Summary
I denna artikel presenteras en robust protokoll för isolering och odling av neurala celler crest stamceller från mänskliga hårsäckar.
Abstract
Hårsäckar genomgår livslång tillväxt och hår cykel är en väl kontrollerad process med spridning stamceller och stillhet. Hår bula är en väl karakteriserad nisch för adulta stamceller 1. Detta segment av den yttre rotskidan innehåller ett antal olika typer av stamceller, inklusive epitelstamceller 2, melanocytstimulerande stamceller 3 och neurallisten som stamceller 4-7. Hårsäckar representerar en tillgänglig och rik källa för olika typer av mänskliga stamceller. Vi och andra har isolerat neurala celler crest stamceller (NCSCs) från humana foster och vuxna hårsäckar 4,5. Dessa mänskliga stamceller är etikett-hållande celler och kan självförnyelse genom asymmetrisk celldelning in vitro. De uttrycker omogna neurala markörer crest celler men inte differentieringsmarkörer. Vår expression profiling visade att de delar ett liknande mönster genuttryck med murin hud omogna neurala skapast celler. De uppvisar klonal multipotens som kan ge upphov till myogena, melanocytisk och neuronala cellinjer efter in vitro klonal enda cellodling. Differentierade celler inte bara skaffa härstamning specifika markörer utan också visa lämpliga funktioner i ex vivo förhållanden. Dessutom är dessa NCSCs visar differentiering potential mot mesenkymala linjerna. Differentierade neuronala celler kan kvarstå i mushjärna och behålla neuronala differentieringsmarkörer. Det har visats att hårsäcken härledda NCSCs kan hjälpa nerv återväxt, och de förbättrar motorns funktion i möss transplanterade med dessa stamceller efter transecting ryggmärgsskada 8. Dessutom har perifera nerver reparerats med transplantat stamceller 9, och implantation av hud-härledda prekursorceller intill krossade ischiasnerver har resulterat i remyelinisering 10. Därför har hårsäcken / skinn som härrör NCSCs redan visat lovande resultat för regenerative terapi i prekliniska modeller.
Somatisk omprogrammering till inducerade (IPS) pluripotenta stamceller har visat enorm potential för regenerativ medicin. Men det finns fortfarande många frågor med iPS-celler, särskilt på lång sikt effekten av onkogen / virus integration och potentiella tumorigenicitet av pluripotenta stamceller har inte tillräckligt uppmärksammar. Det finns fortfarande många hinder att övervinna innan iPS-celler kan användas för regenerativ medicin. De adulta stamceller är kända för att vara säkra och de har använts kliniskt under många år, såsom benmärgstransplantation. Många patienter har redan dragit nytta av behandlingen. Autologa adulta stamceller fortfarande föredragna celler för transplantation. Därför lättillgänglig och expanderbar adulta stamceller i humana hud / hår folliklar är en värdefull källa för regenerativ medicin.
Protocol
1. Beredning av vävnadsodlingsplattor
- Belägga varje brunn med tillräckligt Poly-D-Lysin (PDL) för att täcka brunnens botten. Låt plattorna torka i huven.
- Efter att brunnarna är torra, skölj med sterilt vatten, och aspirera. Låt plattorna torka i huven.
- När torr, päls med fibronektin (som löstes i BioWhittaker vatten över natten vid 37 ° C vid en koncentration av 1 mg i 6 ml).
- Lägg NCSC medium [95 ml DMEM/F12, 1 ml Penn / Strep (P / S), 1 ml N2, 2 ml B27, 100 ^ merkaptoetanol (2ME, 50 mM lager), bFGF (20 ng / ml medium), IGF -1 (20 ng / ml medium) och EGF (20 ng / ml medium)] före fibronektin torr i plattorna,
2. Utdrag celler hårsäcken från människans hårbotten
- Före start av förfarandet enligt isolera NCSCs, måste man framställa de respektive media och reagens (se tabell 1).
- Färsk vuxen människa hårbotten hud från ansiktslyftning förfaranden eller fetal hårbotten vävnad uppsamlas, tvättas med PBS innehållande penicillin-streptomycin.
- Huden överförs sedan till 50 ml rör och inkuberades i DMEM med Dispase (10 mg / ml) över natten vid 4 ° C. Inkubation under 2-4 h vid 37 ° C är också effektiv. Skinnbitar bör vara en maximal bredd av 1 cm för att möjliggöra enzym att penetrera.
- Överför huden i en steriliserad Petriskål; dra bort varje hår från huden genom att gripa hårstrået nära hudytan och dra fast och smidigt. Hårsäckarna visar morfologi av antingen anagen (figur 1A) eller telogen (Figur 1B).
- Inkubera de isolerade fragmenten follikeln i 0,05% trypsin-EDTA (Invitrogen) i 15-20 min vid rumstemperatur med skakning periodiskt, tillsätt 4 ml DMEM med 10% FBS för att stoppa reaktionen. Den follikulära epitel trypsineras och filtreras genom 40 pm filter för att erhålla en enda cellsuspension innehållande celler av varierande storlek och form.
- Spinvid 200 xg under 5 minuter, kassera supernatanten noggrant, återsuspendera i 1 ml PBS innehållande 2% serum (FBS).
- Alternativt kan plockade hårsäckarna placeras i kultur utan trypsinspjälkning att växa hår sfärer på plats.
3. Isolering av NCSCs hårsäcken Använda flödescytometriska cellsortering
- Hårsäcken singel-cellsuspension erhölls genom trypsindigerering och märkt med antikroppar mot CD271 (APC-konjugerad) / HNK1 (FITC-konjugerad) eller CD271 / alfa4-integrin (PE-konjugerad) under 40 min på is i mörker.
- Centrifugera i 5 minuter vid 200 xg vid rumstemperatur och aspirera supernatanten.
- Återsuspendera cellerna i PBS innehållande 2% serum (FBS), och före sortering, är PI till grinden ut de döda cellerna.
- Utför cellsortering genom flödescytometri (FACS). Samla CD271 +, HNK1 + Double positiva celler eller CD271 +, alfa 4-integrin + Double positiva celler (Figur 2).
- Efter Sorteraning, CD271 +, HNK1 + Double positiva celler eller CD271 +, alfa4 integrin + Double positiva celler odlas i ultralåga fästplattor i NCSC mediet
4. Kultur av primära NCSCs
- Kultur disassocierade follikulära celler eller FACS sorteras celler i ultralåga fästplattor i NCSC medel, ändra medelhög varje dag.
- Kontrollera cellodling varje dag under mikroskop. NCSCs börjar bilda flytande små aggregat efter flera dagar och välformade sfärer i 2-5 veckor i odling, beroende på ålder givarna (Figur 3A). Utväxt visas i ett par dagar på bula regionen och välformade sfärer på plats i flera veckor (Figur 3B) när hela hårsäckar odlas i NCSC mediet.
5. Expansion av NCSCs
- Tvätta cellerna med PBS en gång.
- Lägg förvärmd (till 37 ° C, kritiskt) Accutase och inkubera vid 37 ° C under 5-10min med skakning regelbundet för att se neurala stamceller sfärer dissocieras till en enda cell (för fastsättning odlade NCSC, inkubera celler med Accutase vid 37 ° C i 5 minuter för att se till att hårsäcken stamceller villa).
- Tvätta och centrifugera cellerna två gånger under 5 minuter vid 200 xg vid rumstemperatur i DMEM/F12 medium för att avlägsna eventuell kvarvarande Accutase lösning.
- Återsuspendera celler med NCSC odlingsmedium.
- För flytande kultur, sätta cellerna i ultralåga fästplattor. För fastsättning kultur, sätta cellerna i förbehandlade vävnadsodlingsplattor.
6. Representativa resultat
NCSC odlingsmediet är tillräcklig för att upprätthålla hNCSCs i ett odifferentierat tillstånd utan behov av matarceller. Keratinocyter inte föröka och gradvis dog i mediet. Vissa små runda celler proliferera och bilda små aggregat i suspension efter 3 till 5 dagar. Dessa flytande aggregat ökat sakta iN storlek, genererade tredimensionella sfär-liknande strukturer, som vi kallade hår sfärer (Figur 3A). Om odlas i belagda plattor kommer NCSCs fäster till ytan och inte bilda några områden. De bifogade NCSCs växer snabbare än i suspension. Klotet-bildande eller fäst stamceller uttrycker NCSCs markörer. När hela hårsäckar är kulturer, sfärer bildas vid området motsvarar bula regionen (Figur 3B).
Figur 1. Plockade anagena (A) och telogen (B) hårsäckar.
Figur 2. Representativa bilder av FACS-analys av NCSCs Vänster panel:. Celler är gated med hjälp av anti-CD271 och anti-alphe 4 integrin-antikroppar. Höger panel: celler är gated med hjälp av anti-CD271 och anti-HNK1 antikroppar.
Figur 3. Morfologi hår sfärer (A) Morfologi av flytande hår sfärer, vänster panel:. Låg effekt, högra panelen:. Hög effekt (B) Morfologi av hår sfär på plats vid bula regionen, vänstra panelen: ett hår sfär på telogen bula, högra panelen: ett hår sfär vid bula regionen av ett anagena hårsäckar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Cell isolering och odling beskrivna metoder är reproducerbara och robust. Vi har skapat NCSCs från dussintals individer inom ett brett åldersintervall. Även om det är bäst att behandla vävnaden direkt efter vävnad skörd, fann vi att hårbotten vävnad säkert kan förvaras i media på is över natten transporter med minimal påverkan på cellviabilitet.
Det är viktigt att behandla hårbotten vävnad med antibiotika och använda aseptisk teknik under hårsäcken isolering för att undvika eventuella mikroorganismer kontaminering. Kasserad ansiktslyftning hud eller foster hårbotten avkastning vävnad hundratals livskraftiga folliklar och oftast generera tillräckligt vävnad för FACS sortering eller ytterligare experiment på bara några dagar. Stansbiopsi av hårbotten vävnad genererar vanligtvis begränsat antal celler och kräver ytterligare kultur vävnad för att ge tillräckligt med celler för ytterligare experiment.
Embryonala NCSCs ger upphov till en mängd olikacelltyper i kroppen 11, verkar det som hårsäcken härrör NCSCs också ett brett spektrum av differentiering kapacitet. Hår bula är den nisch för olika typer av stamceller 3,12. Lyle och kollegor har visat isolering av humana epitelstamceller från hår bula och dessa celler är flera potenta längs de epiteliala linjerna 13. Melanocyt prekursorer bor också i håret utbuktningen 3. Det är därför möjligt att samtidigt isolera olika populationer av stamceller genom follikel-härledda odling hårceller i medier med olika typer av tillväxtfaktorer. Hårsäcken härrör stamceller är en lovande källa för cell regenerativa terapier.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Vi har inget att lämna ut.
Acknowledgments
Detta arbete stöds av NIH bidrag R01AR054593 och R01AR054593-S1 till Xu.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM | Invitrogen | 11965-092 | |
| DMEM/F12 | Invitrogen | 11330-32 | |
| Heat-inactivated FBS | Hyclone | SH30071.03 | |
| B27 supplement | Invitrogen | 17504044 | |
| N2 supplement | Invitrogen | 17502048 | |
| bFGF | Invitrogen | PHG0026 | |
| EGF | R&D system | 236-EG-01M | |
| IGF-I | R&D system | 291-G1-050 | |
| 0.05% Trypsin/EDTA | Invitrogen | 25300-054 | |
| Dispase | Invitrogen | 17105041 | |
| Penicillin-Streptomycin | Invitrogen | 15070063 | |
Table 1. |
|||
References
- Cotsarelis, G., Cheng, S. Z., Dong, G., Sun, T. T., Lavker, R. M. Existence of slow-cycling limbal epithelial basal cells that can be preferentially stimulated to proliferate: implications on epithelial stem cells. Cell. 57, 201-209 (1989).
- Cotsarelis, G., Sun, T. T., Lavker, R. M. Label-retaining cells reside in the bulge area of pilosebaceous unit: implications for follicular stem cells, hair cycle, and skin carcinogenesis. Cell. 61, 1329-1337 (1990).
- Tanimura, S., et al. Hair follicle stem cells provide a functional niche for melanocyte stem cells. Cell Stem Cell. 8, 177-187 (2011).
- Yu, H., et al. Isolation of a novel population of multipotent adult stem cells from human hair follicles. Am. J. Pathol. 168, 1879-1888 (2006).
- Yu, H., Kumar, S. M., Kossenkov, A. V., Showe, L., Xu, X. Stem cells with neural crest characteristics derived from the bulge region of cultured human hair follicles. J. Invest. Dermatol. 130, 1227-1236 (2010).
- Wong, C. E., et al. Neural crest-derived cells with stem cell features can be traced back to multiple lineages in the adult skin. J. Cell Biol. 175, 1005-1015 (2006).
- Sieber-Blum, M., Grim, M., Hu, Y. F., Szeder, V. Pluripotent neural crest stem cells in the adult hair follicle. Dev. Dyn. 231, 258-269 (2004).
- Amoh, Y., et al. Implanted hair follicle stem cells form Schwann cells that support repair of severed peripheral nerves. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 102, 17734-17738 (2005).
- Koliatsos, V. E., Xu, L., Yan, J. Human stem cell grafts as therapies for motor neuron disease. Expert Opin. Biol. Ther. 8, 137-141 (2008).
- McKenzie, I. A., Biernaskie, J., Toma, J. G., Midha, R., Miller, F. D. Skin-derived precursors generate myelinating Schwann cells for the injured and dysmyelinated nervous system. J. Neurosci. 26, 6651-6660 (2006).
- LeDouarin, N. M., Kalcheim, C. The Neural Crest. , Cambridge University Press. Cambridge. (1999).
- Tumbar, T., et al. Defining the epithelial stem cell niche in skin. Science. 303, 359-363 (2004).
- Roh, C., et al. Multi-potentiality of a new immortalized epithelial stem cell line derived from human hair follicles. In Vitro Cell Dev. Biol. Anim. 44, 236-244 (2008).
