוקוז, אפשר לבחור להגביר את קצב עירוי נותב כדי להתאים את הגידול מוערך במחזור גלוקוז (בדרך כלל עלייה של פי 2-3).
  7. בהתחשב שיעור גבוה של תחלופה הגלוקוז העכבר, דגימות דם יש לקבל קו עורקי לא פחות מ 10 דקות בכל למדידת ריכוז הגלוקוז על משך הניסוי. התאם את Gir כדי להשיג ולשמור euglycemia היעד (איור 3 ג). מטרה זו יכולה להשתנות בהתאם לדגם או המטרות של המחקר. Gl מטרה טובהריכוז ucose הוא 150 מ"ג • ד"ל-1, מאחר שזו רמת גלוקוז בצום 6 שעות טיפוסי עבור עכבר C57Bl/6J האוכל שאוכלים.
  8. המטרה היא להשיג euglycemia במהירות, רצוי תוך 40-50 דקות קודם, יש גלוקוז יציבה על ידי Gir בתחילת התקופה היציב (t = 80 דקות).
  9. אם יציקת [3-3-H] גלוקוז, להשיג דם נוסף ב t = 80, 90, 100, 110 ו - 120 דקות למדידת פלזמה [3-3-H] פעילות גלוקוז ספציפיים.
  10. איסוף דם נוספות בזמן t = 100 ו - 120 דקות למדידה של אינסולין בפלסמה כל הורמון אחר (ים) או מטבוליט (ים). בשלב דקות t = 110, להקיז דם לתוך צינור נימי הפרין או EDTA שטופלו עבור מדידה של מהדק המטוקריט.
  11. אחרי המדגם בזמן t = 120 דקות נלקחת, 2 [14 C] deoxyglucose יכול להינתן למדידת ספיגת רקמות ספציפיות גלוקוז. ניהול של 12 בולוס μCi לתוך הקו בולוס מחובר לקו הדגימה הצוואר (איור 3B
  12. להשיג דגימות דם (50 μl) מקו הדגימה עורקים ב t = 2, 15, 25 ו - 35 דקות לאחר מתן בולוס למדידת פלזמה 2 [14 C] רמות deoxyglucose.
  13. אחרי המדגם האחרון, להרדים את העכבר עם עירוי של pentobarbital נתון ישירות לתוך קו עורקי. לנתח במהירות כל הרקמות הנדרש להערכת ספיגת הגלוקוז (שרירי השלד למשל מסוגים שונים, רקמת שומן, לב, מוח) וכל ברקמות אחרות (למשל, הכבד הטחול, הכליות). הצמד רקמות הקפאה בחנקן נוזלי חנות ב -80 ° C עד מנותח. גלוקוז רקמות מנותח על ידי מדידת הצטברות של 2 phosphorylated [14 C] deoxyglucose ברקמות קפואות היעלמותה של 2 deoxyglucose [14 C] מן הפלזמה.

4. נציג תוצאות

דוגמה לתוצאות שהתקבלו בניסוי מהדק אינסולין מוצגת באיור 4.דוגמה זו מראה את היכולת של דיאטה שומן גבוהה כדי לזרז התנגדות לאינסולין אצל עכברים. כל המצגות של תוצאות מהדק אינסולין חייב לכלול את הפרטים הבאים להיות לפירוש: קורס זמן של רמות הגלוקוז בדם, קורס הזמן של Gir ואת רמות האינסולין בדם (הבסיס לצבוט). כפי שמוצג כאן, גלוקוז בצום (איור 4 א) ו - אינסולין (איור 4C) רמות גבוהות יותר של עכברים שקיבלו תזונה שומן גבוה, מעיד על עמידות לאינסולין. הצגת קורס זמן של רמות הסוכר לאורך כל תקופת המחקר מהדק (איור 4A) מאפשר לקורא להעריך כמה טוב euglycemia נשמרה, אשר מעיד על האיכות של מהדק. באופן דומה, כמובן זמן של Gir (איור 4B) מאפשר לקורא כדי לקבוע כמה מהר למצב יציב, הושגה. מציג את הנתונים הללו כמו קורסים הזמן הוא משמעותי יותר אינפורמטיבי מאשר בפועל קונבנציונאלי הספרות אינסולין מהדק עכבר הצגת ניסוי 2 שעותכנקודת נתון אחד המייצג את ערכי הממוצע של תקופת "לצבוט" מוגדר (4-13). בדוגמה הנוכחית, רמות הגלוקוז היו שווים בין שליטה גבוהה שומן נמאס קבוצות, אבל Gir היה נמוך משמעותית גבוה שומן נמאס הקבוצה (איור 4B). זה מעיד על ליקוי בפעולה כל הגוף לאינסולין. קלאמפ היו גם רמות אינסולין גבוה גבוה שומן נמאס הקבוצה (איור 4C), נוסף התומך נוכחות של פנוטיפ עמידות לאינסולין אצל עכברים אלה. השימוש חליטות נותב איזוטופי מאפשר הערכה של פעילות האינסולין ברקמות ספציפיות. [3-3-H] הגלוקוז משמש כדי להעריך את שיעור הופעת גלוקוז אנדוגני (endoRa), המהווה מדד הייצור בכבד גלוקוז (HGP) ושער של כל הגוף היעלמות גלוקוז (Rd). בעוד אינסולין מדכאת לחלוטין HGP בעכברים שליטה, זו נפגעת אצל עכברים שקיבלו תזונה שומן גבוה (איור 4D). כמו כן, היכולת של בsulin לעורר Rd בעכברים לשלוט נפגעת אצל עכברים שקיבלו תזונה שומן גבוה (איור 4E). 2 [14 C] deoxyglucose משמש כדי להעריך את חילוף החומרים גלוקוז מדד (RG), מידה של ספיגת רקמות ספציפיות גלוקוז. כפי שניתן לראות בדוגמה זו, אינסולין מגורה ספיגת הגלוקוז לתוך שריר השלד נפגעת אצל עכברים שקיבלו תזונה שומן גבוה (איור 4F).

איור 1
איור 1: הכנת עורקים (A) ו - (ב) צנתרים ורידיים ו (ג) מסע tm. צנתרים העורקים מוכנים ידי החדרת פיסת 1.3 ס"מ PE-10 על 3 מ"מ לתוך חתיכת 6 ס"מ silastic 0.012 מזהה ". קצה PE-10 הוא משופעים כזה באורך שפוע כדי silastic הוא 0.9 ס"מ. ורידי צנתרים מבוצעים על ידי הזזה פיסה קטנה של 0.020 "מזהה 1.1 ס"מ silastic מסוף משופעים של פיסת 6 ס"מ של 0.012" silastic מזהה. .020 "silastic מזהה חתיכת משמש חרוז הרחקה ל se לרפא את קטטר אל הווריד וריד הצוואר. לגבי הרכבה של tm מסע, כל ס"מ 1.3 two-25 מד מחברים מוכנס לתוך כל אחד משני החלקים 3 ס"מ של PE-20. אלה הם מוחזקים ביחד על ידי חתיכה קטנה של silastic 0.040 מזהה ". המחברים כפופות ל 120 ° זווית מופרדים בזווית של ° 45. האסיפה כולו שקוע דבק סיליקון רפואי.

איור 2
איור 2: עכבר צינתור. צנתרים מושתלים בניתוח בעורק התרדמה השמאלי וריד הצוואר הימני. מסתיים ללא צנתרים הם מוחצנים מאחורי הראש ומחובר tm מסע. Tm מסע מוחדר מתחת לעור בין השכמות. זה מאפשר גישה וסקולרית במהלך הניסויים מהדק אינסולין ללא צורך לרסן, לטפל או להרדים את העכבר.

jpg "/>
איור 3: תיאור ההתקנה של קו הזמן לניסוי מהדק אינסולין. העכבר הוא קשור המסתובב ערוץ כפול שפועל כמרכז עירוי ומזרקים הדגימה. Setups טיפוסית לניסויים לא באמצעות חליטות נותב (א) ו - הן באמצעות [3-3-H] גלוקוז 2 [14 C] deoxyglucose (ב) מוצגים. קו הזמן של הליכים להקמת וביצוע מהדק אינסולין (ג) מוצג גם. במהלך מהדק, דגימות דם ( דם ) נלקחים כל 10 דקות כדי למדוד את רמת הסוכר בדם. Gir מותאם בהתאם כדי לשמור על euglycemia. דוגמאות של גלוקוז בדם הבסיס, אינסולין פלזמה, פלזמה ו [3-3-H] גלוקוז הם נלקחה ב t = -15 ו -5 דקות. דוגמאות עבור מהדק פלזמה [3-3-H] גלוקוז נלקחים בזמן t = 80, 90, 100, 110 ו - 120 עבור אינסולין מהדק בזמן t = 100 ו - 120 דקות. 2 [14 C] deoxyglucose מנוהל אחרי המדגם בזמן t = 120 דק 'ו - בlood נאסף ב t = 2, 15, 25 ו - 35 דקות אחרי. רקמות נלקחים אחרי המדגם = 35 דק 'לא.

איור 4
איור 4: תוצאות ניסוי אינסולין מהדק השוואת עכברים בדיאטה שליטה (Chow) לעכברים דיאטה שומן גבוהה (HFD). כמובן זמן של גלוקוז עורקי (א) ו Gir (B), הבסיס לצבוט אינסולין (C), EndoRa (ד), ו Rd (E) ואת שרירי השלד (הגסטרוקנמיוס ו vastus lateralis) RG (F) מוצגים. כל התוצאות מצביעות על ההשפעה של האכלה שומן גבוה כדי לגרום תנגודת לאינסולין.

Discussion

מהדק hyperinsulinemic-euglycemic, או מהדק האינסולין, הוא שנחשב את "תקן הזהב" שיטה להערכת פעילות האינסולין in vivo. טכניקה זו יושמה כמה מינים כולל בני אדם, כלבים, חולדות ועכברים. בהתחשב במספר גדל והולך של דגמים עכבר מהונדס עבור הפרעות מטבוליות, את המזעור של הטכניקה לשימוש בעכבר סיפקה התקדמות משמעותית למחקר מטבולי.

בעוד מושגים מאחורי מהדק את האינסולין הם פשוט, בפועל יש גישות שונות לביצוע ניסויים מהדק אינסולין. זו אינה נקודה טריוויאלית, שכן האופן שבו מתבצע הניסוי משפיע על התוצאות שהושגו 1. כאן אנו מציגים את הפרוטוקול המשמש את MMPC ונדרבילט. ההבדל העיקרי בין פרוטוקול שלנו ושל אחרים היא כי אנו משתמשים קטטר עורקי לקבלת דגימות דם. זאת בניגוד לגישה יותר בשימוש נרחב של obtaining דגימות דם על ידי ניתוק קצה הזנב 4, 7, 11, 12, 14-17. היתרון של דגימה מן קטטר עורקי היא כי הניסוי מתבצע עכבר מודעת מעצורים. דגימה מזנב לעתים קרובות מחייב ריסון עליות במדדי הלחץ כאשר דגימות דם גדולים נרכשים 1. הורמוני סטרס לעורר ייצור גלוקוז אנדוגני ולפגוע סילוק הגלוקוז 18, 19, פוטנציאל לתת את המראה של פנוטיפ עמידות לאינסולין. דגימה מן הזנב ניתק עשויים לדרוש בעלי חיים מיוחדים לטיפול מוסדי ועדת אישור השתמש בגלל האופי שלה מלחיץ. הליך צנתור עורקי פותחה כדי למנוע את הלחץ על העכבר של ניתוק זנב.

היבט מרכזי של ביצוע מלחציים אינסולין הוא היכולת לשמור על euglycemia. אין אלגוריתם שיכול לחזות נכונה כיצד Gir צריך להיות מותאם המבוסס על קריאות הסוכר בדם. כמו הניתוח,אנשי מנהלת מהדק ניסויים אינסולין יהפוך בקיאים שמירה euglycemia סביר רק דרך החוויה. חשוב לציין כי בשל שיעור גבוה יותר שלהם מטבולית פי נתוני מחקרים העכבר יהיה רועש מטבעו. זה הופך את המצגת המלאה של הנתונים, כולל קורסי זמן של גלוקוז Gir וערכים מוחלטים אינסולין פלזמה, endoRa, Rd ו - RG מכרעת על היכולת של כל קורא לפרש את התוצאות. שטף גלוקוז גבוה שיעורי העכבר (כ 5 פעמים גבוה יותר מאשר שיעור בבני אדם) צו תדירות גבוהה של גלוקוז הדגימה. בעוד נפח הדם של העכבר מוגבלת, תדר הדגימה המינימלי של אחת כל 10 דקות יש צורך להיות בטוחים כי מהדק הולם הושגה.

כפי שניתן לראות בתרשים 4, רמות אינסולין מהדק יכולים להיות שונים בין הקבוצות. גורמים כגון התערבויות דיאטה, מניפולציות מהונדס או הבדלי זנים הרקע יכול להשפיע fasטינג רמות אינסולין, אשר יכולים להשפיע על רמות אינסולין לאחר מכן תפס. פירוש תוצאות כאשר רמות האינסולין מהדק שונים יכולה להיות בעייתית. זה יכול להתייחס באופן ניסיוני על ידי ביצוע ניסויים טייס לבחור עירוי אינסולין כי שיעורי להשיג המקבילה לאינסולין מהדק רמות בין הקבוצות. לחלופין, ניתן להשתמש somatostatin לעכב הפרשת הורמון הלבלב, אינסולין גלוקגון יכול להיות מוחלף בקצב מבוקר בניסוי. גישה זו האחרונה נעשית יותר בדרך כלל מהדק אינסולין מאשר על חולדות ועכברים. אם גישות אלו ניסיוני לא נלקחים, Gir היציב יכול להיות מנורמל רמת אינסולין מהדק, או מדד הרגישות לאינסולין (S I) ניתן לגזור נתונים כמו מהדק שבו S = אני Gir / (G • ΔI), G הוא הריכוז היציב גלוקוז ΔI ההבדל בין אינסולין בצום ריכוזי מהדק. הנחה אחת עם הגישה גם היא כי רמת האינסולין מהדק מושגת היאבטווח שבו הרגישות לאינסולין קשורה באופן ליניארי רמת אינסולין על פי הקבוצה הנחקרת. הנחה זו האחרונה לא תחול כאשר משווים עמידות לאינסולין קבוצות רגישות לאינסולין. באופן אידיאלי, מינון אינסולין עקומת התגובה צריכה להיות שנוצר כדי לבחור את עירוי האינסולין המתאים. עם זאת, בגלל דרישת ניסויים נוספים, זה נעשה לעיתים רחוקות.

הרבגוניות מסופק על ידי צנתור עורקי משתרע על גישות ניסיוני מעבר מלחציים euglycemic. לדוגמה, מלחציים hyperglycemic, שבו הגלוקוז הוא החדיר בקצב משתנה כדי לשמור על היפרגליקמיה ביחס גלוקוז בצום, יכול לשמש כדי להעריך את תפקוד הלבלב אנדוגניים 2 vivo, 20, 21. המדידה של הפרשת אינסולין במהלך השלב הראשון במבחן זה מחייב רכישת תכופים של דגימות דם (כלומר כל 2-5 דקות), אשר אינה ישימה כאשר קבלת דגימות מקצה הזנב. יתר על כן,catecholamines גבוהות הנובעות הדגימה הזנב יכול לפגוע הפרשת אינסולין ולהגביר את הפרשת גלוקגון 22. פרוטוקול מהדק אינסולין יכול גם להיות שונה, כדי לאפשר רמות הגלוקוז ליפול היפוגליקמיה יחסית להעריך נגד הרגולציה תגובה 2, 23, 24. צנתור עורקי יכול לשמש גם כדי להעריך את הדינמיקה של חילוף החומרים של הגלוקוז במהלך התרגיל 25-30. זהו יתרון משמעותי על פני גישות קונבנציונליות שנערכו בנקודות זמן יחיד לפני ואחרי אימון או in vivo שרירים בודדים לשעבר. הטכניקות שהוצגו כאן יכול לשמש גם כדי להעריך לא רק הסוכר, אלא גם מטבוליזם חומצות שומן 31.

Disclosures

אין ניגודי אינטרסים הכריז.

Acknowledgments

עבודה זו נתמכה על ידי גרנט 5-U24-DK059637-10 למרכז מטבולית עכבר ונדרבילט Phenotyping.

References

  1. Ayala, J. E., Bracy, D. P., McGuinness, O. P., Wasserman, D. H. Considerations in the design of hyperinsulinemic-euglycemic clamps in the conscious mouse. Diabetes. 55, 390-397 (2006).
  2. Berglund, E. D., Li, C. Y., Poffenberger, G., Ayala, J. E., Fueger, P. T., Willis, S. E., Jewell, M. M., Powers, A. C., Wasserman, D. H. Glucose metabolism in vivo in four commonly used inbred mouse strains. Diabetes. 57, 1790-1799 (2008).
  3. Niswender, K. D., Shiota, M., Postic, C., Cherrington, A. D., Magnuson, M. A. Effects of increased glucokinase gene copy number on glucose homeostasis and hepatic glucose metabolism. J. Biol. Chem. 272, 22570-22575 (1997).
  4. Kim, H. J., Higashimori, T., Park, S. Y., Choi, H., Dong, J., Kim, Y. J., Noh, H. L., Cho, Y. R., Cline, G., Kim, Y. B., Kim, J. K. Differential effects of interleukin-6 and -10 on skeletal muscle and liver insulin action in vivo. Diabetes. 53, 1060-1067 (2004).
  5. Kim, J. K., Fillmore, J. J., Chen, Y., Yu, C., Moore, I. K., Pypaert, M., Lutz, E. P., Kako, Y., Velez-Carrasco, W., Goldberg, I. J., Breslow, J. L., Shulman, G. I. Tissue-specific overexpression of lipoprotein lipase causes tissue-specific insulin resistance. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 98, 7522-7527 (2001).
  6. Kim, J. K., Fillmore, J. J., Gavrilova, O., Chao, L., Higashimori, T., Choi, H., Kim, H. J., Yu, C., Chen, Y., Qu, X., Haluzik, M., Reitman, M. L., Shulman, G. I. Differential effects of rosiglitazone on skeletal muscle and liver insulin resistance in A-ZIP/F-1 fatless mice. Diabetes. 52, 1311-1318 (2003).
  7. Kim, J. K., Fillmore, J. J., Sunshine, M. J., Albrecht, B., Higashimori, T., Kim, D. W., Liu, Z. X., Soos, T. J., Cline, G. W., O'Brien, W. R., Littman, D. R., Shulman, G. I. PKC-theta knockout mice are protected from fat-induced insulin resistance. J. Clin. Invest. 114, 823-827 (2004).
  8. Kim, J. K., Gavrilova, O., Chen, Y., Reitman, M. L., Shulman, G. I. Mechanism of insulin resistance in A-ZIP/F-1 fatless mice. J. Biol. Chem. 275, 8456-8460 (2000).
  9. Kim, J. K., Gimeno, R. E., Higashimori, T., Kim, H. J., Choi, H., Punreddy, S., Mozell, R. L., Tan, G., Stricker-Krongrad, A., Hirsch, Inactivation of fatty acid transport protein 1 prevents fat-induced insulin resistance in skeletal muscle. J. Clin. Invest. 113, 756-763 (2004).
  10. Kim, J. K., Kim, H. J., Park, S. Y., Cederberg, A., Westergren, R., Nilsson, D., Higashimori, T., Cho, Y. R., Liu, Z. X., Dong, J., Cline, G. W., Enerback, S., Shulman, G. I. Adipocyte-specific overexpression of FOXC2 prevents diet-induced increases in intramuscular fatty acyl CoA and insulin resistance. Diabetes. 54, 1657-1663 (2005).
  11. Kim, J. K., Kim, Y. J., Fillmore, J. J., Chen, Y., Moore, I., Lee, J., Yuan, M., Li, Z. W., Karin, M., Perret, P., Shoelson, S. E., Shulman, G. I. Prevention of fat-induced insulin resistance by salicylate. J. Clin. Invest. 108, 437-446 (2001).
  12. Kim, J. K., Michael, P. revis, Peroni, S. F., Mauvais-Jarvis, O. D., Neschen, F., Kahn, S., Kahn, B. B., R, C., Shulman, G. I. Redistribution of substrates to adipose tissue promotes obesity in mice with selective insulin resistance in muscle. J. Clin. Invest. 105, 1791-1797 (2000).
  13. Kim, J. K., Zisman, A., Fillmore, J. J., Peroni, O. D., Kotani, K., Perret, P., Zong, H., Dong, J., Kahn, C. R., Kahn, B. B., Shulman, G. I. Glucose toxicity and the development of diabetes in mice with muscle-specific inactivation of GLUT4. J. Clin. Invest. 108, 153-160 (2001).
  14. Haluzik, M., Gavrilova, O., LeRoith, D. Peroxisome proliferator-activated receptor-alpha deficiency does not alter insulin sensitivity in mice maintained on regular or high-fat diet: hyperinsulinemic-euglycemic clamp studies. Endocrinology. 145, 1662-1667 (2004).
  15. Haluzik, M., Yakar, S., Gavrilova, O., Setser, J., Boisclair, Y., LeRoith, D. Insulin resistance in the liver-specific IGF-1 gene-deleted mouse is abrogated by deletion of the acid-labile subunit of the IGF-binding protein-3 complex: relative roles of growth hormone and IGF-1 in insulin resistance. Diabetes. 52, 2483-2489 (2003).
  16. Haluzik, M. M., Lacinova, Z., Dolinkova, M., Haluzikova, D., Housa, D., Horinek, A., Vernerova, Z., Kumstyrova, T., Haluzik, M. Improvement of insulin sensitivity after peroxisome proliferator-activated receptor-alpha agonist treatment is accompanied by paradoxical increase of circulating resistin levels. Endocrinology. 147, 4517-4524 (2006).
  17. Kim, H., Haluzik, M., Asghar, Z., Yau, D., Joseph, J. W., Fernandez, A. M., Reitman, M. L., Yakar, S., Stannard, B., Heron-Milhavet, L., Wheeler, M. B., LeRoith, D. Peroxisome proliferator-activated receptor-alpha agonist treatment in a transgenic model of type 2 diabetes reverses the lipotoxic state and improves glucose homeostasis. Diabetes. 52, 1770-1778 (2003).
  18. Deibert, D. C., DeFronzo, R. A. Epinephrine-induced insulin resistance in man. J. Clin. Invest. 65, 717-721 (1980).
  19. Rizza, R. A., Cryer, P. E., Haymond, M. W., Gerich, J. E. Adrenergic mechanisms for the effects of epinephrine on glucose production and clearance in man. J. Clin. Invest. 65, 682-689 (1980).
  20. Nunemaker, C. S., Wasserman, D. H., McGuinness, O. P., Sweet, I. R., Teague, J. C., Satin, L. S. Insulin secretion in the conscious mouse is biphasic and pulsatile. Am. J. Physiol. Endocrinol. Metab. 290, 523-529 (2006).
  21. Nunemaker, C. S., Zhang, M., Wasserman, D. H., McGuinness, O. P., Powers, A. C., Bertram, R., Sherman, A., Satin, L. S. Individual mice can be distinguished by the period of their islet calcium oscillations: is there an intrinsic islet period that is imprinted in vivo. Diabetes. 54, 3517-3522 (2005).
  22. Halter, J. B., Beard, J. C., Jr, P. orte, D, Islet function and stress hyperglycemia: plasma glucose and epinephrine interaction. Am. J. Physiol. 247, 47-52 (1984).
  23. Jacobson, L., Ansari, T., McGuinness, O. P. Counterregulatory deficits occur within 24 h of a single hypoglycemic episode in conscious, unrestrained, chronically cannulated mice. Am. J. Physiol. Endocrinol. Metab. 290, 678-684 (2006).
  24. Jacobson, L., Ansari, T., Potts, J., McGuinness, O. P. Glucocorticoid-deficient corticotropin-releasing hormone knockout mice maintain glucose requirements but not autonomic responses during repeated hypoglycemia. Am. J. Physiol. Endocrinol. Metab. 291, 15-22 (2006).
  25. Ayala, J. E., Bracy, D. P., James, F. D., Julien, B. M., Wasserman, D. H., Drucker, D. J. The glucagon-like peptide-1 receptor regulates endogenous glucose production and muscle glucose uptake independent of its incretin action. Endocrinology. 150, 1155-1164 (2009).
  26. Fueger, P. T., Bracy, D. P., Malabanan, C. M., Pencek, R. R., Granner, D. K., Wasserman, D. H. Hexokinase II overexpression improves exercise-stimulated but not insulin-stimulated muscle glucose uptake in high-fat-fed C57BL/6J mice. Diabetes. 53, 306-314 (2004).
  27. Fueger, P. T., Bracy, D. P., Malabanan, C. M., Pencek, R. R., Wasserman, D. H. Distributed control of glucose uptake by working muscles of conscious mice: roles of transport and phosphorylation. Am. J. Physiol. Endocrinol. Metab. 286, 77-84 (2004).
  28. Fueger, P. T., Heikkinen, S., Bracy, D. P., Malabanan, C. M., Pencek, R. R., Laakso, M., Wasserman, D. H. Hexokinase II partial knockout impairs exercise-stimulated glucose uptake in oxidative muscles of mice. Am. J. Physiol. Endocrinol. Metab. 285, 958-963 (2003).
  29. Fueger, P. T., Hess, H. S., Posey, K. A., Bracy, D. P., Pencek, R. R., Charron, M. J., Wasserman, D. H. Control of exercise-stimulated muscle glucose uptake by GLUT4 is dependent on glucose phosphorylation capacity in the conscious mouse. J. Biol. Chem. , (2004).
  30. Fueger, P. T., Li, C. Y., Ayala, J. E., Shearer, J., Bracy, D. P., Charron, M. J., Rottman, J. N., Wasserman, D. H. Glucose kinetics and exercise tolerance in mice lacking the GLUT4 glucose transporter. J. Physiol. 582, 801-812 (2007).
  31. Shearer, J., Coenen, K. R., Pencek, R. R., Swift, L. L., Wasserman, D. H., Rottman, J. N. Long chain fatty acid uptake in vivo: comparison of [125I]-BMIPP and [3H]-bromopalmitate. Lipids. 43, 703-711 (2008).

Tags

רפואה גיליון 57 גלוקוז אינסולין מלחציים עכברים עמידות לאינסולין סוכרת כבד שרירים מודע ללא ריסון לא הדגיש
Hyperinsulinemic-euglycemic Clamps ב, עכברים מודעת בלתי מרוסנת
Play Video
PDF DOI

Cite this Article

Ayala, J. E., Bracy, D. P.,… More

Ayala, J. E., Bracy, D. P., Malabanan, C., James, F. D., Ansari, T., Fueger, P. T., McGuinness, O. P., Wasserman, D. H. Hyperinsulinemic-euglycemic Clamps in Conscious, Unrestrained Mice. J. Vis. Exp. (57), e3188, doi:10.3791/3188 (2011).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter