Summary
Een methode om translationeel actief, intact synaptoneurosomes (SNS) voor te bereiden van de hersenen van muizen cortex wordt beschreven. De methode maakt gebruik van een discontinue Percoll-sucrose dichtheidsgradiënt waardoor voor de snelle bereiding van actieve SNS.
Abstract
Synaptoneurosomes (SNS) zijn verkregen na homogenisering en fractionering van muizenhersenen cortex. Ze worden opnieuw verzegeld blaasjes of geïsoleerd terminals die los te maken van axon terminals als de corticale weefsel wordt gehomogeniseerd. De SNS behoudt pre-en postsynaptische eigenschappen, waardoor ze nuttig zijn in de studie van de synaptische transmissie. Zij behouden de moleculaire machines gebruikt in de neuronale signalering en zijn in staat van opname, opslag en afgifte van neurotransmitters.
De productie en isolatie van actieve SNS kan problemen opleveren met behulp van media, zoals Ficoll, die kunnen worden cytotoxische en vereisen uitgebreid centrifugeren door de hoge dichtheid, en filtratie en centrifugeren methoden, die kan in lage activiteit resultaat als gevolg van mechanische schade van de SNS. Echter, het gebruik van discontinue Percoll-sucrose dichtheidsgradiënten aan SNS isoleren biedt een snelle methode om een goede opbrengst van translationeel actief SNS produceren. De Percoll-sucrose gradiënt methode is snel en zacht als zij in dienst isotone omstandigheden, heeft minder en kortere centrifugeren spins en vermijdt centrifugeren stappen die pellet SNS en mechanische schade.
Protocol
1. Voorbereidingen 1-4
- Bereid 500 ml gradiënt medium (GM) buffer door het mengen van 50 ml van een 2,5 M sucrose slurry, 2,5 ml van een 1 M Tris-HCl, pH 7,5 voorraad, en 0,1 ml van een 0,5 m EDTA, pH 8,0 voorraad met milli- Q water om het volume. Filter steriliseren van de oplossing, hoeveelheid en opslaan van bevroren.
- Bereid een 1000x voorraad tetrodotoxine (TTX) door het maken van een een mM oplossing in milli-Q H 2 O. Aliquots van TTX kan worden opgeslagen bij -20 ° C.
- Bereid 10x Stimulatie Buffer door het maken van een oplossing van 100 mM Tris (pH 7,5), 5 mM Na 2 HPO 4, 4 mM KH 2 PO 4, 40 mM NaHCO 3, en 800 mM NaCl in milli-Q water. Voorraad kan worden opgeslagen bij 4 ° C.
- Pre-cool centrifuges tot 4 ° C.
- Bereid een voorraad oplossing van Isosmotic Percoll (SIP) door toevoeging van negen volumes van Percoll (18 ml) tot een volume van 2,5 M sucrose (2 ml) in milli-Q water en meng goed.
- De voorbereiding van de drie, 10, 15, en 23% helling lagen door het toevoegen van de respectievelijke bedragen van SIP naar GM buffer en het mengen van elk:
- Giet helling lagen door pipetteren 2 ml van elk van de 23, 15, 10, en 3% isosmotic Percoll oplossingen in de Beckman centrifuge buizen met doppen met een P1000 Gilson Pipetman. De interface tussen de lagen moet duidelijk waarneembaar, zonder vermenging van de lagen. Bewaar de hellingen bij 4 ° C gedurende ten minste 20 minuten vóór gebruik. De gradiënten kunnen worden opgeslagen voor tot 24 uur, hoewel dezelfde dag gebruik wordt aanbevolen. [Onervaren laboratorium personeel kan de praktijk voorbereiden gradiënten door het toevoegen van blauwe kleurstof om de isomotic Percoll oplossingen voor visualisatie van de laag interfaces.]
2. Muis dissectie een
- Zorg ervoor dat alle muizen veeteelt en euthanasie worden uitgevoerd in overeenstemming met NIH en de Universiteit richtlijnen. Euthanaseren pups (leeftijd P13 tot P21) door kooldioxide stikken of door een goedgekeurde methode van in het dier protocol.
- Speld de muis om een dissectie raad van bestuur en spuit de achterkant van de nek en hoofd met ethanol. Met behulp van een scherpe schaar snijden door het ruggenmerg aan de basis van de schedel, verwijder de huid van de bovenkant van de schedel, zijdelings snijden de schedel tussen de pariëtale bot en de interparietal bot of tussen de hersenen en de cortex regio's. Knip dan de schedel van de basis naar de neus (langs de sagittale hechting), verwijder voorzichtig de zachte pariëtale bot door te trekken elk halfrond aan de zijkant en verwijder de cortex met een spatel. Plaats de spatel in de hersenen boven het cerebellum en dan schep de cortex en plaats het in ijskoude GM buffer. Ga direct naar de homogenisering stap. Laat niet de cortex zitten in ijskoude buffer voor zeer lang, omdat dit nadelige gevolgen zal de vorming van SNS beïnvloeden.
3. Voorbereiding van homogenaat en SNS 1-4
- Spoel de cortex in de ijskoude GM buffer en overdracht twee cortex om een glas Dounce homogenisator met 5 ml koud GM buffer.
- Voorzichtig gehomogeniseerd de cortex met 5-10 slagen van de losse stamper (pestle "A"), gevolgd met 5-10 slagen van de krappe stamper (pestle "B"). Slagen moet snel, maar langzaam genoeg niet om luchtbellen te veroorzaken. Een foto van de homogenaat na homogenisering is in Schema 1. Het aantal slagen zal variëren afhankelijk van de individuele homogenisator en bijbehorende stampers. Wanneer u klaar bent de hellingen moet een sterke band SN te geven, zo niet, pas het aantal slagen.
- Breng de homogenaat om een 15 ml conische en centrifugeer bij 1000xg gedurende 10 min bij 4 ° C in een swingende emmer rotor (Allegra 6KR centrifuge) om pellet cellulaire puin en kernen. Een foto van de gesponnen homogenaat wordt in Schema 1.
- Laag 2 ml van de bovenstaande per Percoll-sucrose gradiënt, cap de buizen, en centrifugeer bij 32.500 xg gedurende 5 min bij 4 ° C in een vaste hoek rotor (Beekman J2-21 centrifuge, JA-17 rotor) met behulp van geschikte adapters ( Zie Reagentia en apparatuur tabel).
- Pipet uit en gooi de oplossing boven de SN band met een glazen Pasteur pipet. Pipet uit de SN band op de 15/23%-interface, transfer naar een conische en op te slaan op het ijs. Elke verloop of een cortex zal produceren 0.9-1.1 mL van SN.
- Pas de zoutconcentratie van het SNS door de toevoeging van een tiende volume van 10x stimulatie buffer, voeg 1000x CaCl 2 tot een uiteindelijke concentratie van 12 nM, en 1 mM TTX voorraad tot een uiteindelijke concentratie van 1 uM toe te voegen aan niet-specifieke excitatie te onderdrukken. (Toevoeging van CaCl 2 is optioneel indien het zal interfereren met downstream SN toepassingen).
- Bepaal de eiwitconcentratie van de SNS met behulp van de Micro BCA Protein Assay Kit. (De Bradford proteïne test is niet aan te raden vanwege de gevolgtrekking uit de Percoll.)
- SNS kan direct en snel worden gebruikt voor de eiwit-vertalingTIE studies. Voor andere toepassingen SN lysaat kan worden opgeruimd of geconcentreerd met behulp van de Pierce SDS-PAGE Sample Prep Kit.
4. Representatieve resultaten:
Wanneer de muis cortex werd gehomogeniseerd en gescheiden op discontinue Percoll-sucrose gradiënten (Schema 1), 6 bands of fracties werden gezien (figuur 1). Het was eerder al aangetoond voor rat cerebrale cortex 3,5 dat de bestanddelen van het hoge moleculair gewicht banden werden membraan en myeline gebroken en dat het ingehulde materiaal mitochondriën of organellen (tabel 1). De 23% / 15%-interface (Band 5) bevatte de verrijkte SNS.
De band van de 23% / 15%-interface, met intact SNS, werd verwijderd en onderzocht met behulp van elektronenmicroscopie (EM), zoals eerder beschreven. 2,6 EM de aanwezigheid van intacte synaptische blaasjes en het behoud van de presynaptische en postsynaptische elementen (figuur zien 2). Isolatie van pre-en postsynaptische compartimenten is belangrijk voor de behandeling van signalering en eiwitsynthese, die voorkomt in beide compartimenten. 7-13 De Percoll-sucrose gradiënt is een ruwe zuivering, zodat we zagen kleine cellulaire, nucleaire en organel besmetting in de SN-fractie, maar de de totale scheiding was goed.
Wanneer onderzocht door Western blot, de Percoll fracties die het verwachte eiwit markers met een toename van de synaptische zuiverheid in de SN band (figuur 3, tabel 2). Synaptische en neuronale markers werden gehandhaafd in de verrijkte SN band (Band 5), maar de overvloed van andere markers werd aanzienlijk verminderd. Met name de aanwezigheid van GFAP, een marker voor astrocyten en neoplastische cellen van gliale oorsprong, en Lamin-B1, een nucleaire marker, waren te verwaarlozen, terwijl structurele en synaptische markers werden gehandhaafd of verbeterd. Daarnaast was er het behoud van markers voor organellen, zoals de mitochondria en het Golgi, die een rol spelen in de eiwitsynthese.
Typische rendementen voor de SN band waren 250-500 ng van eiwit per microliter, zoals bepaald door BCA eiwit-test. De activiteit van de SNS werd bepaald door het bedrag van de novo eiwitsynthese te presenteren als gecontroleerd door [35S]-Met incorporatie (figuur 4). 2 Basal translationeel activiteit werd verhoogd 1,56 voudig indien SNS werden gestimuleerd met 50 uM glutamate/10 uM glycine (Glu) of 5,12 folden als geactiveerd met de Pin1 remmer juglone. Pin1 remming is bekend dat leiden tot een verhoogde proteïnesynthese. 2 Om te bevestigen dat de verhoging van [35S]-Met opname was te wijten aan de novo eiwitsynthese, voegden we 40 uM anisomycin, een eiwitsynthese remmer, en zag een duidelijke afname in oprichting in de aanwezigheid en afwezigheid van Glu in vergelijking met basale niveaus. Tevens, op de toevoeging van 2% Triton-X 100, die de integriteit van de SNS verstoort, was basale vertaling daalde met 75%. 2 Ook bij het onderzoek van de banden (B4-B6) die de meeste synaptische marker verrijking zien, De SNS-of Band 5 had de grootste activiteit voor de novo eiwitsynthese (figuur 5). Zo is het discontinue Percoll-sucrose gradiënten snel een zeer actief en verrijkt SN band die kan worden gebruikt om eiwit vertaling te bestuderen.
De discontinue Percoll-sucrose gradiënt procedure is voordeliger dan andere methoden, omdat mechanische schade is veroorzaakt door zwaardere omstandigheden. In vergelijking met de filtratie-methode, waarbij gewist corticale homogenaat wordt door een reeks filters die afnemen in grootte, 3,14-15 de Percoll methode meer SNS vormen met een grotere activiteit. Zoals te zien in Figuur 6, wanneer een hoeveelheid van SNS opgesteld door de filtratie methode was gepasseerd een Percoll-sucrose gradiënt zijn er veel minder SNS op de 15/23%-interface en een grotere hoeveelheid van gebroken vliezen. Wanneer de novo eiwitsynthese werd gemeten via een S35-met oprichting, de SNS opgesteld door de filtratie methode waren veel minder actief (figuur 7). Voor een maximale translationele activiteiten gebruiken we muizen die tussen de leeftijd van P14 en P18. SN kunnen worden bereid uit volwassen muizen, maar zagen we aanzienlijk toegenomen translationele activiteit met SN bereid uit juvenile muizen (figuur 8).
Tabel 1. Bestanddelen van de bands uit de discontinue Percoll-gradiënt fractioneringen van gehomogeniseerde muis cortex. 3,5
Tabel 2. Samenvatting van de westerse bout de analyse van discontinue Percoll-sucrose gradiënt band bestanddelen. Relatieve eiwitconcentraties voor elk van de band fracties geïsoleerd met behulp van een discontinue Percoll-sucrose gradiënt werden bepaald door Western blot. Geen eiwit aanwezig is (-), 0 ≥ 0,2 (+), 0,2 ≥ 0,8 (++), of> 0,8 (+++) maal groter waren dan eiwit aanwezig is in de supernatant (S, gecentrifugeerd cortex homogenaat), vertegenwoordiger van n = 3.
Schema 1: Schema van een SN preparaat met behulp van een discontinue Percoll-sucrose dichtheidsgradiënt Mouse hersenen cortex werden ontleed, gehomogeniseerd, en gecentrifugeerd op lage snelheid niet-gehomogeniseerd weefsel, cellen, hele organellen zoals de kernen en membranen te verwijderen.. De discontinue gradiënt moet duidelijk gedefinieerde lagen. De foto inzet toont een voorbeeld van de lagen, die zijn geverfd blauw alleen voor illustratieve doeleinden, om de lagen te visualiseren. Het supernatant is gelaagd op de top van een discontinue Percoll-sucrose gradiënt en gecentrifugeerd bij gemiddelde snelheid. De SN band wordt dan opgehaald van de helling en is klaar voor gebruik.
Figuur 1. Homogenaat fractionering op een discontinue Percoll-sucrose gradiënt. Muis cortex werd gehomogeniseerd en gescheiden op een discontinue Percoll-sucrose gradiënt die aanleiding geeft tot zes bands of fracties. Het gezuiverde, actieve SNS (*) zijn gevonden in Band 5.
Figuur 2. SN voorbereidingen geven een heterogene mix van SNS dat de presynaptische en postsynaptische elementen te behouden. Een electronen microscoop foto van een SN preparaat bereid uit C57BL / 6 muizen (leeftijd P13 tot P21) werd uitgevoerd zoals eerder beschreven en toont SNS met gekonfijte presynaptische en postsynaptische elementen 2. , 6 rode pijlen wijzen naar post-synaptische dichtheden. Schaal bar is 1 micrometer.
Figuur 3. Western blot analyses van SN de voorbereidingen bleek dat synaptische en neurale markers werden behouden in het gezuiverde SNS (Band 5), maar de overvloed van andere markers werd aanzienlijk verminderd. Immunoblots van het supernatans (S, gecentrifugeerd corticale homogenaat) en Bands 1-6 van een discontinue Percoll-sucrose gradiënt werd gesondeerd voor β-actine (structurele, laden controle), GFAP (astrocytaire), GP73 (Golgi), HSC70 (cytoplasmatische en nucleaire), Lamin-B1 (nucleaire), Prohibitin (mitochondriale), PSD95 (postsynaptische dichtheid ), SNAP25 (synaptic), synaptofysine (synaptic) en β3-tubuline (neuron-specifieke). De bands werden gevisualiseerd met behulp van een Storm 860 Phosphorimager, vertegenwoordiger van n = 3.
Figuur 4. SNS zijn actief en vertonen de novo eiwitsynthese via [35S]-Met de oprichting. SNS waren pre-evenwicht gebracht tot 37 ° C gedurende 10 minuten. Dan is de Sns waren onbehandeld of voorbehandelde gedurende 15 minuten met 40 uM anisomycin of 1 uM juglone bij 37 ° C gevolgd door toevoeging van [35S]-Met, 20 ul Express Pro Label S35 Gemakkelijk Tag Mix, plus of min Glu bij 37 ° C gedurende 30 minuten. De monsters werden bereid met behulp van de Pierce SDS-PAGE Sample Prep Kit, draaien op een 15% polyacrylamide gel, gedroogd en gekwantificeerd met behulp van een moleculaire dynamica Storm 860 phosphorimager, vertegenwoordiger van n = 3, ± SEM.
Figuur 5. Band 5 van de discontinue Percoll-sucrose gradiënt bevat de hoogste niveaus van de novo eiwitsynthese. Banden 4, 5 en 6 en de supernatant (S, gecentrifugeerd corticale homogenaat) waren vooraf geëquilibreerd tot 37 ° C gedurende 10 minuten. Dan, [35S]-Met, Express Pro Label Mix S35 Gemakkelijk Tag, werd toegevoegd, plus of min Glu bij 37 ° C gedurende 30 minuten. De monsters werden bereid met behulp van de Pierce SDS-PAGE Sample Prep Kit, draaien op een 15% polyacrylamide gel, gedroogd en gekwantificeerd met behulp van een moleculaire dynamica Storm 860 phosphorimager, vertegenwoordiger van n = 3, ± SEM.
Figuur 6. SNS bereid uit een filtratie methode bevat meer gebroken vliezen en minder dan hele SNS SNS bereid uit de discontinue Percoll-sucrose gradiënt-methode. SNS werden voorbereid door het passeren gehomogeniseerd cortex door een reeks van filters met afnemende poriegrootte zoals eerder beschreven. 3,14-15 Een deel van de SNS opgesteld door de filtratie methode werd gecentrifugeerd op een discontinue Percoll-sucrose gradiënt en in vergelijking met een gelijkwaardig bedrag van materiaal met behulp van de discontinue Percoll-sucrose gradiënt-methode.
Figuur 7. SNS bereid uit een filtratie methode bevat minder de novo eiwitsynthese activiteit dan SNS weer bereidm de discontinue Percoll-sucrose gradiënt-methode. SNS werden voorbereid door het passeren gehomogeniseerd cortex door een reeks van filters met afnemende poriegrootte zoals eerder beschreven, 3,14-15 en door de discontinue Percoll-sucrose gradiënt methoden. SNS van beide preparaten waren pre-evenwicht gebracht tot 37 ° C gedurende 10 minuten. Dan, [35S]-Met, Express Pro Label Mix S35 Gemakkelijk Tag, werd toegevoegd, plus of min Glu bij 37 ° C gedurende 30 minuten. De monsters werden bereid met behulp van de Pierce SDS-PAGE Sample Prep Kit, draaien op een 15% polyacrylamide gel, gedroogd en gekwantificeerd met behulp van een moleculaire dynamica Storm 860 phosphorimager, vertegenwoordiger van n = 3, ± SEM.
Figuur 8. SNS van jongere muizen (P14) hebben een grotere translationeel activiteit dan oudere muizen (P85). SNS werden bereid uit verschillende oude muizen met behulp van de discontinue Percoll-sucrose gradiënt-methode, preequilibrated bij 37 ° C gedurende 10 min, behandeld of onbehandeld met Glu in het aanwezigheid van [35S]-Met (Express Pro Label Mix S35 Eenvoudige Tag) gedurende 30 min, snap ingevroren en later schoongemaakt met de Pierce SDS-PAGE Sample Prep Kit. De SNS werden vervolgens draaien op een 12% SDS-polyacrylamide gel, gedroogd en afgebeeld op een Molecular Dynamics Storm 860 phosphorimager, vertegenwoordiger van n = 3, ± SEM. SNS vanaf P14 muizen werden minstens 3-maal meer actief dan P85 muizen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De discontinue Percoll-sucrose gradiënt bereiding hierin beschreven is een snelle, betrouwbare methode om actief SNS, die gebruikt kunnen worden in een verscheidenheid van synaptische transmissie experimenten te isoleren. Dit verloop methode, die is gebaseerd op de methode ontwikkeld door Dunkley et al.., 3,4 is een subcellulaire hersenen fractionering procedure, die zowel pre-en postsynaptische membraan-afgeleide blaasjes die geassocieerd zijn met elkaar isoleert. Zonder verdere zuivering van deze SNS zijn compatibel met een scala aan moleculair-biologische technieken, waaronder immunoprecipitatie, western blotting, flowcytometrie, monitoring de novo eiwitsynthese via [35S]-Met oprichting, elektronenmicroscopie, en een verscheidenheid aan enzymactiviteit proeven, waaronder isomerase en kinase-activiteit assays.
De discontinue Percoll-sucrose gradiënt procedure is vrij rechttoe rechtaan, maar het is de sleutel tot oplossingen en hersenmateriaal te houden bij 4 ° C gedurende de voorbereiding en pre-chill de gradiënten. Hoewel de homogenaat wordt gehouden ijskoud te allen tijde te proteolyse te minimaliseren, voor een betere rendement met meer activiteit is het best niet te laten de cortex zitten op het ijs in GM buffer te lang voor homogenisering. De vorming van SNS is het best wanneer de cortex worden gespoeld en vervolgens snel gehomogeniseerd. Het homogenaat, kan echter worden bewaard op ijs voor de eerste centrifugeren, zonder nadelige gevolgen. Snelheid is een probleem zodra de cortex zijn geoogst, zodat de isolatie van SNS moet worden ingevuld zo snel mogelijk. Hoewel SNS kan een hoge activiteit behouden voor 1-2 uur, zal langere tijd tussen de stappen leiden tot een verminderde activiteit. De leeftijd van de muizen gebruikt voor de SN voorbereiding is ook een belangrijk probleem. Het is eerder aangetoond dat er een leeftijd gerelateerde daling in synaptische plasticiteit in knaagdieren. 16-19 We hebben hetzelfde effect te zien in SNS. Hoewel de oudere muizen kunnen worden gebruikt om translationeel actief SNS te maken, hebben we gemerkt dat jongere muizen (P14) van meer translationeel activiteit hebben dan oudere muizen (P85).
Er zijn diverse variaties en combinaties van filtratie, 5,14-15,20-23 centrifugeren, 24-27 en 26-29 gradiënt methoden die zijn gebruikt voor de SNS voor te bereiden en elk heeft zijn eigen voordelen en nadelen. Filtratie en centrifugatie methoden kunnen leiden tot mechanische schade aan de SNS. De methoden die zijn gebruikt verschillende porie grootte filters resulteerde in een groter percentage van gebroken vliezen en het rendement aanzienlijk minder SNS. We hebben geprobeerd de filter methode 5,14-15 die de homogenaat passeert een reeks filters met afnemende poriegrootte en vond dat de SNS opgesteld door de filtratie methode waren beduidend minder actief. Het centrifugeren methoden ook leiden tot mechanische schade als gevolg van de verlengde draait op hoge snelheden die pellet of compacte De SNS aan de onderkant van buizen en vereisen resuspensie. Percoll heeft mildere aandoeningen die voorkomen dat filteren of pelleteren de SNS, die kunnen verpletteren of lyseren van de SNS. SN procedures die Ficoll 28,30-32 of hoge molarities van sucrose 4,31 eveneens resulteren in beschadigde of minder actief gebruik maken van SNS, verminderde biologische functie en morfologische veranderingen. 31-32 Ficoll kan leiden tot ongewenste cel aggregatie bij fysiologische pH en geeft osmotische gradiënten met toenemende concentraties. 31-32 te isoosmotic voorwaarden houden, de hellingen moeten worden gecompenseerd met een zout gradiënt. 31 SNS bereid met een hoge concentratie van sucrose (+1,4 tot +0,8 M) leiden tot een kleiner en minder actief SNS 4.
De discontinue Percoll-sucrose methode ondervangt veel van de problemen die betrokken zijn bij andere media en centrifugeren procedures. Een groot voordeel van deze methode is het gebruik van Percoll, die een lage viscositeit, een lage osmolariteit en relatief niet toxisch naar cellen en hun kiezers heeft, waardoor het beter geschikt is voor dichtheidsgradiënt experimenten dan alternatieven. 4,29 Daarnaast Percoll kunnen worden bereid met sucrose het handhaven van de osmolariteit die nodig is om SN integriteit te behouden. 4 Het gebruik van discontinue Percoll-sucrose gradiënten vermindert het centrifugeren tijd van 30-45 min. tot 5 min, waardoor de uitbreiding van de nuttige levensduur van de SNS, met een beperkte levensduur voor de activiteit . Een ander voordeel van de Percoll hellingen is de hogere opbrengst en de activiteiten van SNS in vergelijking met de methoden die gebruik maken van filters om SNS te vormen. We renden De SNS uit de filter methode over een Percoll-sucrose gradiënt. We vonden een nauwelijks waarneembaar SN band en een overvloed aan hoger molecuulgewicht gebroken membranen op het verloop. Ook de translationele activiteit van de SNS opgesteld door de Percoll methode was significant hoger dan bij de filter-methode. Over het algemeen Percoll is te verkiezen boven andere methoden, omdat zij in dienst mildere aandoeningen die voorkomen filtering en pelleteren de SNS-resultaat ing in een grotere behoud van synaptische activiteit en een betere vesicles. Het voordeel van onze methode meer dan Dunkley, et al., 3,4 is dat een glas, glas Dounce homogenisator werd hierin gebruikt in tegenstelling tot de motor aangedreven Teflon, glas homogenisator dat de schade die de meeste postsynaptische terminal bijlagen en leidt tot het postsynaptische elementen wordt blootgesteld aan de media en zeer weinig worden omsloten door de intacte membranen.
Belangrijk werk heeft zich gericht op de eiwitsynthese in de post-synaptische densiteit 11-13, maar weinig werk is gedaan om de eiwitsynthese studeren in de presynaptische compartimenten. Toch zijn er aanwijzingen dat de eiwitsynthese optreedt in de presynaptische terminals. 7-10 Zoals te zien is in de electronen microscoop foto van de SNS, pre-en postsynaptische bijlagen bestaat in de SN voorbereiding waardoor ze een ideaal systeem voor de toekomstige studie van de translationele activiteiten in beide compartimenten.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Geen belangenconflicten verklaard.
Acknowledgments
We willen graag BK augustus bedanken van de Universiteit van Wisconsin-Madison Electron Microscope faciliteit voor de elektronenmicroscopie. Dit werk werd ondersteund door NIH subsidie R01-DA026067 en P30-HD03352 (tot JSM).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
| Micro BCA Protein Assay Kit | Pierce | 23235 | |
| CaCl2 | Fisher | C79-500 | |
| CO2 gas | Airgas (UW-MDS) | CD 50 | |
| EDTA | RPI | E57020 | |
| EtOH | Fisher | A407SK-4 | |
| HCl | Fisher | A142-212 | |
| Percoll | GE Healthcare | 17-0891-01 | |
| KH2PO4 | Fisher | P285-500 | |
| PierceSDS-PAGE Sample Prep Kit | Pierce | 89888 | |
| NaCl | RPI | S23020 | |
| NaHCO3 | Fisher | BP328-500 | |
| Na2PHO4 | Fisher | S381-500 | |
| Sucrose | RPI | S24060 | |
| Tris Base | RPI | T60040 | |
| Tetrodotoxin | Sigma | T5651 | |
| Express Pro Label Mix S35 Easy Tag | Perkin Elmer | NEG772 | |
| Equipment | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
| Dissection tools | |||
| Dounce homogenizer, 7 mL (comes with two glass pestles labled " A" and "B") | Wheaton | ||
| P1000 Gilson Pipetman | Gilson | F123602 | |
| Allegra 6KR Centrifuge | Beckman Coulter | 366830 | |
| GH 3.8 Rotor, Swinging bucket rotor | Beckman Coulter | 360581 | |
| Beckman J2-21 Centrifuge | Beckman | ||
| Beckman tubes with caps | Beckman | 355672 | |
| White walled adapters | Beckman | 342327 | |
| Blue walled adapters | Beckman | ||
| JA-17 Rotor, Fixed-angle rotor | Beckman | 369691 | |
Table of antibodies used for western blots: |
|||
| Name of Antibody | Company | Catalogue number | Host Species |
| β-Actin | Sigma | A5441 | mouse |
| GFAP | Santa Cruz | sc-65343 | mouse |
| GP73 | Santa Cruz | Sc-134509 | rabbit |
| HSC70 | Santa Cruz | sc-7298 | mouse |
| Laminβ | Santa Cruz | Sc-6261 | goat |
| Prohibitin | Santa Cruz | sc-28259 | rabbit |
| PSD95 | Millipore | MAB1596 | mouse |
| SNAP25 | AbCam | ab5666-100 | rabbit |
| Synaptophysin | Millipore | MAB368 | mouse |
| β-3-Tubulin | Santa Cruz | sc-80016 | mouse |
|
|||
References
- Westmark, C. J., Malter, J. S. FMRP mediates mGluR5-dependent translation of amyloid precursor protein. PLoS Biol. 5, e52-e52 (2007).
- Westmark, P. R., Westmark, C. J., Wang, S., Levenson, J., O'Riordan, K. J., Burger, C., Malter, J. S. Pin1 and PKMzeta sequentially control dendritic protein synthesis. Sci Signal. 3, ra18-ra18 (2010).
- Dunkley, P. R., Heath, J. W., Harrison, S. M., Jarvie, P. E., Glenfield, P. J., Rostas, J. A. A rapid Percoll gradient procedure for isolation of synaptosomes directly from an S1 fraction: Homogeneity and morphology of subcellular fractions. Brain Res. 441, 59-71 (1988).
- Dunkley, P. R., Jarvie, P. E., Robinson, P. J. A rapid Percoll gradient procedure for preparation of synaptosomes. Nat. Protoc. 3, 1718-1728 (2008).
- Hollingsworth, E. B., McNeal, E. T., Burton, J. L., Williams, R. J., Daly, J. W., Creveling, C. R. Biochemical characterization of a filtered synaptoneurosome preparation from guinea pig cerebral cortex: cyclic adenosine 3':5'-monophosphate-generating systems, receptors, and enzymes. J. Neurosci. 5, 2240-2253 (1985).
- Yi, H., Leunissen, J., Shi, G., Gutekunst, C., Hersch, S. A novel procedure for pre-embedding double immunogold-silver labeling at the ultrastructural level. J. Histochem. Cytochem. 49, 279-284 (2001).
- Akins, M. R., Berk-Rauch, H. E., Fallon, J. R. Presynaptic translation: stepping out of the postsynaptic shadow. Front. Neural Circuits. 3, (2009).
- Jin, I., Kandel, E. R., Hawkins, R. D. Whereas short-term facilitation is presynaptic, intermediate-term facilitation involves both presynaptic and postsynaptic protein kinases and protein synthesis. Learn. Mem. 18, 96-102 (2011).
- Lyles, V., Zhao, Y., Martin, K. C. Synapse formation and mRNA localization in cultured Aplysia neurons. Neuron. 49, 349-356 (2006).
- Wagatsuma, A., Azami, S., Sakura, M., Hatakeyama, D., Aonuma, H., Ito, E. De Novo synthesis of CREB in a presynaptic neuron is required for synaptic enhancement involved in memory consolidation. J. Neurosci. Res. 84, 954-9560 (2006).
- Sutton, M. A., Schuman, E. M. Local translational control in dendrites and its role in long-term synaptic plasticity. J. Neurobiol. 64, 116-131 (2005).
- Li, K. -W., Hornshaw, M. P., Van der Schors, R. C., Watson, R., Tate, S., Casetta, B., Jimenez, C. R. Proteomics analysis of rat brain postsynaptic density: implications of the diverse protein functional groups for the integration of synaptic physiology. J. Biol. Chem. 279, 987-1002 (2004).
- Peng, J., Kim, M. J., Cheng, D., Duong, D. M., Gygi, S. P., Sheng, M. Semi-quantitative proteomic analysis of rat forebrain postsynaptic density fractions by mass spectrometry. J. Biol. Chem. 279, 21003-21011 (2004).
- Kim, S. H., Fraser, P. E., Westaway, D., St. George-Hyslop, P. H. Group II metabotropic glutamate receptor stimulation triggers production and release of Alzheimer's amyloid β42 from isolated intact nerve terminals. J. Neurosci. 30, 3870-3875 (2010).
- Weiler, I. J., Greenough, W. T. Potassium ion stimulation triggers protein translation in synaptoneurosomal poiyribosomes. Mol. Cell. Neurosci. 2, 305-314 (1993).
- Billard, J. M. Ageing, hippocampal synaptic activity and magnesium. Magnes Res. 19, 199-215 (2006).
- Murphy, G. G., Fedorov, N. B., Giese, K. P., Ohno, M., Friedman, E., Chen, R., Silva, A. J. Increased neuronal excitability, synaptic plasticity, and learning in aged Kvbeta1.1 knockout mice. Curr. Biol. 14, 1907-1915 (2004).
- Norris, C. M., Halpain, S., Foster, T. C. Reversal of Age-Related Alterations in Synaptic Plasticity by Blockade of L-Type Ca21 Channels. J. Neurosci. 18, 3171-3179 (1998).
- Sallert, M., Malkki, H., Segersträlea, M., Tairaa, T., Lauri, S. E. Effects of the kainate receptor agonist ATPA on glutamatergic synaptic transmission and plasticity during early postnatal development. Neuropharm. 52, 1354-1365 (2007).
- Quinlan, E. M., Philpot, B. D., Huganir, R. L., Bear, M. F. Rapid, experience-dependent expression of synaptic NMDA receptors in visual cortex in vivo. Nat. Neurosci. 2, 357-35 (1999).
- Scheetz, A. J., Nairn, A. C., Constantine-Patton, M. NMDA receptor-mediated control of proteins synthesis at developing synapses. Nat. Neurosci. 3, 211-216 (2000).
- Villasana, L. E., Klann, E., Tejada-Simon, M. V. Rapid isolation of synaptoneurosomes and postsynaptic densities from adult mouse hippocampus. J. Neurosci. Methods. 158, 30-36 (2006).
- Weiler, I. J., Greenough, W. T. Metabotropic glutamate receptors trigger postsynaptic protein synthesis. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 90, 7168-7171 (1993).
- Gray, E. G., Whittaker, V. P. The isolation of nerve endings from brain: An electron microscopic study of cell fragments derived by homogenization and centrifugation. J. Anat. 96, 79-88 (1962).
- Gylys, K. H., Fein, J. A., Yang, F., Cole, G. M. Enrichment of Presynaptic and Postsynaptic Markers by Size-Based Gating Analysis of Synaptosome Preparations From Rat and Human Cortex. Cytometry A. 60, 90-96 (2004).
- Hajós, F. An improved method for the preparation of synaptosomal fractions in high purity. Brain Res. 93, 485-489 (1975).
- Bai, F., Witzmann, F. A. Synaptosome Proteomics. Subcell. Biochem. 43, 77-98 (2007).
- Rao, A., Steward, O. Evidence that protein constituents of postsynaptic membrane specializations are locally synthesized: analysis of proteins synthesized within synaptosomes. J Neurosci. 11, 2881-2895 (1991).
- Pertoft, H., Laurent, T. C. Isopycnic separation of cells and cell organelles by centrifugation and modified colloidal silica gradients. Methods of Cell Separation. Catsimpoolas, N. , Plenum Press. New York. 25-65 (1977).
- Ramarao, C. S., Acharya, S. R., Krishnan, K. S., Kenkare, U. W. High affinity uptake of L-glutamate and γ-aminobutyric acid in Drosophila melanogaster. J. Biosci. 11, 119-135 (1987).
- Munteanu, L. S., Dinu, A. Fractionation of granulocytes from whole human blood by centrifugation. Practical hints. Romanian J. Biophys. 14, 53-58 (2004).
- Cell separation composition, kit and method. US patent. Vlasselaer, P., Van Palathumpat, V. , 019713 (1997).
