Summary
تقدم هذه المقالة قوية لبروتوكول العزلة وثقافة العصبية من الخلايا الجذعية قمة بصيلات الشعر البشري.
Abstract
نمو بصيلات الشعر الخضوع لمدى الحياة ودورة الشعر هو عملية تنطوي على رقابة جيدة تكاثر الخلايا الجذعية والسكون. انتفاخ الشعر هو عبارة عن كوة جيدة تتميز عن الخلايا الجذعية البالغة 1. هذا الجزء من غمد الجذر الخارجي يحتوي على عدد من أنواع مختلفة من الخلايا الجذعية، بما في ذلك الخلايا الجذعية الظهارية 2، الخلايا الجذعية الخلايا الصباغية 3 و قمة العصبية مثل الخلايا الجذعية 4-7. بصيلات الشعر تمثل مصدرا غنيا للوصول وبالنسبة لأنواع مختلفة من الخلايا الجذعية البشرية. عزلت نحن وغيرنا الخلايا الجذعية العصبية قمة (NCSCs) من بصيلات الشعر الإنسان الجنين والكبار 4،5. هذه الخلايا الجذعية البشرية هي التسمية الاحتفاظ الخلايا وتكون قادرة على التجديد الذاتي من خلال انقسام الخلايا غير المتماثلة في المختبر. يعبرون عن خلية غير ناضجة قمة العصبية ولكن ليس علامات علامات التمايز. وأظهرت دراستنا التنميط التعبير مفادها أنهما يتقاسمان نمط التعبير الجيني مماثلة مع الفئران غير ناضجة لجنة المساواة العرقية الجلد العصبيسانت الخلايا. يعرضون multipotency نسيلي التي يمكن أن تؤدي إلى خلية الأنساب عضلي، الصباغية، والخلايا العصبية في المختبر بعد نسيلي الثقافة خلية واحدة. الخلايا المتمايزة لا يكتسب فقط نسب محددة ولكن أيضا علامات تظهر وظائف مناسبة في ظروف فيفو السابقين. وبالإضافة إلى ذلك، تظهر هذه NCSCs المحتملة التمايز نحو الأنساب الوسيطة. يمكن الخلايا العصبية في الدماغ لا تزال قائمة متباينة الماوس والاحتفاظ علامات التمايز العصبية. فقد تبين أن الشعر جريب المستمدة NCSCs إعادة نمو الأعصاب يمكن أن تساعد، وأنها تحسن وظيفة السيارات في الفئران مع زرع هذه الخلايا الجذعية بعد إصابة الحبل الشوكي transecting 8. وعلاوة على ذلك، تم إصلاح الأعصاب الطرفية مع ترقيع الخلايا الجذعية 9، وغرس الخلايا المشتقة من السلائف الجلد المجاور لسحق الأعصاب الوركي أدى إلى عودة الميالين 10. ولذلك، فقد أظهرت جريب الشعر / البشرة NCSCs المستمدة بالفعل نتائج واعدة للبحثegenerative العلاج في نماذج قبل السريرية.
وقد أظهرت الجسدية الخلايا إعادة برمجة الخلايا المحفزة التي يسببها ل(آي بي إس) الجذعية إمكانات هائلة للطب التجديدي. ومع ذلك، هناك العديد من القضايا لا تزال مع خلايا الجذع، وخاصة تأثير على المدى الطويل من الجين الورمي / فيروس التكامل وtumorigenicity المحتملة للخلايا الجذعية المحفزة لم تعالج على نحو كاف. لا تزال هناك الكثير من العقبات التي يتعين التغلب عليها قبل أن تتمكن من استخدام خلايا الجذع للطب التجديدي. بينما من المعروف أن الخلايا الجذعية البالغة لتكون آمنة واستخدمت فيها سريريا لسنوات عديدة، مثل زرع نخاع العظام. وقد استفاد العديد من المرضى بالفعل من العلاج. ذاتي الخلايا الجذعية البالغة لا تزال الخلايا المفضل للزرع. ولذلك، فإن الجذعية البالغة يمكن الوصول إليها بسهولة وقابلة للتوسيع الخلايا في بصيلات الجلد / شعر الإنسان تعد مصدرا قيما للطب التجديدي.
Protocol
1. إعداد لوحات زراعة الأنسجة
- معطف كل بئر بما فيه الكفاية مع بولي D-يسين (PDL) لتغطية الجزء السفلي من البئر. السماح لوحات ليجف في غطاء محرك السيارة.
- بعد الآبار جافة، وشطف مع الماء المعقم، ونضح. السماح لوحات ليجف في غطاء محرك السيارة.
- عندما تجف، ومعطف مع فبرونيكتين (الذي تم حله في الماء بين عشية وضحاها في 37 biowhittaker ° C بتركيز 1 ملغ في 6 مل).
- إضافة NCSC المتوسطة [95 مل DMEM/F12، 1 مل بن / بكتيريا (P / S)، 1 مل N2، 2 مل B27، 100 ميكرولتر المركابتويثانول (2ME و 50 ملي الأسهم)، bFGF (20 نانوغرام / مل متوسطة)، IGF -1 (20 نانوغرام / مل من المتوسط) وEGF (20 نانوغرام / مل من المتوسط)] قبل فبرونيكتين الجافة في لوحات،
2. استخراج خلايا بصيلات الشعر من فروة الرأس الإنسان
- قبل البدء في إجراءات عزل NCSCs، ويحتاج المرء لإعداد الوسائط منها والكواشف (انظر الجدول 1).
- العذبة الكبار الجلد فروة الرأس الإنسان من إجراءات عمليات تجميل أو الحديديتم جمع تل الأنسجة فروة الرأس، وغسلها مع PBS تحتوي على البنسلين، الستربتوميسين.
- ثم يتم نقل الجلد إلى 50 مل أنابيب وحضنت في DMEM مع Dispase (10 ملغ / مل) بين عشية وضحاها في C. ° 4 الحضانة لمدة 2-4 ساعة عند 37 درجة مئوية فعال أيضا. يجب أن تكون قطعة الجلد أقصى عرض لها 1 سم للسماح للإنزيم لاختراق.
- نقل الجلد إلى طبق بتري معقمة؛ سحب قبالة كل الشعر من الجلد عن طريق استيعاب جذع الشعرة بالقرب من سطح الجلد وسحب بقوة وسلاسة. بصيلات الشعر تظهر مورفولوجية إما طور التنامي (الشكل 1A) أو تساقط الشعر (1B الشكل).
- احتضان شظايا جريب المعزولة في 0.05٪ التربسين EDTA-(إينفيتروجن) لمدة 15-20 دقيقة في درجة حرارة الغرفة مع اهتزاز دوري، إضافة 4 مل DMEM FBS مع 10٪ لوقف رد الفعل. وtrypsinized الظهارة الجريبي وتصفيتها من خلال 40 ميكرون مرشح للحصول على تعليق وحيد الخلية التي تحتوي على الخلايا متفاوتة الحجم والشكل.
- غزلفي 200 x ج لمدة 5 دقائق، تجاهل طاف بعناية، في 1 مل PBS تحتوي على مصل 2٪ (FBS) إعادة تعليق.
- وبدلا من ذلك، يمكن وضع بصيلات الشعر في الثقافة التقطه دون الهضم التربسين أن ينمو الشعر المجالات في الموقع.
3. عزل NCSCs بصيلات الشعر عن طريق الفرز تدفق خلية Cytometric
- تم الحصول على شعر جريب وحيدة الخلية التعليق من التربسين الهضم وصفت مع الأجسام المضادة ضد CD271 (APC-مترافق) / HNK1 (FITC، مترافق) أو CD271 / alpha4 إنتغرين (PE-مترافق) لمدة 40 دقيقة على الجليد في الظلام.
- أجهزة الطرد المركزي لمدة 5 دقائق في 200 XG في درجة حرارة الغرفة ونضح طاف.
- الخلايا التي تحتوي على resuspend في المصل PBS 2٪ (FBS)، وقبل الفرز، يتم إضافة PI إلى بوابة الخروج من الخلايا الميتة.
- أداء الفرز الخلية التدفق الخلوي (FACS). جمع CD271 +، + HNK1 الخلايا إيجابية مزدوجة أو CD271 +، + alpha4 إنتغرين الخلايا إيجابية مزدوجة (الشكل 2).
- بعد الفرزجي، CD271 +، + HNK1 الخلايا إيجابية مزدوجة أو CD271 +، alpha4 يتم استزراع الخلايا إنتغرين + الإيجابية لوحات مزدوجة في المرفقات البالغة الانخفاض على المدى المتوسط NCSC
4. ثقافة NCSCs الابتدائية
- ثقافة الخلايا الجرابية أو نأت FACS فرزها في لوحات خلايا المرفقات البالغة الانخفاض على المدى المتوسط NCSC، تغيير المتوسطة كل يوم.
- تحقق زراعة الخلايا كل يوم تحت المجهر. وسوف تبدأ لتشكيل NCSCs المجاميع الصغيرة العائمة بعد عدة أيام وكذلك المجالات التي شكلت في 2-5 أسابيع في الثقافة اعتمادا على العمر من الجهات المانحة (الشكل 3A). وسوف تظهر في ثمرة بضعة أيام في المنطقة وكذلك انتفاخ شكلت المجالات في الموقع في غضون عدة أسابيع (الشكل 3B) عندما يتم تربيتها بصيلات الشعر كله على المدى المتوسط NCSC.
5. توسيع NCSCs
- غسل الخلايا مع برنامج تلفزيوني واحد.
- إضافة قبل تحسنت (إلى 37 ° C، الحرجة) accutase واحتضان عند 37 درجة مئوية لمدة 5-10دقيقة مع اهتزاز دوري للتأكد من الخلايا الجذعية العصبية في مجالات فصل خلية واحدة (NCSC لمرفق مثقف، والخلايا احتضان مع accutase عند 37 درجة مئوية لمدة 5 دقائق للتأكد من الخلايا الجذعية الشعر جريب فصل).
- غسل الخلايا مرتين وأجهزة الطرد المركزي لمدة 5 دقائق في 200 XG في درجة حرارة الغرفة في DMEM/F12 المتوسطة لإزالة أي حل accutase المتبقية.
- اعادة تعليق الخلايا مع ثقافة المتوسط NCSC.
- للثقافة عائمة، وضع لوحات الخلايا في المرفقات منخفضة للغاية. للثقافة المرفقات، وضعت الخلايا في سابقة التجهيز لوحات زراعة الأنسجة.
6. ممثل النتائج
NCSC ثقافة المتوسط كافية للحفاظ على hNCSCs في حالة غير متمايزة دون الحاجة لخلايا المغذية. سوف تتكاثر الخلايا الكيراتينية لا ومات تدريجيا في المتوسط. وبعض الخلايا مستديرة صغيرة تتكاثر وتشكل مجاميع صغيرة في التعليق بعد 3 إلى 5 أيام. هذه المجاميع العائمة زيادة ببطء طن الحجم، ولدت ثلاثية الأبعاد المجال مثل الهياكل، ونحن ووصف مجالات الشعر (الشكل 3A). إذا المستزرعة في لوحات مطلية، فإن NCSCs نعلق على السطح وليس تشكيل أي المجالات. وNCSCs المرفقة تنمو بشكل أسرع مما كان عليه في التعليق. الخلايا الجذعية المكونة المجال أو التعبير عن علامات NCSCs المرفقة. عندما بصيلات الشعر بأكمله والثقافات، وتشكل المجالات في المنطقة المقابلة لمنطقة انتفاخ (الشكل 3B).
الشكل 1. التقطه طور التنامي (A) وتساقط الشعر بصيلات الشعر (B).
الشكل 2. صور ممثل تحليل FACS من NCSCs اللوحة اليمنى: الخلايا هي بوابات استخدام الألغام المضادة للCD271 ومكافحة alphe-4 إنتغرين الأجسام المضادة. الحق وحة: الخلايا باستخدام بوابات الأجسام المضادة المقاومة للCD271 ومكافحة HNK1-.
الشكل 3. مورفولوجية مجالات الشعر (A) من الصرف العائمة مجالات الشعر، لوحة من الزمن: انخفاض القوة، والحق الفريق بما يلي: الطاقة العالية (B) من الصرف المجال الشعر في الموقع في المنطقة انتفاخ، لوحة من الزمن: كرة الشعر في طور الراحة انتفاخ، اللوحة اليمنى: كرة الشعر في المنطقة من انتفاخ بصيلات الشعر طور التنامي.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
الخلية العزلة والثقافة الأساليب المذكورة هي استنساخه وقوية. ونحن قد ولدت NCSCs من عشرات الأفراد عبر مجموعة واسعة العمر. على الرغم من أنه من الأفضل معالجة الأنسجة مباشرة بعد الحصاد الأنسجة، وجدنا أن الأنسجة يمكن تخزينها بأمان فروة الرأس في وسائل الإعلام على الجليد لنقل بين عشية وضحاها مع تأثير ضئيل على بقاء الخلية.
من المهم لعلاج فروة الرأس والأنسجة واستخدام المضادات الحيوية مع تقنية العقيم خلال العزلة بصيلات الشعر لتجنب التلوث المحتملة الكائنات الحية الدقيقة. تجاهل عمليات تجميل الجلد أو فروة الرأس الجنين الأنسجة عائدات مئات من بصيلات قابلة للحياة، وعادة ما تولد الأنسجة كافية للفرز FACS أو تجارب أخرى في غضون أيام قليلة فقط. لكمة خزعة من أنسجة فروة الرأس عادة ما يولد عدد محدود من الخلايا والأنسجة يتطلب إضافية الثقافة لإنتاج خلايا كافية لتجارب أخرى.
NCSCs الجنينية تؤدي إلى عدد وافر من مختلفأنواع الخلايا في الجسم 11، ويبدو أن الشعر جريب NCSCs المستمدة أيضا لديها مجموعة واسعة من القدرات التمايز. انتفاخ الشعر هو مكانة لنوع مختلف من الخلايا الجذعية 3،12. وقد أظهرت لايل وزملاؤه عزل الخلايا الجذعية الظهارية الإنسان من انتفاخ الشعر وهذه الخلايا هي قوية متعددة على طول الأنساب الظهارية 13. السلائف الخلايا الصباغية الموجودة أيضا في انتفاخ الشعر 3. ولذلك فمن الممكن عزل في وقت واحد مجموعات مختلفة من الخلايا الجذعية من الخلايا المشتقة من زراعة بصيلات الشعر في وسائل مع نوع مختلف من عوامل النمو. الشعر الخلايا الجذعية المستمدة جريب هي مصدر واعد لعلاج الخلايا التجدد.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
ليس لدينا شيء في الكشف عنها.
Acknowledgments
ويدعم هذا العمل من قبل المعاهد الوطنية للصحة منح R01AR054593 وR01AR054593-S1 لشو.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM | Invitrogen | 11965-092 | |
| DMEM/F12 | Invitrogen | 11330-32 | |
| Heat-inactivated FBS | Hyclone | SH30071.03 | |
| B27 supplement | Invitrogen | 17504044 | |
| N2 supplement | Invitrogen | 17502048 | |
| bFGF | Invitrogen | PHG0026 | |
| EGF | R&D system | 236-EG-01M | |
| IGF-I | R&D system | 291-G1-050 | |
| 0.05% Trypsin/EDTA | Invitrogen | 25300-054 | |
| Dispase | Invitrogen | 17105041 | |
| Penicillin-Streptomycin | Invitrogen | 15070063 | |
Table 1. |
|||
References
- Cotsarelis, G., Cheng, S. Z., Dong, G., Sun, T. T., Lavker, R. M. Existence of slow-cycling limbal epithelial basal cells that can be preferentially stimulated to proliferate: implications on epithelial stem cells. Cell. 57, 201-209 (1989).
- Cotsarelis, G., Sun, T. T., Lavker, R. M. Label-retaining cells reside in the bulge area of pilosebaceous unit: implications for follicular stem cells, hair cycle, and skin carcinogenesis. Cell. 61, 1329-1337 (1990).
- Tanimura, S., et al. Hair follicle stem cells provide a functional niche for melanocyte stem cells. Cell Stem Cell. 8, 177-187 (2011).
- Yu, H., et al. Isolation of a novel population of multipotent adult stem cells from human hair follicles. Am. J. Pathol. 168, 1879-1888 (2006).
- Yu, H., Kumar, S. M., Kossenkov, A. V., Showe, L., Xu, X. Stem cells with neural crest characteristics derived from the bulge region of cultured human hair follicles. J. Invest. Dermatol. 130, 1227-1236 (2010).
- Wong, C. E., et al. Neural crest-derived cells with stem cell features can be traced back to multiple lineages in the adult skin. J. Cell Biol. 175, 1005-1015 (2006).
- Sieber-Blum, M., Grim, M., Hu, Y. F., Szeder, V. Pluripotent neural crest stem cells in the adult hair follicle. Dev. Dyn. 231, 258-269 (2004).
- Amoh, Y., et al. Implanted hair follicle stem cells form Schwann cells that support repair of severed peripheral nerves. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 102, 17734-17738 (2005).
- Koliatsos, V. E., Xu, L., Yan, J. Human stem cell grafts as therapies for motor neuron disease. Expert Opin. Biol. Ther. 8, 137-141 (2008).
- McKenzie, I. A., Biernaskie, J., Toma, J. G., Midha, R., Miller, F. D. Skin-derived precursors generate myelinating Schwann cells for the injured and dysmyelinated nervous system. J. Neurosci. 26, 6651-6660 (2006).
- LeDouarin, N. M., Kalcheim, C. The Neural Crest. , Cambridge University Press. Cambridge. (1999).
- Tumbar, T., et al. Defining the epithelial stem cell niche in skin. Science. 303, 359-363 (2004).
- Roh, C., et al. Multi-potentiality of a new immortalized epithelial stem cell line derived from human hair follicles. In Vitro Cell Dev. Biol. Anim. 44, 236-244 (2008).
