Summary
Bu makale, insan saç köklerinin gelen nöral krest kök hücrelerin izolasyonu ve kültür için sağlam bir protokol sunar.
Abstract
Saç köklerinin yaşam boyu büyümeye geçmesi ve saç döngüsü kök hücre çoğalması ve sükunet içeren iyi-kontrollü bir süreç olduğunu. Saç şişkinliği yetişkin kök hücreleri 1 için iyi karakterize niş. Dış kök kılıfı bu segment epitel kök hücreler 2, melanosit kök hücre 3 ve 4-7 kök hücreleri gibi nöral krest dahil kök hücreler, farklı türde bir dizi içerir. Saç köklerinin insan kök hücreleri farklı türleri için erişilebilir ve zengin bir kaynak oluşturmaktadır. Biz ve diğerleri 4,5 insan fetal ve yetişkin saç köklerinin gelen nöral krest kök hücreler (NCSCs) izole ettim. Bunlar insan kök hücreleri etiket tutucu hücreleri ve in vitro asimetrik hücre bölünmesi yoluyla kendini yenileme yeteneğine sahiptir. Onlar immatür nöral krest hücre belirteçleri değil farklılaşma işaretleri ifade eder. Bizim ekspresyon profili çalışma, fare derisi immatür nöral CRE ile benzer bir gen ekspresyon paterni paylaşmaktadır gösterdiST hücreleri. Onlar vitro klonal tek hücre kültürü sonrası, miyojenik melanositik ve nöronal hücre soylarının ortaya çıkmasına neden olabilir klonal multipotency sergilerler. Farklılaştırılmış hücreler sadece soy-spesifik belirteçler elde değil, aynı zamanda ex vivo koşullarda uygun işlevleri göstermek değildir. Buna ek olarak, bu NCSCs mezenkimal soy doğru farklılaşma potansiyeli gösteriyor. Farklılaştırılmış nöronal hücrelerin fare beyin inat ve nöronal farklılaşma işaretleri koruyabilirsiniz. Bu saç NCSCs sinir büyütme yardımcı olabilir türetilmiş folikülü ve onlar transecting omurilik yaralanması 8 takiben bu kök hücreler nakledildi farelerde motor fonksiyon geliştirmek olduğu gösterilmiştir. Ayrıca, periferik sinirlerin kök hücre greftleri 9 ve ezilmiş siyatik sinirleri bitişik cilt türetilmiş prekürsör hücrelerin implantasyonu ile tamir edilmiştir remiyelinizasyon 10 sonuçlandı. Bu nedenle, saç folikülü / cilt elde NCSCs zaten r için umut verici sonuçlar göstermiştirpreklinik modellerde egenerative tedavisi.
Indüklenmiş pluripotent kök (iPS) hücreleri yeniden programlayarak Somatik Hücre rejeneratif tıp için muazzam potansiyel göstermiştir. Bununla birlikte, özellikle iPS hücreleri, onkogen / virüs entegrasyon ve pluripotent kök hücrelerin potansiyel tümör gelişimini ve uzun dönemli etkisi ile hala birçok sorunları yeterince ele alınmamıştır vardır. IPS hücreleri rejeneratif ilaç için kullanılmadan önce üstesinden gelinmesi gereken çok engel hala vardır. Yetişkin kök hücreleri güvenli olduğu bilinen ve bu gibi kemik iliği nakli gibi pek çok yıl için klinik olarak kullanılmaktadır ise. Birçok hasta zaten tedavi yararlanmıştır. Otolog yetişkin kök hücreler hâlâ nakli için tercih edilen hücrelerdir. Bu nedenle, insan deri / saç köklerinin kolayca erişilebilir ve genişletilebilir erişkin kök hücrelerin rejeneratif tıp için değerli bir kaynaktır.
Protocol
1. Doku Kültürü Plakalarının Hazırlanması
- Coat Her iyi Poly-D-Lizin (PDL) kuyunun dibine karşılamak için yeterli. Plakalar kaputu kurumasını bekleyin.
- Kuyu kuruduktan sonra, steril su ile durulayın ve aspire. Plakalar kaputu kurumasını bekleyin.
- Ne zaman fibronektin ile kuru kat (6 ml içinde 1 mg 'lik bir konsantrasyonda 37 ° C de bir gece Biowhittaker su içinde çözülür ki).
- ŞÇUK orta ekleyin [95 ml DMEM/F12, 1 ml Penn / Strep (P / S), 1 ml N2, 2 ml B27, 100 ul merkaptoetanol (2ME, 50 mM stok), bFGF (20 ng / ml orta), IGF -1 (20 ng / orta ml) ve EGF (20 ng / ml orta)] plakaları içinde kuru önce fibronektin,
2. İnsan Derisi şehirlerinde Saç Folikül Hücreleri Özü
- Tecrit NCSCs arasında işlemine başlamadan önce, bir (bkz. Tablo 1) ilgili medias ve reaktifler hazırlamak gerekiyor.
- Facelift prosedürleri veya fe Taze yetişkin insan saçlı derital kafa derisi doku PBS penisilin-streptomisin içeren suyla yıkandı, toplanır.
- Deri daha sonra 50 ml tüp içine aktarılır ve 4 ° C de bir gece dispase (10 mg / ml) DMEM içinde inkübe edilir 37, 2-4 saat boyunca inkübasyon ° C 'de etkilidir. Deri parçaları nüfuz enzim sağlamak için en az 1 cm en fazla genişlikte olmalıdır.
- Steril bir Petri kabı içine deri aktarın; cilt yüzeyine yakın saç şaft tutup sıkıca ve düzgün çekerek cilt her saç çekin. Saç köklerinin anajen (Şekil 1A) veya telojen (Şekil 1B) ya morfolojisi göstermektedir.
- Periyodik sallama ile oda sıcaklığında 15-20 dakika için% 0.05 tripsin-EDTA (Invitrogen) içinde izole folikül parçaları inkübe, reaksiyonu durdurmak için% 10 FBS ile 4 ml DMEM ilave edin. Epitel tripsinize ve değişik boyut ve şekil hücreleri içeren tek bir hücre süspansiyonu elde etmek için 40 um filtre ile filtre edilir.
- Dönüş5 dakika boyunca 200 x g, 1 ml PBS% 2 serumu (FBS) ihtiva eden yeniden askıya, dikkatlice süpernatan atılır.
- Alternatif olarak, alınmış saç köklerinin in situ olarak saç büyümesini küreler tripsin sindirim olmaksızın kültür içinde yerleştirilebilir.
3. Akış Sitometrik Hücre Ayırma kullanılması Saç Folikül NCSCs İzolasyonu
- Saç folikülü tek bir hücre süspansiyonu tripsin ile sindirim ile elde edilen ve CD271 (APC-konjuge) / HNK1 (FITC-konjuge) ya da CD271 / alpha4 karanlıkta buz üzerinde 40 dakika süreyle integrin (PE ile konjuge) karşı antikorlar ile işaretlenmiştir.
- Oda sıcaklığında, 200 x g'de 5 dakika boyunca santrifüjden sonra süpernatan aspire.
- PBS,% 2 serum (FBS) içeren içinde süspanse hücreleri, ve sıralama önce, PI ölü hücreleri kapı eklenir.
- Flow sitometri (FACS) tarafından hücre sıralama yapın. CD271 toplayın +, HNK1 + çift pozitif hücreleri veya CD271 +, alpha4 integrin + çift pozitif hücreler (Şekil 2).
- Sonra sıralamaing, CD271 +, HNK1 + çift pozitif hücreleri veya CD271 +, alpha4 integrin + çift pozitif hücreler ŞÇUK ortamda ultra-düşük eki plakalar kültüre
4. İlköğretim NCSCs Kültürü
- Kültür ilişkisiz foliküler hücreleri veya FACS ŞÇUK ortamda ultra-düşük eki plakaları hücreleri kriteri, her gün orta değiştirin.
- Mikroskop altında her gün hücre kültüründe kontrol edin. NCSCs birkaç gün ve bağışçılar (Şekil 3A) yaşına bağlı olarak kültürde 2-5 hafta içinde iyi biçimli küreler sonra yüzen küçük agregatlar oluşturması için başlayacaktır. Outgrowth çıkıntı bölge ve birkaç hafta içinde in situ olarak iyi biçimlenmiş küreler (Şekil 3B) tüm saç köklerinin ŞÇUK ortamda kültüre de birkaç gün içinde görünecektir.
5. NCSCs genişletilmesi
- Bir kez PBS ile hücreleri yıkayın.
- Önceden ısıtılmış ekle (37 ° C, kritik) 37 accutase ve inkübe ° C 5-10 içintek bir hücreye emin Nöral kök hücre küre disosiye yapmak için periyodik sallayarak dk (ek kültürlü ŞÇUK, 37 accutase ile inkübe hücreleri için emin kıl folikülü kök hücreleri müstakil olmak için 5 dakika ° C).
- Kalan çözelti accutase kaldırmak için DMEM/F12 ortamı içinde oda sıcaklığında 200 x g'de 5 dakika boyunca iki kez yıkanır ve hücrelerin santrifüj.
- ŞÇUK besiyeri ile hücreleri yeniden askıya.
- Kayan kültürü için, ultra-düşük eki plakaları hücrelerin koydu. Eki kültürü için, ön işlem doku kültürü kabına hücreleri koydu.
6. Temsilcisi Sonuçlar
ŞÇUK kültür ortamı besleyici hücreleri için gerek kalmadan bir farklılaşmamış bir durumda hNCSCs korumak için yeterlidir. Keratinositlerin prolifere ve yavaş yavaş orta ölmüş olmaz. Bazı küçük yuvarlak hücreler çoğalmaya başlar ve 3 ila 5 gün sonra süspansiyon küçük agrega oluşturacaktır. Bu yüzen agregalar yavaş i arttıBiz saç küreler (Şekil 3A) olarak adlandırılan n boyutu, oluşturulan üç-boyutlu küre benzeri yapılar. Kaplanmış plakalar içinde kültüre ise, NCSCs yüzeye yapışır ve herhangi küreleri oluşturmayacaktır. Ekli NCSCs süspansiyon daha hızlı büyür. Küre-şekillendirme ya da bağlı kök hücreler NCSCs işaretleri ifade eder. Tüm saç köklerinin kültürleri olduğunda, küreler çıkıntı bölgesi (Şekil 3B) karşılık gelen bölge de oluşturulur.
Şekil 1. Anajen (A) ve telojen (B), saç folikülleri çekti.
Şekil 2. NCSCs FACS analizi Örnek görüntüleri Sol panel:. Hücreleri, anti-CD271 ve anti-alphe 4 integrin antikorları ile kapı vardır. Sağ panel: hücrelerinin, anti-CD271 ve anti-HNK1 antikorlar kullanılarak kapı vardır.
Şekil 3,. Saç küreleri Morfoloji dalgalı saç küreleri, sol panel (A) Morfoloji:. Düşük güç, sağ panelde:. Yüksek güç (B) şişkinliği bölgede, sol paneldeki in situ olarak saç kürenin Morfoloji: telojen çıkıntı bir saç küre, Sağ panel: bir anagen kıl folikülünün şişkinliği bölgede bir saç küre.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Anlatılan hücre izolasyonu ve kültürü yöntemleri tekrarlanabilir ve sağlamdır. Biz geniş bir yaş aralığında bireylerin onlarca NCSCs yarattı. Doğru doku hasat sonrası doku işlemek için iyi olmasına rağmen, biz kafa derisi dokularıyla güvenle hücre canlılığı üzerine minimal etkisi ile gecede ulaşım için buz üzerinde medya saklanabilir bulundu.
Bu antibiyotik ile kafa derisi doku tedavisi ve potansiyel mikroorganizma kontaminasyonu önlemek için saç folikülü izolasyon sırasında aseptik teknik kullanılması önemlidir. Genellikle Atılan facelift deri veya canlı folikül fetal kafa derisi doku verimleri yüzlerce ve sadece birkaç gün içinde FACS Ayıklama veya başka deneyler için yeterli doku oluşturur. Kafa derisi doku Punch biyopsi genellikle hücrelerin sınırlı sayıda üretir ve daha fazla deneyler için yeterli hücre üretmek için ek kültür dokusu gerektirir.
Embriyonik NCSCs farklı bir çok yol açanGövdenin 11 içinde hücre tipleri, saç farklılaşma kapasitesi geniş bir spektruma sahiptir de elde edilen NCSCs folikülü anlaşılmaktadır. Saç çıkıntı kök hücrelerin 3,12 farklı türü için niş. Lyle ve arkadaşları saç şişkinliği insan epitel kök hücrelerin izolasyonu göstermiştir ve bu hücrelerin epitel soylar 13 sıra birden güçlüdürler. Melanosit öncüleri de saç çıkıntı 3 içinde bulunur. Aynı anda büyüme faktörleri farklı tip ortamlarda kültüre saç folikülü kökenli hücreler kök hücrelerin farklı popülasyonlar ayırmak mümkündür. Saç folikülü edilen kök hücreler, hücre yenileyici terapiler için umut verici bir kaynaktır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Biz ifşa etmek başka bir şey var.
Acknowledgments
Bu çalışma NIH hibe R01AR054593 ve Xu R01AR054593-S1 tarafından desteklenmektedir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM | Invitrogen | 11965-092 | |
| DMEM/F12 | Invitrogen | 11330-32 | |
| Heat-inactivated FBS | Hyclone | SH30071.03 | |
| B27 supplement | Invitrogen | 17504044 | |
| N2 supplement | Invitrogen | 17502048 | |
| bFGF | Invitrogen | PHG0026 | |
| EGF | R&D system | 236-EG-01M | |
| IGF-I | R&D system | 291-G1-050 | |
| 0.05% Trypsin/EDTA | Invitrogen | 25300-054 | |
| Dispase | Invitrogen | 17105041 | |
| Penicillin-Streptomycin | Invitrogen | 15070063 | |
Table 1. |
|||
References
- Cotsarelis, G., Cheng, S. Z., Dong, G., Sun, T. T., Lavker, R. M. Existence of slow-cycling limbal epithelial basal cells that can be preferentially stimulated to proliferate: implications on epithelial stem cells. Cell. 57, 201-209 (1989).
- Cotsarelis, G., Sun, T. T., Lavker, R. M. Label-retaining cells reside in the bulge area of pilosebaceous unit: implications for follicular stem cells, hair cycle, and skin carcinogenesis. Cell. 61, 1329-1337 (1990).
- Tanimura, S., et al. Hair follicle stem cells provide a functional niche for melanocyte stem cells. Cell Stem Cell. 8, 177-187 (2011).
- Yu, H., et al. Isolation of a novel population of multipotent adult stem cells from human hair follicles. Am. J. Pathol. 168, 1879-1888 (2006).
- Yu, H., Kumar, S. M., Kossenkov, A. V., Showe, L., Xu, X. Stem cells with neural crest characteristics derived from the bulge region of cultured human hair follicles. J. Invest. Dermatol. 130, 1227-1236 (2010).
- Wong, C. E., et al. Neural crest-derived cells with stem cell features can be traced back to multiple lineages in the adult skin. J. Cell Biol. 175, 1005-1015 (2006).
- Sieber-Blum, M., Grim, M., Hu, Y. F., Szeder, V. Pluripotent neural crest stem cells in the adult hair follicle. Dev. Dyn. 231, 258-269 (2004).
- Amoh, Y., et al. Implanted hair follicle stem cells form Schwann cells that support repair of severed peripheral nerves. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 102, 17734-17738 (2005).
- Koliatsos, V. E., Xu, L., Yan, J. Human stem cell grafts as therapies for motor neuron disease. Expert Opin. Biol. Ther. 8, 137-141 (2008).
- McKenzie, I. A., Biernaskie, J., Toma, J. G., Midha, R., Miller, F. D. Skin-derived precursors generate myelinating Schwann cells for the injured and dysmyelinated nervous system. J. Neurosci. 26, 6651-6660 (2006).
- LeDouarin, N. M., Kalcheim, C. The Neural Crest. , Cambridge University Press. Cambridge. (1999).
- Tumbar, T., et al. Defining the epithelial stem cell niche in skin. Science. 303, 359-363 (2004).
- Roh, C., et al. Multi-potentiality of a new immortalized epithelial stem cell line derived from human hair follicles. In Vitro Cell Dev. Biol. Anim. 44, 236-244 (2008).
