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Neuroscience

माउस प्रांतस्था से Synaptoneurosomes असंतत घनत्व Percoll Sucrose ढाल का उपयोग कर की तैयारी

Published: September 17, 2011 doi: 10.3791/3196
Automatic Translation
1, 1, 2, 1
1Department of Pathology and Laboratory Medicine, Waisman Center for Developmental Disabilities, University of Wisconsin, 2Department of Biochemistry, Waisman Center for Developmental Disabilities, University of Wisconsin

Summary

माउस मस्तिष्क प्रांतस्था से translationally सक्रिय बरकरार synaptoneurosomes (SNS) तैयार करने की विधि वर्णित है. विधि एक असंतत घनत्व Percoll - sucrose सक्रिय SNS की जल्दी तैयार करने के लिए अनुमति देता है ढाल का उपयोग करता है.

Abstract

Synaptoneurosomes (SNS) और माउस मस्तिष्क प्रांतस्था के homogenization fractionation के बाद प्राप्त कर रहे हैं. वे vesicles या पृथक टर्मिनलों कि अक्षतंतु टर्मिनलों से दूर तोड़ने जब cortical ऊतक homogenized है resealed हैं. SNS - पूर्व और postsynaptic विशेषताओं को बनाए रखने, जो उन्हें synaptic प्रसारण के अध्ययन में उपयोगी बनाता है. वे आणविक neuronal संकेतन में इस्तेमाल किया मशीनरी बनाए रखने और तेज, भंडारण, और न्यूरोट्रांसमीटर की रिहाई के लिए सक्षम हैं.

उत्पादन और सक्रिय SNS के अलगाव Ficoll, जो साइटोटोक्सिक हो सकता है और उच्च घनत्व, और निस्पंदन और centrifugation तरीकों, जो कम गतिविधि में SNS के यांत्रिक क्षति के कारण परिणाम कर सकते हैं करने के लिए विस्तारित कारण centrifugation की आवश्यकता कर सकते हैं जैसे समस्याग्रस्त medias का उपयोग किया जा सकता है. हालांकि, असंतत Percoll sucrose gradients घनत्व का उपयोग करने के लिए SNS अलग translationally सक्रिय SNS की अच्छी पैदावार के उत्पादन के लिए एक तेजी से विधि प्रदान करता है. ढाल Percoll sucrose विधि त्वरित और कोमल के रूप में इसे isotonic शर्तों को रोजगार, कम और कम centrifugation spins है और centrifugation कदम से बचा जाता है कि गोली SNS और यांत्रिक क्षति का कारण है.

Protocol

1. 1-4 तैयारियां

  1. ढाल माध्यम से 500 एमएल बफर (जीएम) एक 2.5 एम sucrose के घोल का 50 एमएल मिश्रण से तैयार करने के लिए, एक 1M Tris - एचसीएल, pH7.5 शेयर, और एक 0.5 मीटर EDTA की 0.1 एमएल की 2.5 एमएल, पीएच 8.0 के साथ शेयर milli- क्यू मात्रा करने के लिए पानी. बाँझ समाधान विभाज्य, और जमे हुए दुकान फ़िल्टर.
  2. Milli क्यू एच 2 ओ में 1 मिमी समाधान बनाने के द्वारा tetrodotoxin (TTX) के एक 1000x शेयर की तैयारी TTX के Aliquots -20 डिग्री सेल्सियस पर भंडारित किया जा सकता है
  3. Milli क्यू पानी में 100 मिमी (7.5 पीएच) Tris, 5 मिमी ना 2 4 HPO, 4 मिमी के.एच. 2 4 पीओ, 40 मिमी NaHCO 3, और 800 मिमी NaCl समाधान बनाने के द्वारा 10x उत्तेजना बफर तैयार . शेयर 4 में संग्रहीत किया जा सकता डिग्री सेल्सियस
  4. पूर्व शांत 4 से सी. ° centrifuges
  5. Milli क्यू पानी में 2.5 एम sucrose (2 एमएल) का 1 मात्रा Percoll (18 एमएल) के 9 खंडों को जोड़कर Isosmotic Percoll (एसआईपी) के एक शेयर के समाधान तैयार है और मिश्रण अच्छी तरह से.
  6. जीएम बफर घूंट के संबंधित मात्रा जोड़ने और प्रत्येक मिश्रण 3, 10, 15, और 23% ढाल परतों तैयार:

0 टेबल

  1. Beckman अपकेंद्रित्र ट्यूबों में एक P1000 Gilson Pipetman का उपयोग टोपी के साथ 2 मिलीलीटर 23, 15, 10, प्रत्येक, और 3% isosmotic Percoll समाधान pipetting द्वारा ढाल परतों डालो. परतों के बीच इंटरफेस परतों का कोई मिश्रण के साथ स्पष्ट रूप से discernable होना चाहिए. 4 ° C में प्रयोग करने से पहले कम से कम 20 मिनट के लिए gradients स्टोर. gradients के 24 घंटे तक के लिए भंडारित किया जा सकता है, हालांकि उसी दिन इस्तेमाल की सिफारिश की है. [अनुभवहीन प्रयोगशाला कर्मियों isomotic Percoll समाधान परत इंटरफेस के दृश्य के लिए नीले रंग की डाई जोड़कर तैयारी gradients अभ्यास कर सकते हैं.]

2. माउस एक विच्छेदन

  1. सुनिश्चित करें कि सभी माउस पालन और प्रक्रियाओं इच्छामृत्यु NIH और विश्वविद्यालय के दिशा निर्देशों के अनुसार में प्रदर्शन कर रहे हैं. कार्बन डाइऑक्साइड asphyxiation या एक जानवर प्रोटोकॉल में की मंजूरी दे दी विधि द्वारा पिल्ले (p13 p21 उम्र) euthanize.
  2. एक विच्छेदन बोर्ड के लिए माउस पिन और इथेनॉल के साथ गर्दन और सिर के पीछे स्प्रे. एक तेज खोपड़ी के आधार पर रीढ़ की हड्डी के माध्यम से काट कैंची का प्रयोग, खोपड़ी के ऊपर से त्वचा को हटाने के लिए, खोपड़ी, पार्श्विका हड्डी और interparietal हड्डी के बीच या मस्तिष्क प्रांतस्था और क्षेत्रों के बीच laterally कटौती. तो आधार से नाक (sagital सिवनी साथ) खोपड़ी में कटौती, ध्यान की ओर से प्रत्येक गोलार्द्ध खींच कर नरम पार्श्विका हड्डी को हटाने और एक रंग के साथ प्रांतस्था हटाने. सेरिबैलम ऊपर मस्तिष्क में लेपनी डालें और फिर बाहर प्रांतस्था स्कूप और यह ठंडा जीएम बफर में जगह. Homogenization में कदम करने के लिए तुरंत आगे बढ़ें. चलो cortices ठंडा बफर में बहुत लंबे समय के लिए बैठने के रूप में इस पर प्रतिकूल SNS के गठन को प्रभावित करेगा मत.

3. Homogenate और SNS 1-4 की तैयारी

  1. बहुत ठंडा जीएम बफर में cortices कुल्ला और एक गिलास Dounce ठंड जीएम बफर के 5 एमएल युक्त homogenizer दो cortices हस्तांतरण.
  2. धीरे ढीला मूसल के 5-10 स्ट्रोक के साथ cortices homogenized (मूसल "एक"), तंग मूसल (मूसल "बी") के 5-10 स्ट्रोक द्वारा पीछा किया. स्ट्रोक्स तेजी से लेकिन काफी धीमी गति से हवा बुलबुले के कारण नहीं होना चाहिए. Homogenization के बाद homogenate के एक चित्र 1 योजना में है. स्ट्रोक की संख्या व्यक्ति homogenizer और साथ pestles पर निर्भर अलग अलग होंगे. जब समाप्त gradients के एक मजबूत एस.एन. बैंड दे, यदि नहीं, स्ट्रोक की संख्या समायोजित करना चाहिए.
  3. एक 15 एमएल शंक्वाकार और 1000xg पर 10 मिनट के लिए अपकेंद्रित्र 4 ° सी (Allegra 6KR अपकेंद्रित्र) के एक झूलते बाल्टी रोटर में गोली सेलुलर मलबे और नाभिक homogenate स्थानांतरण. काता homogenate का एक चित्र 1 योजना में है.
  4. परत Percoll sucrose ढाल, टोपी ट्यूबों, और 4 में 5 मिनट के लिए अपकेंद्रित्र 32,500 XG पर प्रति सतह पर तैरनेवाला के 2 एमएल ° सी (Beckman अपकेंद्रित्र J2-21, रोटर जावेद-17) के एक निश्चित कोण रोटर में उचित एडाप्टर का उपयोग कर ( अभिकर्मकों और उपकरण टेबल देखें).
  5. बंद पिपेट और एस.एन. बैंड का उपयोग करते हुए एक गिलास पाश्चर विंदुक ऊपर समाधान त्यागें. 15/23% अंतरफलक पर एस.एन. बैंड बंद पिपेट, एक शंक्वाकार और बर्फ पर दुकान करने के लिए स्थानांतरण. प्रत्येक ढाल या एक प्रांतस्था एस.एन. के 0.9-1.1 एमएल उत्पादन होगा.
  6. 10x उत्तेजना बफर के एक दसवें मात्रा को जोड़कर SNS के नमक एकाग्रता समायोजित, 12 एनएम के एक अंतिम एकाग्रता 1000x 2 CaCl जोड़ने के लिए, और 1 सुक्ष्ममापी के अंतिम एकाग्रता के लिए 1 मिमी TTX शेयर जोड़ने के nonspecific उत्तेजना को दबाने. (2 CaCl के अतिरिक्त वैकल्पिक है अगर यह अनुप्रवाह एस.एन. अनुप्रयोगों के साथ हस्तक्षेप करेगा).
  7. SNS के प्रोटीन एकाग्रता माइक्रो बीसीए प्रोटीन परख किट का उपयोग कर का निर्धारण करते हैं. (ब्रैडफोर्ड प्रोटीन परख Percoll से निष्कर्ष की वजह से सिफारिश नहीं है.)
  8. SNS प्रोटीन transla के लिए सीधे और जल्दी से इस्तेमाल किया जा सकता हैtion के अध्ययन. एस.एन. lysate अन्य अनुप्रयोगों के लिए साफ हो सकता है या पियर्स नमूना एसडीएस PAGE तैयारी किट का उपयोग कर केंद्रित.

4. प्रतिनिधि परिणाम:

जब माउस प्रांतस्था homogenized और असंतत Percoll - sucrose (1 योजना) gradients, 6 बैंड या भिन्न पर अलग किया गया था (चित्रा 1) देखा गया. यह पहले चूहे के लिए प्रमस्तिष्क प्रांतस्था 3,5 दिखाया गया था कि उच्च आणविक भार बैंड के घटक झिल्ली और myelin टूट गया और pelleted सामग्री mitochondria या organelles निहित (तालिका 1). 23% / 15% इंटरफ़ेस (5 बैंड) समृद्ध SNS होता है.

23% / 15% इंटरफ़ेस बरकरार SNS युक्त, पर बैंड को हटाया था और जांच के रूप में पहले वर्णित इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी (EM) द्वारा 2,6 EM बरकरार synaptic vesicles की उपस्थिति और presynaptic और postsynaptic तत्वों के संरक्षण (चित्रा दिखाया . 2). पूर्व और postsynaptic डिब्बों के अलगाव संकेतन और प्रोटीन संश्लेषण, जो दोनों डिब्बों में होता है की जांच करने के लिए महत्वपूर्ण है 7-13 ढाल Percoll - sucrose के एक कच्चे तेल की शुद्धि है तो हम एस.एन. अंश में मामूली सेलुलर, परमाणु और organelle संदूषण देखा था, लेकिन. समग्र जुदाई अच्छा था.

जब पश्चिमी धब्बा के द्वारा जांच की, Percoll भिन्न एस.एन. बैंड (चित्रा 3, तालिका 2) में synaptic पवित्रता में वृद्धि के साथ यह उम्मीद प्रोटीन मार्कर होता है. Synaptic और neuronal मार्कर समृद्ध एस.एन. बैंड (5 बैंड) में बनाए रखा गया, लेकिन अन्य मार्करों के बहुतायत में काफी कम हो गया था. विशेष रूप में, GFAP, glial मूल के astrocyte और neoplastic कोशिकाओं के लिए एक मार्कर, और lamin-B1, परमाणु मार्कर की उपस्थिति नगण्य थे, जबकि संरचनात्मक और synaptic मार्करों रखा या बढ़ाया गया. इसके अलावा, वहाँ जैसे mitochondria और Golgi organelles, जो प्रोटीन संश्लेषण में एक भूमिका निभा के लिए मार्कर की अवधारण किया गया था.

एस.एन. बैंड के लिए विशिष्ट पैदावार μL प्रति प्रोटीन की 250-500 एनजी थे, के रूप में बीसीए प्रोटीन परख द्वारा निर्धारित है. SNS की गतिविधि डी Novo प्रोटीन संश्लेषण की राशि के द्वारा निर्धारित किया गया था [35S] - मेट निगमन (चित्रा 4) के रूप में निगरानी वर्तमान 2 बेसल translational गतिविधि 1.56 गुना बढ़ा दिया गया था जब SNS 50 सुक्ष्ममापी glutamate/10 सुक्ष्ममापी ग्लाइसिन के साथ प्रेरित किया गया (Glu) या 5.12 गुना है जब Pin1 अवरोध करनेवाला juglone के साथ सक्रिय. Pin1 निषेध करने के लिए वृद्धि की प्रोटीन संश्लेषण. 2 में परिणाम पुष्टि करते हैं कि [35S] निगमन के मौसम में वृद्धि डी Novo प्रोटीन संश्लेषण के कारण था करने के लिए जाना जाता है, हम 40 सुक्ष्ममापी anisomycin, एक प्रोटीन संश्लेषण अवरोध करनेवाला कहा, और समावेश में एक उल्लेखनीय कमी देखा जब बेसल स्तर की तुलना में उपस्थिति और ग्लू के अभाव में. इसके अलावा, 2% ट्राइटन 100 - एक्स, जो SNS की अखंडता को बाधित के अलावा पर, बेसल अनुवाद 75% से कम था 2. इसके अलावा, जब (B4 - बी -6) बैंड है कि सबसे synaptic मार्कर संवर्धन से पता चला की जांच, SNS या 5 बैंड डी Novo प्रोटीन संश्लेषण (चित्रा 5) के लिए सबसे बड़ी गतिविधि थी. इस प्रकार, असंतत Percoll sucrose gradients जल्दी से एक अत्यधिक सक्रिय और समृद्ध एस.एन. बैंड है कि प्रोटीन अनुवाद अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है उत्पादन.

असंतत ढाल Percoll - sucrose प्रक्रिया अन्य तरीकों की तुलना में अधिक लाभप्रद है क्योंकि यांत्रिक क्षति कठोर परिस्थितियों की वजह से है. जब निस्पंदन विधि है, जिसमें cortical homogenate को मंजूरी दे दी की तुलना में फिल्टर की एक श्रृंखला है कि आकार में कमी, 3,14-15 Percoll विधि अधिक से अधिक गतिविधि के साथ अधिक SNS रूपों के माध्यम से पारित कर दिया है. चित्रा 6, जब SNS निस्पंदन विधि द्वारा तैयार की एक विभाज्य एक ढाल Percoll - sucrose 15/23% इंटरफ़ेस में अब तक कम SNS और टूटी हुई झिल्ली की एक बड़ी राशि पर पारित किया गया था में देखा. जब डी Novo प्रोटीन संश्लेषण S35 - से मुलाकात समावेश के माध्यम से मापा गया था, निस्पंदन विधि द्वारा तैयार SNS तक कम सक्रिय थे (चित्रा 7 ). Translational गतिविधि को अधिकतम करने के लिए हम चूहों कि p14 उम्र और P18 के बीच का उपयोग करें. एस.एन. वयस्क चूहों से तैयार किया जा सकता है है, लेकिन हम काफी वृद्धि हुई एस.एन. साथ translational गतिविधि किशोर चूहों (8 चित्रा) से तैयार मनाया है.

तालिका 1
तालिका 1. Homogenized माउस प्रांतस्था का असंतत Percoll ढाल fractionations से बैंड के संघटक 3,5.

तालिका 2
तालिका 2. असंतत Percoll sucrose ढाल बैंड घटक के पश्चिमी बोल्ट विश्लेषण का सारांश प्रत्येक बैंड भिन्न के लिए सापेक्ष प्रोटीन सांद्रता एक असंतत Percol का उपयोग पृथकएल - sucrose ढाल पश्चिमी धब्बा के द्वारा निर्धारित किया गया है. नहीं प्रोटीन मौजूद (-), 0 0.2 ≥ (+), 0.2 0.8 ≥ (++), या> (+++) 0.8 गुना से अधिक सतह पर तैरनेवाला (एस, प्रांतस्था homogenate centrifuged), n के प्रतिनिधि मौजूद प्रोटीन = 3.

1 योजना
योजना 1: एक एस.एन. असंतत घनत्व Percoll sucrose ढाल का उपयोग कर तैयारी के योजनाबद्ध dissected माउस मस्तिष्क cortices थे, homogenized, और कम गति पर centrifuged गैर homogenized ऊतक कोशिकाओं, नाभिक और झिल्ली जैसे पूरे organelles हटायें. असंतत ढाल परतों स्पष्ट रूप से परिभाषित किया जाना चाहिए. इनसेट तस्वीर परतों, जो निदर्शी प्रयोजनों के लिए नीले रंग रंगा गया है क्रम में ही परतों कल्पना का एक उदाहरण दिखाता है. सतह पर तैरनेवाला एक असंतत ढाल Percoll - sucrose के शीर्ष पर स्तरित है और मध्यम गति पर centrifuged. एस.एन. बैंड तो ढाल से लिया गया है और का उपयोग करने के लिए तैयार है.

चित्रा 1
चित्रा 1. एक असंतत ढाल Percoll - sucrose पर Homogenate fractionation. माउस प्रांतस्था homogenized गया था और एक असंतत Percoll sucrose 6 बैंड या भिन्न को जन्म देने के ढाल पर अलग. शुद्ध, सक्रिय SNS (*) 5 बैंड में पाए गए.

चित्रा 2
चित्रा 2. एस.एन. तैयारी SNS कि presynaptic और postsynaptic तत्वों को बनाए रखने की एक विषम मिश्रण दे एक एस.एन. C57BL / 6 चूहों (p13 करने के लिए p21 उम्र) से तैयार तैयारी का एक इलेक्ट्रॉन माइक्रोग्राफ पहले से वर्णित से पता चलता है और SNS के रूप में संरक्षित presynaptic और postsynaptic तत्वों के साथ प्रदर्शन किया गया था. 2 , 6 लाल तीर बिंदु के बाद synaptic घनत्व. स्केल बार है 1 सुक्ष्ममापी.

चित्रा 3
चित्रा 3. एस.एन. तैयारी के पश्चिमी धब्बा विश्लेषण से पता चला है कि synaptic और neuronal मार्करों शुद्ध SNS में बनाए रखा गया (5 बैंड), लेकिन अन्य मार्करों के बहुतायत में काफी कम हो गया था सतह पर तैरनेवाला के Immunoblots (एस, cortical homogenate centrifuged) और असंतत के 1-6 बैंड. Percoll - sucrose ढाल (संरचनात्मक, नियंत्रण लोड हो रहा है) β actin, GFAP (astrocytic), GP73 (Golgi), HSC70 (cytoplasmic और परमाणु), lamin-B1 (परमाणु), Prohibitin (mitochondrial), PSD95 के लिए जांच (postsynaptic घनत्व थे ), SNAP25 (synaptic), (synaptic) synaptophysin और ट्यूबिलिन β3 (न्यूरॉन विशिष्ट). बैंड एक तूफान 860 Phosphorimager का उपयोग कल्पना थे, n = 3 के प्रतिनिधि.

चित्रा 4
चित्रा 4. SNS सक्रिय हैं और डी Novo [35S] निगमन के मौसम के माध्यम से प्रोटीन संश्लेषण प्रदर्शन SNS 37 डिग्री सेल्सियस 10 मिनट के लिए पूर्व equilibrated थे. . फिर SNS अनुपचारित या 40 सुक्ष्ममापी anisomycin या 37 में 1 सुक्ष्ममापी juglone के साथ 15 मिनट के लिए pretreated थे डिग्री सेल्सियस [35S] के अलावा द्वारा पीछा मौसम, 20 μl एक्सप्रेस प्रो लेबल S35 आसान टैग मिक्स, प्लस या ऋण 37 पर ग्लू डिग्री सेल्सियस 30 मिनट के लिए. नमूने पियर्स नमूना एसडीएस PAGE तैयारी किट का उपयोग कर तैयार थे, एक 15% polyacrylamide जेल पर चलने, सूखे और एक आण्विक डायनेमिक्स तूफान 860 phosphorimager, n = 3 के प्रतिनिधि, ± SEM का उपयोग quantitated.

चित्रा 5
चित्रा 5. असंतत ढाल Percoll - sucrose से 5 बैंड डी Novo प्रोटीन संश्लेषण के उच्चतम स्तर होता है. बैंड 4, 5 और 6 और सतह पर तैरनेवाला (एस, cortical homogenate centrifuged) 37 पूर्व equilibrated थे ° C 10 मिनट के लिए. फिर, [35S] - मेट, एक्सप्रेस प्रो लेबल मिक्स S35 आसान टैग जोड़ा था, प्लस या ऋण 37 पर ग्लू ° सी 30 मिनट के लिए. नमूने पियर्स नमूना एसडीएस PAGE तैयारी किट का उपयोग कर तैयार थे, एक 15% polyacrylamide जेल पर चलने, सूखे और एक आण्विक डायनेमिक्स तूफान 860 phosphorimager, n = 3 के प्रतिनिधि, ± SEM का उपयोग quantitated.

चित्रा 6
चित्रा 6. एक निस्पंदन विधि से तैयार SNS असंतत ढाल Percoll - sucrose विधि से तैयार SNS से अधिक टूट झिल्ली और कम पूरे SNS होते हैं. SNS homogenized प्रांतस्था ध्यान में लीन होना आकार कम के रूप में पहले वर्णित के साथ फिल्टर की एक श्रृंखला के माध्यम से गुजर द्वारा तैयार किए गए 3,14-15 SNS निस्पंदन विधि द्वारा तैयार की एक विभाज्य एक असंतत ढाल Percoll - sucrose पर centrifuged किया गया था और एक बराबर राशि की तुलना में. असंतत ढाल Percoll - sucrose विधि का उपयोग कर सामग्री की.

7 चित्रा
7 चित्रा. एक निस्पंदन विधि से तैयार SNS कम डी Novo प्रोटीन संश्लेषण की गतिविधि से SNS fro तैयार होते हैंमीटर असंतत ढाल विधि Percoll - sucrose. SNS homogenized प्रांतस्था घटते रोमकूप आकार के साथ फिल्टर के रूप में पहले वर्णित, 3,14-15 की एक श्रृंखला के माध्यम से पारित करके और असंतत Percoll sucrose ढाल तरीकों द्वारा तैयार किए गए. दोनों की तैयारी से SNS 37 पूर्व equilibrated थे ° C 10 मिनट के लिए. फिर, [35S] - मेट, एक्सप्रेस प्रो लेबल मिक्स S35 आसान टैग जोड़ा था, प्लस या ऋण 37 पर ग्लू ° सी 30 मिनट के लिए. नमूने पियर्स नमूना एसडीएस PAGE तैयारी किट का उपयोग कर तैयार थे, एक 15% polyacrylamide जेल पर चलने, सूखे और एक आण्विक डायनेमिक्स तूफान 860 phosphorimager, n = 3 के प्रतिनिधि, ± SEM का उपयोग quantitated.

8 चित्रा
8 चित्रा. SNS युवा चूहों (p14) से अधिक से अधिक बड़े चूहों (P85) की तुलना में translational गतिविधि SNS विभिन्न आयु वर्ग के 10 मिनट के लिए असंतत Percoll - sucrose ढाल विधि 37 पर preequilibrated ° सी का उपयोग कर चूहों से तैयार थे, इलाज या अनुपचारित Glu के साथ. [35S] की उपस्थिति-मेट (एक्सप्रेस प्रो लेबल S35 आसान टैग मिक्स) 30 मिनट के लिए तस्वीर, स्थिर, और बाद में पियर्स एसडीएस पृष्ठ नमूना तैयारी किट के साथ साफ. SNS तो एक 12% एसडीएस - polyacrylamide जेल पर चलाए जा रहे थे, सूखे और एक आण्विक डायनेमिक्स तूफान n = 3, ± SEM 860 phosphorimager प्रतिनिधि, पर imaged. P14 चूहों से SNS कम से कम 3 गुना अधिक सक्रिय P85 चूहों की तुलना में थे.

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Discussion

असंतत ढाल Percoll sucrose के साथ साथ वर्णित तैयारी एक त्वरित, विश्वसनीय विधि सक्रिय SNS, जो synaptic प्रसारण प्रयोगों की एक किस्म में इस्तेमाल किया जा सकता है अलग है. इस ढाल विधि है, जो Dunkley एट अल. 3,4 द्वारा विकसित की पद्धति पर आधारित है एक subcellular मस्तिष्क fractionation प्रक्रिया है कि दोनों पूर्व और postsynaptic झिल्ली व्युत्पन्न vesicles कि एक दूसरे के साथ जुड़े रहे हैं आइसोलेट्स है. आगे की शुद्धि के बिना इन SNS immunoprecipitation, पश्चिमी सोख्ता, प्रवाह cytometry, निगरानी डी Novo प्रोटीन [35S] के माध्यम से मौसम निगमन, इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी, और एंजाइम गतिविधि assays की एक किस्म सहित isomerase संश्लेषण और सहित आण्विक जीव विज्ञान तकनीक, की एक किस्म के साथ संगत कर रहे हैं kinase गतिविधि assays.

असंतत ढाल Percoll - sucrose प्रक्रिया अपेक्षाकृत सीधे आगे है, तथापि, यह 4 बजे समाधान और मस्तिष्क सामग्री रखने की कुंजी है ° तैयारी भर में पूर्व सर्द gradients के लिए सी. हालांकि homogenate हर समय ठंडा रखा है proteolysis कम से कम, अधिक से अधिक गतिविधि के साथ बेहतर पैदावार के लिए यह सबसे अच्छा है के लिए नहीं होने cortices जीएम बफर में बर्फ पर भी लंबे समय homogenization पहले बैठ. SNS के गठन सबसे अच्छा है जब cortices rinsed और फिर शीघ्र homogenized. homogenate, तथापि, प्रतिकूल प्रभावित करता है बिना प्रारंभिक centrifugation पहले बर्फ पर रखा जा सकता है. गति एक मुद्दा है एक बार cortices काटा गया है, तो जितनी जल्दी संभव हो SNS के अलगाव पूरा किया जाना चाहिए. हालांकि SNS 1-2 घंटे के लिए उच्च गतिविधि को बनाए रखने कर सकते हैं, कदम के बीच समय की लंबी अवधि कम गतिविधि में परिणाम देगा. एस.एन. तैयारी के लिए इस्तेमाल किया चूहों की उम्र भी एक प्रमुख मुद्दा है. यह पहले दिखाया गया है कि वहाँ कृन्तकों में एक उम्र synaptic plasticity में संबंधित गिरावट 16-19 हम SNS में एक ही प्रभाव देखा है है. हालांकि बड़े चूहों translationally सक्रिय SNS बनाने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है, हमने पाया कि युवा चूहों (p14) अधिक से अधिक translational गतिविधि तो बड़े चूहों (P85).

वहाँ निस्पंदन के कई रूपों और संयोजन, 5,14-15,20-23 centrifugation, 24-27 और ढाल 26-29 तरीकों कि SNS तैयार करने के लिए इस्तेमाल किया गया है और प्रत्येक अपने स्वयं के फायदे और नुकसान है. निस्पंदन और centrifugation तरीकों SNS के लिए यांत्रिक क्षति पैदा कर सकता है. तरीकों कि विभिन्न ताकना आकार फिल्टर का उपयोग किया है टूटी हुई झिल्ली का एक बड़ा प्रतिशत में हुई और काफी कम SNS उपज. हम फिल्टर विधि, 5,14-15 जो घटते रोमकूप आकार के साथ फिल्टर की एक श्रृंखला के माध्यम से homogenate गुजरता है की कोशिश की और पाया कि निस्पंदन विधि द्वारा तैयार SNS काफी कम सक्रिय थे. centrifugation तरीकों में भी उच्च गति ट्यूबों के नीचे गोली या कॉम्पैक्ट SNS और जो resuspension की आवश्यकता पर लंबे समय तक spins के कारण यांत्रिक क्षति में परिणाम. Percoll मामूली शर्तों है कि या फ़िल्टरिंग से बचने के SNS, जो कुचलने या SNS lyse कर सकते हैं pelleting को रोजगार. एस.एन. प्रक्रियाओं है कि 28,30-32 Ficoll या भी क्षतिग्रस्त या कम सक्रिय SNS में 4,31 परिणाम sucrose के उच्च molarities का उपयोग, बिगड़ा जैविक समारोह और morphological परिवर्तन 31-32 Ficoll शारीरिक पीएच पर अवांछित सेल एकत्रीकरण के कारण और आसमाटिक gradients देता कर सकते हैं 4 बढ़ती सांद्रता के साथ 31-32 के लिए isoosmotic शर्तों रखना, gradients के लिए एक नमक ढाल के साथ मुआवजा हो 31 SNS sucrose के उच्च सांद्रता (1.4-0.8 एम) छोटे और कम सक्रिय SNS में परिणाम के साथ तैयार है.

असंतत विधि Percoll - sucrose के अन्य medias और centrifugation प्रक्रियाओं के साथ जुड़े मुद्दों के कई पर काबू. इस विधि का एक प्रमुख लाभ Percoll, जो एक कम दलदलापन, कम osmolarity और अपेक्षाकृत कोशिकाओं और उनके घटक की दिशा में कोई विषाक्तता है का उपयोग है, इस तरह इसे और बेहतर विकल्पों की तुलना में घनत्व ढाल प्रयोगों के लिए अनुकूल बनाने 4,29 इसके अलावा, Percoll कर सकते हैं. sucrose के साथ तैयार है को बनाए रखने के लिए osmolarity एस.एन. अखंडता बनाए रखने की जरूरत है 4 असंतत Percoll sucrose gradients का उपयोग centrifugation समय 30-45 मिनट से 5 मिनट से कम कर देता है, इस प्रकार SNS का उपयोगी जीवन काल है , जो गतिविधि के लिए एक सीमित जीवनकाल का विस्तार . Percoll gradients का एक अन्य लाभ और SNS की उच्च उपज गतिविधि है जब तरीकों कि फिल्टर SNS फार्म का उपयोग करने की तुलना में. हम Percoll - sucrose एक ढाल पर फिल्टर विधि से SNS भागा. हम मुश्किल से discernable एस.एन. बैंड और ढाल पर उच्च आणविक भार टूटी हुई झिल्ली के एक बहुतायत में पाया गया. इसके अलावा, Percoll विधि द्वारा तैयार SNS translational गतिविधि फिल्टर विधि के साथ तुलना में काफी अधिक था. कुल मिलाकर, Percoll अन्य तरीकों के लिए बेहतर है क्योंकि यह मामूली शर्तों है कि फ़िल्टरिंग और pelleting SNS resultin से बचने को रोजगारsynaptic गतिविधि की अधिक से अधिक प्रतिधारण और बेहतर पुटिका गठन में जी. Dunkley, एट अल, 3,4 पर हमारे विधि का लाभ यह है कि एक गिलास, कांच Dounce homogenizer इस के साथ साथ के रूप में मोटर चालित Teflon, कांच homogenizer विरोध में इस्तेमाल किया गया था कि क्षति के सबसे postsynaptic टर्मिनल संलग्नक postsynaptic तत्वों और सुराग को उजागर किया जा रहा है मीडिया और बहुत कुछ बरकरार झिल्ली द्वारा संलग्न किया जा रहा है.

महत्वपूर्ण कार्य के बाद synaptic घनत्व 11-13 में प्रोटीन संश्लेषण पर ध्यान केंद्रित किया है, लेकिन थोड़ा काम करने के लिए presynaptic डिब्बों में प्रोटीन संश्लेषण का अध्ययन किया गया है . हालांकि, वहाँ सबूत है कि प्रोटीन संश्लेषण presynaptic टर्मिनलों में होता है 7-10 SNS के इलेक्ट्रॉन माइक्रोग्राफ, पूर्व और postsynaptic संलग्नक के रूप में देखा जा सकता है है एस.एन. तैयारी में मौजूद है उन्हें translational गतिविधि के भविष्य के अध्ययन के लिए एक आदर्श व्यवस्था बनाने दोनों डिब्बों में.

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Disclosures

ब्याज की कोई संघर्ष की घोषणा की.

Acknowledgments

हम इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी के लिए मैडिसन विस्कॉन्सिन इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोप सुविधा विश्वविद्यालय से बीके अगस्त को धन्यवाद देना चाहूंगा. इस काम एनआईएच R01-DA026067 और p30-HD03352 (JSM के लिए) अनुदान द्वारा समर्थित किया गया.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Name of the reagent Company Catalogue number Comments (optional)
Micro BCA Protein Assay Kit Pierce 23235  
CaCl2 Fisher C79-500  
CO2 gas Airgas (UW-MDS) CD 50  
EDTA RPI E57020  
EtOH Fisher A407SK-4  
HCl Fisher A142-212  
Percoll GE Healthcare 17-0891-01  
KH2PO4 Fisher P285-500  
PierceSDS-PAGE Sample Prep Kit Pierce 89888  
NaCl RPI S23020  
NaHCO3 Fisher BP328-500  
Na2PHO4 Fisher S381-500  
Sucrose RPI S24060  
Tris Base RPI T60040  
Tetrodotoxin Sigma T5651  
Express Pro Label Mix S35 Easy Tag Perkin Elmer NEG772  
       
Equipment Company Catalogue number Comments (optional)
Dissection tools      
Dounce homogenizer, 7 mL (comes with two glass pestles labled " A" and "B") Wheaton    
P1000 Gilson Pipetman Gilson F123602  
Allegra 6KR Centrifuge Beckman Coulter 366830  
GH 3.8 Rotor, Swinging bucket rotor Beckman Coulter 360581  
Beckman J2-21 Centrifuge Beckman    
Beckman tubes with caps Beckman 355672  
White walled adapters Beckman 342327  
Blue walled adapters Beckman    
JA-17 Rotor, Fixed-angle rotor Beckman 369691  

Table of antibodies used for western blots:
Name of Antibody Company Catalogue number Host Species
β-Actin Sigma A5441 mouse
GFAP Santa Cruz sc-65343 mouse
GP73 Santa Cruz Sc-134509 rabbit
HSC70 Santa Cruz sc-7298 mouse
Laminβ Santa Cruz Sc-6261 goat
Prohibitin Santa Cruz sc-28259 rabbit
PSD95 Millipore MAB1596 mouse
SNAP25 AbCam ab5666-100 rabbit
Synaptophysin Millipore MAB368 mouse
β-3-Tubulin Santa Cruz sc-80016 mouse

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References

  1. Westmark, C. J., Malter, J. S. FMRP mediates mGluR5-dependent translation of amyloid precursor protein. PLoS Biol. 5, e52-e52 (2007).
  2. Westmark, P. R., Westmark, C. J., Wang, S., Levenson, J., O'Riordan, K. J., Burger, C., Malter, J. S. Pin1 and PKMzeta sequentially control dendritic protein synthesis. Sci Signal. 3, ra18-ra18 (2010).
  3. Dunkley, P. R., Heath, J. W., Harrison, S. M., Jarvie, P. E., Glenfield, P. J., Rostas, J. A. A rapid Percoll gradient procedure for isolation of synaptosomes directly from an S1 fraction: Homogeneity and morphology of subcellular fractions. Brain Res. 441, 59-71 (1988).
  4. Dunkley, P. R., Jarvie, P. E., Robinson, P. J. A rapid Percoll gradient procedure for preparation of synaptosomes. Nat. Protoc. 3, 1718-1728 (2008).
  5. Hollingsworth, E. B., McNeal, E. T., Burton, J. L., Williams, R. J., Daly, J. W., Creveling, C. R. Biochemical characterization of a filtered synaptoneurosome preparation from guinea pig cerebral cortex: cyclic adenosine 3':5'-monophosphate-generating systems, receptors, and enzymes. J. Neurosci. 5, 2240-2253 (1985).
  6. Yi, H., Leunissen, J., Shi, G., Gutekunst, C., Hersch, S. A novel procedure for pre-embedding double immunogold-silver labeling at the ultrastructural level. J. Histochem. Cytochem. 49, 279-284 (2001).
  7. Akins, M. R., Berk-Rauch, H. E., Fallon, J. R. Presynaptic translation: stepping out of the postsynaptic shadow. Front. Neural Circuits. 3, (2009).
  8. Jin, I., Kandel, E. R., Hawkins, R. D. Whereas short-term facilitation is presynaptic, intermediate-term facilitation involves both presynaptic and postsynaptic protein kinases and protein synthesis. Learn. Mem. 18, 96-102 (2011).
  9. Lyles, V., Zhao, Y., Martin, K. C. Synapse formation and mRNA localization in cultured Aplysia neurons. Neuron. 49, 349-356 (2006).
  10. Wagatsuma, A., Azami, S., Sakura, M., Hatakeyama, D., Aonuma, H., Ito, E. De Novo synthesis of CREB in a presynaptic neuron is required for synaptic enhancement involved in memory consolidation. J. Neurosci. Res. 84, 954-9560 (2006).
  11. Sutton, M. A., Schuman, E. M. Local translational control in dendrites and its role in long-term synaptic plasticity. J. Neurobiol. 64, 116-131 (2005).
  12. Li, K. -W., Hornshaw, M. P., Van der Schors, R. C., Watson, R., Tate, S., Casetta, B., Jimenez, C. R. Proteomics analysis of rat brain postsynaptic density: implications of the diverse protein functional groups for the integration of synaptic physiology. J. Biol. Chem. 279, 987-1002 (2004).
  13. Peng, J., Kim, M. J., Cheng, D., Duong, D. M., Gygi, S. P., Sheng, M. Semi-quantitative proteomic analysis of rat forebrain postsynaptic density fractions by mass spectrometry. J. Biol. Chem. 279, 21003-21011 (2004).
  14. Kim, S. H., Fraser, P. E., Westaway, D., St. George-Hyslop, P. H. Group II metabotropic glutamate receptor stimulation triggers production and release of Alzheimer's amyloid β42 from isolated intact nerve terminals. J. Neurosci. 30, 3870-3875 (2010).
  15. Weiler, I. J., Greenough, W. T. Potassium ion stimulation triggers protein translation in synaptoneurosomal poiyribosomes. Mol. Cell. Neurosci. 2, 305-314 (1993).
  16. Billard, J. M. Ageing, hippocampal synaptic activity and magnesium. Magnes Res. 19, 199-215 (2006).
  17. Murphy, G. G., Fedorov, N. B., Giese, K. P., Ohno, M., Friedman, E., Chen, R., Silva, A. J. Increased neuronal excitability, synaptic plasticity, and learning in aged Kvbeta1.1 knockout mice. Curr. Biol. 14, 1907-1915 (2004).
  18. Norris, C. M., Halpain, S., Foster, T. C. Reversal of Age-Related Alterations in Synaptic Plasticity by Blockade of L-Type Ca21 Channels. J. Neurosci. 18, 3171-3179 (1998).
  19. Sallert, M., Malkki, H., Segersträlea, M., Tairaa, T., Lauri, S. E. Effects of the kainate receptor agonist ATPA on glutamatergic synaptic transmission and plasticity during early postnatal development. Neuropharm. 52, 1354-1365 (2007).
  20. Quinlan, E. M., Philpot, B. D., Huganir, R. L., Bear, M. F. Rapid, experience-dependent expression of synaptic NMDA receptors in visual cortex in vivo. Nat. Neurosci. 2, 357-35 (1999).
  21. Scheetz, A. J., Nairn, A. C., Constantine-Patton, M. NMDA receptor-mediated control of proteins synthesis at developing synapses. Nat. Neurosci. 3, 211-216 (2000).
  22. Villasana, L. E., Klann, E., Tejada-Simon, M. V. Rapid isolation of synaptoneurosomes and postsynaptic densities from adult mouse hippocampus. J. Neurosci. Methods. 158, 30-36 (2006).
  23. Weiler, I. J., Greenough, W. T. Metabotropic glutamate receptors trigger postsynaptic protein synthesis. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 90, 7168-7171 (1993).
  24. Gray, E. G., Whittaker, V. P. The isolation of nerve endings from brain: An electron microscopic study of cell fragments derived by homogenization and centrifugation. J. Anat. 96, 79-88 (1962).
  25. Gylys, K. H., Fein, J. A., Yang, F., Cole, G. M. Enrichment of Presynaptic and Postsynaptic Markers by Size-Based Gating Analysis of Synaptosome Preparations From Rat and Human Cortex. Cytometry A. 60, 90-96 (2004).
  26. Hajós, F. An improved method for the preparation of synaptosomal fractions in high purity. Brain Res. 93, 485-489 (1975).
  27. Bai, F., Witzmann, F. A. Synaptosome Proteomics. Subcell. Biochem. 43, 77-98 (2007).
  28. Rao, A., Steward, O. Evidence that protein constituents of postsynaptic membrane specializations are locally synthesized: analysis of proteins synthesized within synaptosomes. J Neurosci. 11, 2881-2895 (1991).
  29. Pertoft, H., Laurent, T. C. Isopycnic separation of cells and cell organelles by centrifugation and modified colloidal silica gradients. Methods of Cell Separation. Catsimpoolas, N. , Plenum Press. New York. 25-65 (1977).
  30. Ramarao, C. S., Acharya, S. R., Krishnan, K. S., Kenkare, U. W. High affinity uptake of L-glutamate and γ-aminobutyric acid in Drosophila melanogaster. J. Biosci. 11, 119-135 (1987).
  31. Munteanu, L. S., Dinu, A. Fractionation of granulocytes from whole human blood by centrifugation. Practical hints. Romanian J. Biophys. 14, 53-58 (2004).
  32. Cell separation composition, kit and method. US patent. Vlasselaer, P., Van Palathumpat, V. , 019713 (1997).

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तंत्रिका विज्ञान 55 अंक synaptoneurosomes synaptosomes Percoll - sucrose gradients न्यूरॉन्स synapse प्रांतस्था माउस
माउस प्रांतस्था से Synaptoneurosomes असंतत घनत्व Percoll Sucrose ढाल का उपयोग कर की तैयारी
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Westmark, P. R., Westmark, C. J., Jeevananthan, A., Malter, J. S. Preparation of Synaptoneurosomes from Mouse Cortex using a Discontinuous Percoll-Sucrose Density Gradient. J. Vis. Exp. (55), e3196, doi:10.3791/3196 (2011).

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