Summary
Fotólisis de compuestos enjaulados permite la producción de aumentos rápidos y localizados en la concentración de diversos compuestos fisiológicamente activos. Aquí, se muestra cómo obtener el patch-clamp grabaciones en combinación con la fotólisis de AMPc jaula o jaulas Ca para el estudio de la transducción olfativa en disociada del ratón neuronas sensoriales olfativas.
Abstract
Fotólisis de compuestos enjaulados permite la producción de aumentos rápidos y localizados en la concentración de diversos compuestos fisiológicamente activos 1. Compuestos enjaulados son moléculas hechas fisiológicamente inactivo por una jaula de sustancia química que puede ser rota por un destello de luz ultravioleta. Aquí, se muestra cómo obtener el patch-clamp grabaciones en combinación con la fotólisis de compuestos enjaulados para el estudio de la transducción olfativa en disociada del ratón neuronas sensoriales olfativas. El proceso de transducción olfativa (Figura 1) lleva a cabo en los cilios de las neuronas sensoriales olfativas, que une a los receptores odorantes conduce al aumento de AMPc que se abre de nucleótidos cíclicos-dependientes (GNC) 2 canales. Entrada de Ca a través de los canales de GNC activa Ca-Cl canales activados. Mostramos cómo disociar las neuronas del epitelio olfatorio de ratón 3 y la forma de activar los canales de GNC o Ca-Cl canales activados por fotólisis de AMPc jaula de 4 o 5 jaulas Ca </ Sup>. Nosotros utilizamos una lámpara de flash 6,7 aplicar destellos ultravioleta a la región ciliar a desenjaular cAMP o Ca, mientras patch-clamp grabaciones se toman para medir la corriente en el conjunto de células voltaje-clamp configuración 08/11.
Discussion
Flash fotólisis de compuestos enjaulados en combinación con patch-clamp grabaciones es una técnica útil para obtener saltos rápidos y locales en la concentración de las moléculas fisiológicamente activas, tanto dentro como fuera de las células. Existen varios tipos de compounds1 enjaulados han sido sintetizados, y esta técnica se puede aplicar a diferentes tipos de células, incluyendo células cultivadas que expresan canales iónicos que pueden ser activadas o modulada por fotólisis de algunos de los compuestos disponibles jaula 11.
Fotólisis de compuestos enjaulados requiere pulsos de alta intensidad de la luz UV cercana a desenjaular una cantidad suficiente de moléculas en un corto período de tiempo. Varias fuentes de luz se puede utilizar: una lámpara de mercurio de funcionamiento continuo o de arco de xenón controlado por un disparo y junto al puerto de epifluorescencia del microscopio, una lámpara de flash de xenón, un láser UV, y el recientemente desarrollado UV de alta potencia de diodo emisor de luz (LED ). Cada tipo de fuente de luz tiene sus ventajas y desventajasventajas de acuerdo a la aplicación específica y el costo del aparato. En comparación con una lámpara de flash, las lámparas de funcionamiento continuo con una intensidad de luz inferior, y por lo tanto la duración de los pulsos de luz controlados por un disparo es necesario aumentar hasta varios cientos de ms para obtener una cantidad suficiente de moléculas de Uncaged. Láser UV son muy caros. UV de alta potencia LED de 14 de flash fotólisis se hace disponible en el mercado y podría ser una buena alternativa a otros métodos. Sin embargo, una ventaja de las lámparas de flash es que tienen un amplio espectro de emisión de los LED UV, permitiendo el uso de varios tipos de compuestos enjaulados con diferentes características espectrales Las principales ventajas de usar una lámpara de flash de xenón para uncaging en nuestra aplicación son: una buena tiempo de resolución, de hecho la duración del pulso de luz es alrededor de 1 ms, un amplio espectro de UV que es adecuado para la fotólisis de moléculas con diferentes propiedades fotoquímicas, la posibilidad de elegir la moneda de diez centavosnsion del punto de luz para iluminar la región ciliar; la posibilidad de seleccionar fácilmente diferentes intensidades de luz 6. Además, el flash de xenón, la lámpara tiene un costo razonable, es fácil de implementar en un electro set-up, y no requiere un mantenimiento especial.
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Disclosures
No hay conflictos de interés declarado.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Adapter module flash lamp to microscope | Rapp OptoElectronic | FlashCube 70 | |
| Air table | TMC | MICRO-g 63-534 | |
| Digitizer | Axon Instruments | Digidata 1322A | |
| Data Acquisition Software | Axon Instruments | pClamp 8 | |
| Data Analysis Software | WaveMetrics | Igor | |
| Mirror for adapter module | Rapp OptoElectronic | M70/100 | |
| Electrode holder | Axon Instruments | 1-HL-U | |
| Faraday’s cage | Custom Made | ||
| Filter cube | Olympus Corporation | U-MWU | Excitation filter removed |
| Flash lamp | Rapp OptoElectronic | JML-C2 | |
| Forceps Dumont #55 | World Precision Instruments, Inc. | 14099 | |
| Glass capillaries | World Precision Instruments, Inc. | PG10165-4 | |
| Glass bottom dish | World Precision Instruments, Inc. | FD35-100 | |
| Illuminator | Olympus Corporation | Highlight 3100 | |
| Inverted microscope | Olympus Corporation | IX70 | |
| Micromanipulators | Luigs & Neumann | SM I | |
| Micropipette Puller | Narishige International | PP-830 | |
| Monitor | HesaVision | MTB-01 | |
| Neutral density filters | Omega Optical | varies | |
| Objective 100X | Carl Zeiss, Inc. | Fluar 440285 | Either Zeiss or Olympus |
| Objective 100X | Olympus Corporation | UPLFLN 100XOI2 | Either Zeiss or Olympus |
| Optical UV shortpass filter | Rapp OptoElectronic | SP400 | |
| Patch-clamp amplifier | Axon Instruments | Axopatch 200B | |
| Photo Diode Assembly | Rapp OptoElectronic | PDA | |
| Quartz light guide | Rapp OptoElectronic | varies | We use 600 μm diameter |
| Silver wire | World Precision Instruments, Inc. | AGT1025 | |
| Silver ground pellet | Warner Instruments | 64-1309 | |
| Xenon arc lamp | Rapp OptoElectronic | XBL-JML | |
| Reagent | Company | Catalogue number | |
| BCMCM-caged cAMP | BioLog | B016 | |
| Bovine serum albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | A8806 | |
| CaCl2 standard solution 0.1 M | Fluka | 21059 | |
| Caged Ca: DMNP-EDTA | Invitrogen | D6814 | |
| Cysteine | Sigma-Aldrich | C9768 | |
| Concanavalin A type V (ConA) | Sigma-Aldrich | C7275 | |
| CsCl | Sigma-Aldrich | C4036 | |
| DMSO | Sigma-Aldrich | D8418 | |
| DNAse I | Sigma-Aldrich | D4527 | |
| EDTA | Sigma-Aldrich | E9884 | |
| EGTA | Sigma-Aldrich | E4378 | |
| Glucose | Sigma-Aldrich | G5767 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H3375 | |
| KCl | Sigma-Aldrich | P3911 | |
| KOH | Sigma-Aldrich | P1767 | |
| Leupeptin | Sigma-Aldrich | L0649 | |
| MgCl2 | Fluka | 63020 | |
| Papain | Sigma-Aldrich | P3125 | |
| Poly-L-lysine | Sigma-Aldrich | P1274 | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S9888 | |
| NaOH | Sigma-Aldrich | S5881 | |
| NaPyruvate | Sigma-Aldrich | P2256 |
References
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