Summary
이 문서는 인간의 모낭에서 신경 문장의 줄기 세포의 분리와 문화에 대한 강력한 프로토콜을 제공합니다.
Abstract
모낭은 평생 성장을 받아야과 헤어 사이클은 줄기 세포 증식 및 정지를 포함 잘 제어 과정입니다. 헤어 팽창은 성인의 줄기 세포 1에 대한 잘 특징 틈새 시장입니다. 바깥 쪽 루트 피복의이 부분은 상피 줄기 세포 2, melanocyte 줄기 세포 3 4-7 줄기 세포와 같은 신경 문장을 포함한 줄기 세포의 다른 유형의 번호를 포함하고 있습니다. 모낭은 인간 줄기 세포의 다른 유형에 대한 접근과 풍부한 소스를 나타냅니다. 우리와 다른 사람들은 4,5 인간의 태아 및 성인 모낭에서 신경 문장의 줄기 세포를 (NCSCs) 분리했습니다. 이러한 인간의 줄기 세포는 라벨 - 유지 전지이며, 체외에서 비대칭 세포 분열을 통해 자기 갱신 할 수 있습니다. 그들은이지나 신경 크레스트 세포 마커가 아닌 차별화 마커를 표현한다. 우리 식 프로파일 연구들은 손쥐 피부에 미숙 한 신경 cre와 유사한 유전자 발현 패턴을 공유했다성 세포. 그들은 체외 clonal 하나의 세포 배양에 후, myogenic melanocytic, 그리고 neuronal 세포 lineages을 야기 할 수 있습니다 clonal multipotency을 나타냅니다. 차별화 된 세포는 계보 (Lineage) - 특정 마커를 취득뿐만 아니라 전 생체 조건에 적합한 기능을 보여줍니다 없습니다. 또한 이러한 NCSCs는 중간 엽 lineages 대한 차별화의 잠재력을 보여줍니다. 차별화 된 neuronal 세포는 마우스의 뇌에 계속하고 neuronal 차별화 마커를 유지 할 수 있습니다. 그것은 머리가 NCSCs 신경 regrowth을 할 수 있습니다 파생 고치, 그리고 그들이 끊어 버렸네 척추 부상 8 다음이 줄기 세포를 이식 마우스에 모터 기능을 향상시키는 것이 보여왔다. 또한, 주변 신경은 줄기 세포 이식은 9, 눌린 좌골 신경에 인접 해 피부 파생 전구체 세포의 주입과 수리 된 remyelination 10 결과입니다. 따라서 헤어 대과 / 피부 파생 NCSCs은 이미 연구에 대한 긍정적 인 결과를 보여 주었다잠복기 모델 egenerative 치료.
유도 만능 줄기 (IPS) 셀에 재 프로그램 체세포는 재생 의료에 대한 엄청난 잠재력을 보여 주었다. 그러나, 특히 IPS 세포, 종양 유전자 / 바이러스 통합 만능 줄기 세포의 잠재적 tumorigenicity의 장기적 효과 아직 많은 문제를 적절하게 해결되지 않은이 있습니다. IPS 세포는 재생 의료에 사용하기 전에 극복 할 많은 장애물은 여전히 있습니다. 성인 줄기 세포는 안전한 것으로 알려져 있으며, 그들은 같은 골수 이식 등 많은 년에 임상 적으로 사용되었습니다 반면. 대부분의 환자는 이미 치료의 혜택을했습니다. Autologous 성인 줄기 세포는 아직 이식에 대한 선호 세포입니다. 따라서, 인간의 피부 / 머리카락 모낭에 쉽게 액세스 할 수 있으며 확장이 성인 줄기 세포는 재생 의료에 대한 가치있는 소스입니다.
Protocol
1. 조직 문화 플레이트의 작성
- 코트는 각이 잘 폴리-D-리신 (PDL)이 우물의 바닥을 커버 할 수있을만큼. 플레이트는 후드에서 건조하도록 허용합니다.
- 우물이 건조 후, 멸균 물을 헹구고, 대기음. 플레이트는 후드에서 건조하도록 허용합니다.
- 때 fibronectin과 건조, 코트 (6 ML 1 밀리그램의 농도에서 37 ° C에서 하룻밤 biowhittaker 물에 용해 된 것).
- NCSC 매체를 추가합니다 [95 ML DMEM/F12, 1 ML 펜 / 패 혈성 (P / S), 1 ML N2, 2 ML B27, 100 μl 메르 캅토 에탄올 (2ME, 50 MM 주식), bFGF는 (20 NG / ML 중간), IGF -1 (20 NG / 매체의 ML)과 EGF (20 NG / 매체의 ML)] 접시에 건조하기 전에 fibronectin,
2. 인간의 두피에서 헤어 소낭 세포를 추출
- 분리 NCSCs의 절차를 시작하기 전에, 하나는 (표 1 참조) 각 매체와 시약을 준비해야합니다.
- 새롭게 단장 절차 나 FE 신선한 성인의 두피 피부할거야, 두피 조직은 PBS의 페니실린 - 스트렙토 마이신을 포함하는으로 씻어 수집하고 있습니다.
- 피부 후 50 ML 튜브로 옮겨와 4 ° C.에서 하루 아침에 Dispase (10 MG / ML)과 DMEM에 incubated 수 있습니다 37 번 2-4 시간을위한 부화는 ° C도 효과적입니다. 피부 조각이 관통하는 효소를 허용하는 1cm의 최대 너비해야합니다.
- 소독 페트리 접시에 피부를 전송하고, 피부 표면 근처에 머리 샤프트을 쥐었고 단단히하고 부드럽게 당겨 피부의 각 머리를 당긴다. 모낭은 anagen (그림 1A) 또는 telogen (그림 1B) 또는의 형태를 보여줍니다.
- 주기적으로 진동과 실내 온도 15-20 분 동안 0.05 % 트립신 - EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) (Invitrogen)에 절연 고치 조각을 길러, 반응을 중지 10 % FBS와 4 ML DMEM을 추가합니다. follicular 상피는 trypsinized와 다양한 크기와 모양의 세포를 포함하는 단일 셀 정지를 얻기 위해 필터 40 μm를 통해 필터링됩니다.
- 회전5 분 200 XG에, 1 ML PBS는 2 % 혈청 (FBS)을 포함에 다시 중지 조심스럽게 표면에 뜨는 폐기하십시오.
- 또한 뽑혀 모낭은 원위치에 헤어 분야를 성장 트립신 소화하지 않고 문화에 배치 할 수 있습니다.
3. 흐름 Cytometric 셀 정렬을 사용하여 헤어 소낭의 NCSCs의 절연
- 헤어 대과 단일 셀 정지는 트립신의 소화에 의해 획득 및 CD271 (APC-복합) / HNK1 (FITC-복합) 또는 CD271 / alpha4 어둠 속에서 얼음에 40 분 인테그린 (PE-복합)에 대한 항체로 분류되었습니다.
- 상온에서 200 XG에서 5 분 동안 원심 분리기와 표면에 뜨는을 대기음.
- PBS는 2 % 혈청 (FBS)을 포함에 Resuspend 세포 및 정렬하기 전에 PI는 죽은 세포 밖으로 게이트에 추가됩니다.
- 유동 세포 계측법 (FACS)에 의해 세포 정렬을 수행합니다. CD271를 수집 +, HNK1 + 더블 긍정적 인 셀 또는 CD271 +, alpha4 인테그린 + 더블 긍정적 인 세포 (그림 2).
- 후 정렬ING, CD271 +, HNK1 + 더블 긍정적 인 셀 또는 CD271 +, alpha4 인테그린 + 더블 긍정적 인 셀은 NCSC 매체에 초저 첨부 파일 접시에 배양 아르
4. 기본 NCSCs의 문화
- 문화 disassociated follicular 세포 또는 FACS는 NCSC 매체의 초저 첨부 파일 접시에 세포를 정렬 매일 매체를 변경합니다.
- 현미경으로 매일 세포 배양을 확인합니다. NCSCs는 여러 일 기증자 (그림 3A)의 나이에 따라 문화에 2~5주에서 잘 구성된 영역 이후 부동 작은 응집체를 형성하기 시작합니다. 가지가 솟아 오른 지역 여러 주 동안 현장에서 잘 구성된 영역 (그림 3B) 전체 모낭은 NCSC 매체에 배양 아르에서 몇 일에 나타납니다.
5. NCSCs의 확장
- 한 번 PBS로 세포를 씻으십시오.
- 사전 예열을 추가 (37 ° C, 임계) 37시 accutase 및 배양 ° C 5-10에하나의 셀에 있는지 신경 줄기 세포 분야는 dissociated하기 위해 주기적으로 진동이있는 분 (첨부 파일 양식 NCSC, 37에서 accutase과 배양 세포에 대한 확인 헤어 소낭의 줄기 세포 분리하기 위해 5 분에 대한 ° C).
- 남아있는 accutase 솔루션을 제거 할 DMEM/F12 중간에 상온 200 XG에서 5 분에 두 번 세척하고 세포를 원심 분리기.
- NCSC 문화 매체와 세포를 다시 일시 중지합니다.
- 부동 문화를 들어, 초저 첨부 파일 플레이트에 세포를 넣어. 첨부 파일 문화를 들어, pretreated 조직 배양 플레이트에 세포를 넣어.
6. 대표 결과
NCSC 문화 매체 피더 셀 필요없이 undifferentiated 상태에서 hNCSCs를 유지하기에 충분합니다. Keratinocytes는 세포 분열 따위에 의해 번식하고 점차 매체에서 죽었되지 않습니다. 특정 작고 둥근 세포가 세포 분열 따위에 의해 번식하고 3-5일 후 정지의 작은 집합체를 형성합니다. 이러한 부동 집계는 천천히 증가우리가 헤어 분야 (그림 3A)이라고한다 N의 크기, 생성 입체 영역과 같은 구조. 코팅 접시에 배양하면 NCSCs는 표면에 부착하고 영역을 형성하지 않습니다. 첨부 NCSCs는 중지보다 더 빠르게 성장합니다. 영역 - 성형 또는 첨부 된 줄기 세포는 NCSCs 마커를 표현한다. 전체 모낭이 문화가되면 영역이 솟아 오른 지역 (그림 3B)에 해당하는 지역에서 형성된다.
1 그림. anagen (A)와 telogen (B) 모낭을 뜯어 낸.
그림 2. NCSCs의 FACS 분석의 대표 이미지 왼쪽 패널 :. 셀 안티 CD271 및 안티 alphe 4 인테그린 항체를 사용하여 출입을 금지합니다. 오른쪽 패널 : 셀 안티 CD271 및 안티 HNK1 항체를 사용하여 출입을 금지 아르.
그림 3. 헤어 분야의 형태 부동 헤어 분야, 왼쪽 패널의 (A) 형태론 :. 저전력, 오른쪽 패널 :. 높은 전력 (B) 솟아 오른 지역, 왼쪽 패널에서 원래의 장소에 헤어 영역의 형태론 : telogen의 팽창에서 헤어 영역, 오른쪽 패널 : anagen 헤어 소낭의 볼록한 지역에서 헤어 영역.
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Discussion
설명 셀 절연과 문화 방법은 재현하고 강력한 있습니다. 우리는 폭 넓은 연령대에 걸쳐 개인의 수십에서 NCSCs를 생성했습니다. 그것은 바로 조직의 수확 후 조직을 처리하는 것이 좋습니다 있지만, 우리는 두피의 조직이 안전하게 세포 생존에 미치는 영향을 최소화 하루 아침에 교통 얼음의 미디어에 저장할 수 있습니다 것으로 나타났습니다.
이 항생제로 두피 조직을 치료하고 잠재적 인 미생물의 오염을 방지하기 위해 머리 소낭 격리하는 동안 무균 기술을 사용하는 것이 중요합니다. 보통 폐기 새롭게 단장의 피부 나 가능한 모낭 태아 두피 조직 수율의 수백은 단 몇 일 만에 FACS 정렬이나 추가 실험을위한 충분한 조직을 생성합니다. 두피 조직의 펀치 생검은 보통 세포의 제한된 수의 생성 및 추가 실험을위한 충분한 세포를 생산하기 위해 추가의 문화 조직이 필요합니다.
배아 NCSCs 서로 다른 수많은을 야기 할 수몸 11 셀 유형, 그것은 머리가 차별화 용량의 폭 넓은 스펙트럼을 가지고도 파생 NCSCs을 고치 것으로 나타났습니다. 헤어 팽창은 줄기 세포 3,12의 다른 유형에 대한 틈새 시장입니다. 라일과 동료 머리 팽창에서 인간 상피 줄기 세포의 절연을 표시하고 이러한 세포는 상피 lineages 13 함께 여러 강력한입니다. Melanocyte 전구체는 또한 머리 솟아 오른 3 거주. 그것은 동시에 성장 요소의 다른 유형의 매체에 배양의 머리를 고치 파생 세포 줄기 세포의 다양한 인구를 분리하는 것이 가능합니다. 헤어 대과 파생 된 줄기 세포는 세포 재생 치료에 대한 유망 소스입니다.
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Disclosures
우리는 공개 할 아무 것도 없습니다.
Acknowledgments
이 작품은 NIH 보조금 R01AR054593와 슈에 R01AR054593-S1에 의해 지원됩니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM | Invitrogen | 11965-092 | |
| DMEM/F12 | Invitrogen | 11330-32 | |
| Heat-inactivated FBS | Hyclone | SH30071.03 | |
| B27 supplement | Invitrogen | 17504044 | |
| N2 supplement | Invitrogen | 17502048 | |
| bFGF | Invitrogen | PHG0026 | |
| EGF | R&D system | 236-EG-01M | |
| IGF-I | R&D system | 291-G1-050 | |
| 0.05% Trypsin/EDTA | Invitrogen | 25300-054 | |
| Dispase | Invitrogen | 17105041 | |
| Penicillin-Streptomycin | Invitrogen | 15070063 | |
Table 1. |
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References
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