Summary
Данная статья представляет собой надежный протокол для изоляции и культуры нервного гребня стволовых клеток из человеческого волоса.
Protocol
1. Подготовка пластин тканевой культуры
- Пальто каждую лунку с достаточно поли-D-лизин (PDL), чтобы покрыть дно скважины. Разрешить пластин для просушки на капоте.
- После того, как скважины сухие, промыть стерильной водой и аспирации. Разрешить пластин для просушки на капоте.
- При сухой, пальто с фибронектин (который растворяют в воде BioWhittaker течение ночи при 37 ° C при концентрации 1 мг в 6 мл).
- Добавить NCSC среды [95 мл DMEM/F12, 1 мл Penn / Strep (P / S), 1 мл N2, 2 мл B27, 100 мкл меркаптоэтанола (2ME, 50 мМ), шФРФ (20 нг / мл среды), IGF -1 (20 нг / мл среды) и ЭФР (20 нг / мл среды)] до фибронектина сухой плиты,
2. Извлечение клетки волосяного фолликула от головы человека
- Перед началом процедуры выделения NCSCs, нужно подготовить соответствующие СМИ и реагентов (см. Таблицу 1).
- Свежий взрослого человека кожа головы от подтяжку лица процедуры или FeТаль тканей волосистой части головы собирают, промывают PBS, содержащих пенициллин, стрептомицин.
- Кожа затем переносят в 50 мл пробирок и инкубируют в DMEM с диспазы (10 мг / мл) в течение ночи при 4 ° C. Инкубация в течение 2-4 ч при 37 ° C является также эффективным. Кожа частей должна быть максимальной шириной 1 см, чтобы обеспечить фермента проникнуть.
- Передача кожу в стерилизованные чашки Петри; снять каждый волос с поверхности кожи, держа волос у поверхности кожи и потянув твердо и гладко. Волосяные фолликулы показать морфологии либо анаген (рис. 1А) или телоген (рис. 1б).
- Инкубируйте отдельные фрагменты фолликула в 0,05% трипсина-EDTA (Invitrogen) в течение 15-20 мин при комнатной температуре при встряхивании периодически добавляют 4 мл DMEM с 10% FBS, чтобы остановить реакцию. Фолликулярного эпителия трипсином и фильтруют через 40 мкм фильтр для получения одного-клеточной суспензии, содержащей клетки различного размера и формы.
- Спинпри 200 мкг в течение 5 мин, отбросить супернатант осторожно, повторно приостанавливать в 1 мл PBS, содержащим 2% сыворотки (FBS).
- Кроме того, сорвал волосяные фолликулы могут быть помещены в культуре без трипсина пищеварения расти волосы сферы на местах.
3. Выделение волосяной фолликул NCSCs помощью проточной цитометрии сортировки клеток
- Волосяной фолликул одной клеточной суспензии были получены путем расщепления трипсином и меченные антитела к CD271 (APC-сопряженными) / HNK1 (FITC-конъюгированных), или CD271 / alpha4 интегрина (PE-сопряженных) в течение 40 минут на льду в темноте.
- Центрифуга в течение 5 мин при 200 мкг при комнатной температуре и аспирации супернатант.
- Ресуспендируют клеток в PBS, содержащем 2% сыворотки (FBS), и перед сортировкой, PI прибавляется к воротам из мертвых клеток.
- Выполните сортировки клеток методом проточной цитометрии (FACS). Сбор CD271 +, HNK1 + двойной положительных клеток или CD271 +, alpha4 интегрина + двойной положительные клетки (рис. 2).
- После сортировкиING, CD271 +, HNK1 + двойной положительных клеток или CD271 +, alpha4 интегрина + двойной позитивные клетки культивировали в ультра-низким пластин вложения в NCSC среде
4. Культура первичной NCSCs
- Культура несогласие фолликулярных клеток или FACS отсортированных клеток в ультра-низких вложений пластин в NCSC среды, изменения средних каждый день.
- Проверьте культуре клеток каждый день под микроскопом. NCSCs начнет формировать плавающие малых агрегатов через несколько дней и хорошо сформированной сферы в 2-5 недели в культуре в зависимости от возраста доноров (рис. 3А). Результат появится через несколько дней в регионе выпуклость и хорошо сформированной сферы на месте в течение нескольких недель (рис. 3б), когда целые волосяные фолликулы культивируют в NCSC среды.
5. Расширение NCSCs
- Вымойте клетки с PBS раз.
- Добавить подогретого (до 37 ° C, критическое) accutase и инкубировать при 37 ° С в течение 5-10мин при встряхивании периодически, чтобы убедиться, что нейронные стволовые клетки сферах распадается на одну клетку (для крепления культурного NCSC, инкубировать клетки с accutase при 37 ° C в течение 5 минут, чтобы убедиться, что клетки волосяных фолликулов стволовых отделена).
- Вымойте и центрифуге клетках в два раза в течение 5 мин при 200 мкг при комнатной температуре в DMEM/F12 среде для удаления оставшихся решение accutase.
- Повторное приостановить клеток с NCSC культуральной среде.
- Для плавающего культуры, положить клеток в ультра-низким пластины крепления. Для крепления культуру, поставить в предварительно обработанные клетки пластины культуре ткани.
6. Представитель Результаты
NCSC культуральной среды является достаточным для поддержания hNCSCs в недифференцированное состояние без необходимости фидерных клеток. Кератиноциты не будет размножаться и постепенно умер в среду. Некоторые маленькие круглые клетки размножаются и образуют небольшие агрегатов в суспензии после 3 до 5 дней. Эти плавающие агрегаты медленно повышают яп размере, порожденный трехмерной сферы, как структуры, которую мы назвали волосы сферы (рис. 3А). Если культивировали в покрытых пластинами, NCSCs будет приложить к поверхности и не образуют сферы. Прилагаемый NCSCs расти быстрее, чем в суспензии. Сфере формирования и подключенными стволовых клеток выразить NCSCs маркеров. При всей фолликулы волос культуры, сферы формируются на области, соответствующей выпуклости области (рис. 3В).
Рисунок 1. Сорванные анаген (A) и телоген (B) волосяных фолликулов.
Рисунок 2. Представитель изображения FACS анализ NCSCs левой панели. Клетки закрытого использованием анти-CD271 и анти-Alphe 4 интегрина антителами. Справа: клетки закрытого использованием анти-CD271 и анти-антител HNK1.
Рисунок 3. Морфология волосы сферы (A) Морфология плавающей сферах волосы, левая панель. Низкой мощности, правая панель. Высокой мощности (B) Морфология волосы сферы на местах на Курской области, левой панели: волосы сфере на выпуклость телоген Правая панель: волосы сферы на Курской области волосяных фолликулов анагена.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Изолятор и культуру методами, описанными являются воспроизводимыми и надежной. Мы создали NCSCs из десятков лиц в широком возрастном диапазоне. Хотя лучше всего для обработки ткани сразу после сбора урожая ткани, мы обнаружили, что кожа головы тканей можно безопасно хранить в средствах массовой информации на льду в течение ночи транспорт с минимальным воздействием на жизнеспособность клеток.
Это важно для лечения кожи головы тканей с помощью антибиотиков и использовать асептики во время волосы изоляции фолликула, чтобы избежать возможного загрязнения микроорганизмами. Выброшенные кожи подтяжку лица или эмбриональной ткани головы дает сотни жизнеспособных фолликулов и, как правило достаточный ткани для FACS сортировки или дальнейших экспериментах только в течение нескольких дней. Биопсии тканей волосистой части головы обычно порождает ограниченное число клеток и требует дополнительного культуры ткани для получения достаточного клетки для дальнейших экспериментов.
Эмбриональные NCSCs приводит к множеству различныхтипы клеток в организме 11, кажется, что волосяной фолликул, полученных NCSCs также имеют широкий спектр дифференциации мощности. Волосы выпуклость ниши для различных типов стволовых клеток 3,12. Лайл и его коллеги показали, изоляция человека эпителиальных стволовых клеток из волос выпуклость и эти клетки являются несколько мощных вдоль линий эпителиальных 13. Меланоцит прекурсоров также проживают в волосах выпуклость 3. Таким образом, можно одновременно изолировать различные популяции стволовых клеток при культивировании волосяного фолликула клеток, полученных в средах с различными типами факторов роста. Волосяной фолликул, полученные стволовые клетки являются перспективным источником для клеточной восстановительной терапии.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Нам нечего раскрывать.
Acknowledgments
Эта работа выполнена при поддержке гранта NIH R01AR054593 и R01AR054593-S1 Сюй.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM | Invitrogen | 11965-092 | |
| DMEM/F12 | Invitrogen | 11330-32 | |
| Heat-inactivated FBS | Hyclone | SH30071.03 | |
| B27 supplement | Invitrogen | 17504044 | |
| N2 supplement | Invitrogen | 17502048 | |
| bFGF | Invitrogen | PHG0026 | |
| EGF | R&D system | 236-EG-01M | |
| IGF-I | R&D system | 291-G1-050 | |
| 0.05% Trypsin/EDTA | Invitrogen | 25300-054 | |
| Dispase | Invitrogen | 17105041 | |
| Penicillin-Streptomycin | Invitrogen | 15070063 | |
Table 1. |
|||
References
- Cotsarelis, G., Cheng, S. Z., Dong, G., Sun, T. T., Lavker, R. M. Existence of slow-cycling limbal epithelial basal cells that can be preferentially stimulated to proliferate: implications on epithelial stem cells. Cell. 57, 201-209 (1989).
- Cotsarelis, G., Sun, T. T., Lavker, R. M. Label-retaining cells reside in the bulge area of pilosebaceous unit: implications for follicular stem cells, hair cycle, and skin carcinogenesis. Cell. 61, 1329-1337 (1990).
- Tanimura, S., et al. Hair follicle stem cells provide a functional niche for melanocyte stem cells. Cell Stem Cell. 8, 177-187 (2011).
- Yu, H., et al. Isolation of a novel population of multipotent adult stem cells from human hair follicles. Am. J. Pathol. 168, 1879-1888 (2006).
- Yu, H., Kumar, S. M., Kossenkov, A. V., Showe, L., Xu, X. Stem cells with neural crest characteristics derived from the bulge region of cultured human hair follicles. J. Invest. Dermatol. 130, 1227-1236 (2010).
- Wong, C. E., et al. Neural crest-derived cells with stem cell features can be traced back to multiple lineages in the adult skin. J. Cell Biol. 175, 1005-1015 (2006).
- Sieber-Blum, M., Grim, M., Hu, Y. F., Szeder, V. Pluripotent neural crest stem cells in the adult hair follicle. Dev. Dyn. 231, 258-269 (2004).
- Amoh, Y., et al. Implanted hair follicle stem cells form Schwann cells that support repair of severed peripheral nerves. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 102, 17734-17738 (2005).
- Koliatsos, V. E., Xu, L., Yan, J. Human stem cell grafts as therapies for motor neuron disease. Expert Opin. Biol. Ther. 8, 137-141 (2008).
- McKenzie, I. A., Biernaskie, J., Toma, J. G., Midha, R., Miller, F. D. Skin-derived precursors generate myelinating Schwann cells for the injured and dysmyelinated nervous system. J. Neurosci. 26, 6651-6660 (2006).
- LeDouarin, N. M., Kalcheim, C. The Neural Crest. , Cambridge University Press. Cambridge. (1999).
- Tumbar, T., et al. Defining the epithelial stem cell niche in skin. Science. 303, 359-363 (2004).
- Roh, C., et al. Multi-potentiality of a new immortalized epithelial stem cell line derived from human hair follicles. In Vitro Cell Dev. Biol. Anim. 44, 236-244 (2008).
