Summary
Dieser Artikel stellt eine robuste Protokoll zur Isolierung und Kultivierung der Neuralleiste Stammzellen aus menschlichen Haarfollikeln.
Abstract
Haarfollikel unterliegen lebenslanges Wachstum und Haar-Zyklus ist ein gut kontrollierter Prozess, der Stammzell-Proliferation und Ruhe. Haar Ausbuchtung ist ein gut charakterisiertes Nische für adulte Stammzellen ein. Dieses Segment der äußeren Wurzelscheide enthält eine Anzahl verschiedener Typen von Stammzellen, einschließlich epithelialer Stammzellen 2, Melanocyt Stammzellen 3 und Neuralleiste wie Stammzellen 4-7. Haarfollikel sind eine zugängliche und reiche Quelle für verschiedene Arten von menschlichen Stammzellen. Wir und andere haben Neuralleiste Stammzellen (Neuralleistenstammzellen) aus humanen fötalen und adulten Haarfollikel 4,5 isoliert. Diese menschlichen Stammzellen sind Etikett haltenden Zellen und sind in der Lage, durch Selbsterneuerung asymmetrischen Zellteilung in vitro. Sie äußern unreifen Neuralleistenzellen Marker aber nicht Differenzierungsmarker. Unsere expression profiling Studie zeigte, dass sie eine ähnliche Genexpressionsmuster Aktien mit murinen Haut unreife neurale crest Zellen. Sie weisen klonale Multipotenz, die Anlass zu myogenen, melanozytären und neuronale Zelllinien geben kann nach in vitro klonale einzigen Zellkultur. Differenzierte Zellen nicht nur zu erwerben Linie-spezifische Marker, sondern auch zeigen, entsprechende Funktionen in ex vivo-Bedingungen. Darüber hinaus zeigen diese Neuralleistenstammzellen Differenzierungspotenzial Richtung mesenchymale Linien. Differenzierten neuronalen Zellen in Gehirn der Maus bestehen bleiben und zu halten neuronalen Differenzierung Marker. Es hat sich gezeigt, dass follikelstimulierendem Haar abgeleitet Neuralleistenstammzellen können Nerv Nachwachsen helfen, und sie verbessern Motorik bei Mäusen mit dieser Stammzellen transplantiert nach Durchschneiden Rückenmarksverletzung 8. Darüber hinaus haben peripheren Nerven mit Stammzell-Transplantate 9, und der Implantation von Haut-derived Vorläuferzellen neben zerkleinert Ischiasnerven repariert wurde in Remyelinisierung 10 geführt. Deshalb haben die Haarfollikel / Haut abgeleitet Neuralleistenstammzellen bereits viel versprechende Ergebnisse für r angezeigtegenerative Therapie in präklinischen Modellen.
Somatische Zellen Reprogrammierung zu induzierten pluripotenten Stammzellen (iPS-Zellen) hat ein enormes Potential für die regenerative Medizin dargestellt. Allerdings gibt es noch viele Probleme mit iPS-Zellen, insbesondere die langfristigen Auswirkungen von Onkogen / Virus Integration und potenzielle tumorigenicity von pluripotenten Stammzellen wurden nicht angemessen behandelt. Es gibt noch viele Hürden zu überwinden, bevor iPS-Zellen für die regenerative Medizin verwendet werden können. Während die adulten Stammzellen sind bekannt als sicher und sie wurden klinisch seit vielen Jahren, z. B. Knochenmarkstransplantation verwendet. Viele Patienten haben bereits von der Behandlung profitiert. Autologen adulten Stammzellen sind noch bevorzugte Zellen für die Transplantation. Daher sind die leicht zugänglich und erweiterbar adulten Stammzellen in der menschlichen Haut / Haarfollikel eine wertvolle Quelle für die regenerative Medizin.
Protocol
Ein. Vorbereitung der Zellkulturplatten
- Mantel jeder Vertiefung mit genügend Poly-D-Lysin (PDL), um den Boden der Vertiefung abzudecken. Lassen Sie die Platten in der Haube trocknen.
- Nachdem die Brunnen trocken sind, mit sterilem Wasser spülen und absaugen. Lassen Sie die Platten in der Haube trocknen.
- Nach dem Trocknen Rock mit Fibronectin (BioWhittaker, die in Wasser über Nacht bei 37 ° C bei einer Konzentration von 1 mg in 6 ml) gelöst.
- Fügen NCSC Medium [95 ml DMEM/F12, 1 ml Penn / Strep (P / S), 1 ml N2, 2 ml B27, 100 ul Mercaptoethanol (2ME; 50 mM Lager) IGF, bFGF (20 ng / ml Medium), -1 (20 ng / ml Medium) und EGF (20 ng / ml Medium)] vor Fibronectin trocken in den Platten,
2. Auszug Haarfollikel-Zellen aus menschlichen Kopfhaut
- Vor dem Start des Verfahrens zur Isolierung von Neuralleistenstammzellen, muss man die entsprechenden Medien und Reagenzien herzustellen (siehe Tabelle 1).
- Frische erwachsenen Menschen Kopfhaut ab Facelift Verfahren oder fetal Kopfhautgewebe wird gesammelt, gewaschen mit PBS, das Penicillin-Streptomycin.
- Die Haut wird dann in 50 ml-Röhrchen überführt und in DMEM mit Dispase (10 mg / ml) über Nacht bei 4 ° C. Inkubation für 2-4 Stunden bei 37 ° C ist ebenfalls wirksam. Hautstücke sollte eine maximale Breite von 1 cm bis zu durchdringen für Enzym zu ermöglichen.
- Übertragen Sie die Haut in eine sterilisierte Petrischale abziehen jedes Haar von der Haut durch Greifen der Haarschaft nahe der Hautoberfläche und Ziehen fest und glatt. Die Haarfollikel zeigen Morphologie der beiden Anagen (Abbildung 1A) oder Telogen (Abbildung 1B).
- Inkubieren der isolierten Fragmente Follikels in 0,05% Trypsin-EDTA (Invitrogen) für 15-20 min bei Raumtemperatur unter Schütteln periodisch, 4 ml DMEM mit 10% FBS, um eine Reaktion zu stoppen. Die Follikelepithels wird trypsiniert und filtriert über 40 um Filter, um eine Einzelzellen-Suspension, die Zellen von unterschiedlicher Größe und Form zu erhalten.
- Drehenbei 200 xg für 5 min, verwerfen Überstand vorsichtig in 1 ml PBS, enthaltend 2% Kälberserum (FBS) erneut zu suspendieren.
- Alternativ können gezupft Haarfollikel in Kultur ohne Trypsinverdau platziert werden, um Haare Kugeln in situ wachsen.
3. Isolation der Haarfollikel Neuralleistenstammzellen Mit Durchflusszytometrische Cell Sorting
- Haarfollikel Einzelzell-Suspension wurden durch Trypsinverdau erhaltene und mit dem Antikörper gegen CD271 (APC-konjugiertem) / HNK1 (FITC-konjugierten) oder CD271 / alpha4-Integrin (PE-konjugierten) für 40 min auf Eis im Dunkeln.
- Zentrifuge für 5 min bei 200 xg bei Raumtemperatur und saugen Sie den Überstand.
- Die Zellen in PBS mit 2% Serum (FBS), und vor der Sortierung wird PI Tor aus den toten Zellen aufgenommen.
- Führen Zellsortierung mittels Durchflusszytometrie (FACS). Sammle CD271 +, HNK1 + doppelt positiven Zellen oder CD271 +, alpha4 Integrin + doppelt positiven Zellen (Abbildung 2).
- Nach Arttion, CD271 +, HNK1 + doppelt positiven Zellen oder CD271 +, alpha4 Integrin + doppelt positiven Zellen werden in ultra-low Befestigungsplatten im NCSC kultiviert
4. Culture of Primary Neuralleistenstammzellen
- Kultur die abgetrennten Follikelzellen oder FACS sortierten Zellen in ultra-low Befestigungsplatten im NCSC Medium verändern Medium jeden Tag.
- Überprüfen Zellkultur jeden Tag unter dem Mikroskop. Neuralleistenstammzellen beginnt schwimmende kleine Aggregate nach mehreren Tagen und wohlgeformte Kugeln in 2-5 Wochen in der Kultur abhängig vom Alter der Spender (3A) zu bilden. Outgrowth wird in wenigen Tagen bei der Ausbuchtung Region und wohlgeformten Kugeln in situ in einigen Wochen (3B), wenn ganze Haarfollikel in der NCSC Medium kultiviert erscheinen.
5. Ausbau der Neuralleistenstammzellen
- Waschen der Zellen einmal mit PBS.
- Fügen vorgewärmten (37 ° C, kritisch) Accutase und bei 37 ° C für 5-10min unter Schütteln periodisch sicherstellen Neuronale Stammzellen Kugeln dissoziiert in einzelne Zelle (zur Befestigung kultivierten NCSC, inkubieren Zellen mit Accutase bei 37 ° C für 5 min, um sicherzustellen Haarfollikelstammzellen abgenommen).
- Waschen und zentrifugieren Zellen zweimal für 5 min bei 200 × g bei Raumtemperatur in DMEM/F12 Medium, um jeglichen verbliebenen Accutase Lösung zu entfernen.
- Resuspendieren Zellen mit NCSC Kulturmedium.
- Für schwimmende Kultur, setzen die Zellen in ultra-low Befestigungsplatten. Zur Befestigung Kultur, setzen die Zellen in vorbehandelten Zellkulturplatten.
6. Repräsentative Ergebnisse
NCSC Kulturmedium genügt hNCSCs in einem undifferenzierten Zustand ohne Feeder-Zellen aufrechtzuerhalten. Keratinozyten nicht vermehren und allmählich starb im Medium. Bestimmte kleine runde Zellen vermehren sich und bilden kleine Aggregate in Suspension nach 3 bis 5 Tagen. Diese schwimmenden Aggregaten langsam erhöht in Größe erzeugten dreidimensionalen Sphäre Strukturen, die wir als Haar Kugeln (3A). Wenn in beschichteten Platten kultiviert werden die Neuralleistenstammzellen an die Oberfläche binden und bildet keine Kugeln. Die beigefügten Neuralleistenstammzellen schneller wachsen als in der Schwebe. Die Kugel-bildenden oder angebrachten Stammzellen exprimieren Neuralleistenstammzellen Marker. Wenn ganze Haarfollikel Kulturen sind, werden Kugeln an der Fläche entsprechend der Ausbuchtung Bereich (3B) ausgebildet ist.
Abbildung 1. Gerupft Anagen (A) und Telogen (B) Haarfollikel.
Abbildung 2. Repräsentative Bilder FACS-Analyse von Neuralleistenstammzellen Linkes Feld:. Zellen sind gated mit anti-CD271-und Anti-Alphe 4-Integrin-Antikörper. Rechts: Zellen sind gated mit anti-CD271-und Anti-HNK1 Antikörper.
Abbildung 3. Morphologie der Haare Kugeln (A) Morphologie von schwimmenden Haar Kugeln, linke Tafel:. Low-Power-, rechte Tafel:. Hoher Leistung (B) Morphologie der Haare Kugel in situ bei der Ausbuchtung Region, linke Tafel: ein Haar Kugel an Telogen Ausbuchtung rechte Tafel: ein Haar Kugel an der Ausbuchtung Region eines Anagen Haarfollikel.
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Discussion
Die Zell-Isolierung und Kultur beschriebenen Methoden sind reproduzierbar und robust. Wir haben Neuralleistenstammzellen aus Dutzenden von Einzelpersonen in einer breiten Altersspanne generiert. Obwohl es am besten ist, um das Gewebe direkt nach Gewebe Ernte verarbeiten, fanden wir, dass der Kopfhaut Gewebe sicher in den Medien auf Eis über Nacht den Transport werden mit minimalen Auswirkungen auf die Lebensfähigkeit der Zellen gespeichert.
Es ist wichtig, die Kopfhautgewebe mit Antibiotika zu behandeln und aseptische Technik bei Haarfollikel Isolierung um potentielle Kontamination durch Mikroorganismen zu verhindern. Ausrangierte Facelift Haut oder fetalen Kopfhaut Gewebe ergibt Hunderte von lebensfähigen Follikel und erzeugen in der Regel ausreichend Gewebe für FACS-Sortierung oder weitere Experimente in nur wenigen Tagen. Stanzbiopsie der Kopfhautgewebe Regel erzeugt begrenzte Anzahl von Zellen und erfordert zusätzliche Kultur Gewebe ausreichend Zellen für weitere Experimente erzeugen.
Embryonale Neuralleistenstammzellen Anlass zu einer Vielzahl von unterschiedlichenZelltypen im Körper 11, scheint es, dass die Haare abgeleitet Neuralleistenstammzellen Follikel haben auch ein breites Spektrum der Differenzierung Kapazität. Haar Ausbuchtung ist die Nische für verschiedene Arten von Stammzellen 3,12. Lyle und Kollegen haben Isolierung von humanen epithelialen Stammzellen aus Haaren Ausbauchung gezeigt und diese Zellen sind mehrere potente entlang den Linien 13 Epithelzellen. Melanocyte Vorläufer auch in den Haaren Auswölbung 3 befinden. Es ist daher möglich, gleichzeitig isolieren verschiedenen Populationen von Stammzellen durch Kultivieren Haarfollikel-abgeleiteter Zellen in Medien mit unterschiedlichen Typ von Wachstumsfaktoren. Haarfollikel Stammzellen sind eine vielversprechende Quelle für Zellen regenerative Therapien.
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Disclosures
Wir haben nichts zu offenbaren.
Acknowledgments
Diese Arbeit wird durch NIH R01AR054593 und R01AR054593-S1 Xu unterstützt.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM | Invitrogen | 11965-092 | |
| DMEM/F12 | Invitrogen | 11330-32 | |
| Heat-inactivated FBS | Hyclone | SH30071.03 | |
| B27 supplement | Invitrogen | 17504044 | |
| N2 supplement | Invitrogen | 17502048 | |
| bFGF | Invitrogen | PHG0026 | |
| EGF | R&D system | 236-EG-01M | |
| IGF-I | R&D system | 291-G1-050 | |
| 0.05% Trypsin/EDTA | Invitrogen | 25300-054 | |
| Dispase | Invitrogen | 17105041 | |
| Penicillin-Streptomycin | Invitrogen | 15070063 | |
Table 1. |
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References
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