Summary
Метод подготовить трансляционно активных, неповрежденные synaptoneurosomes (SNS) из коры головного мозга мыши описано. Метод использует разрывные Перколла-сахарозы градиента плотности позволяет быстрого приготовления активных СН.
Abstract
Synaptoneurosomes (SNS) получаются после гомогенизации и фракционирования коры мозга мыши. Они закрыты пузырьки или изолированных клемм, что оторваться от аксонов терминалов при корковой ткани гомогенизируют. СН сохранить пре-и постсинаптического характеристиками, что делает их полезными при изучении синаптической передачи. Они сохраняют молекулярные машины, используемые в нейронных сигналов и способны поглощать, хранение и высвобождение нейротрансмиттеров.
Производство и изоляции активных СН может быть проблематичным использование СМИ как Ficoll, которые могут быть цитотоксические и требуют более широкого центрифугирования из-за высокой плотности и фильтрации и центрифугирования методы, которые могут привести к низкой активности из-за механических повреждений СН. Тем не менее, использование разрывных Перколла-сахарозы градиенты плотности, чтобы изолировать СН обеспечивает быстрый метод получения хороших урожаев трансляционно-активных СН. Перколла-градиенте сахарозы метод быстр и нежные, как она использует изотонический условиях, имеет все меньше и короче спины центрифугирования и избегает шагов, которые центрифугирования гранулы СН и вызвать механические повреждения.
Protocol
1. Подготовка 1-4
- Подготовка 500 мл градиент среды (GM) буфера путем смешивания 50 мл 2,5 М раствора сахарозы, 2,5 мл 1М Трис-HCl, pH7.5 акций, и 0,1 мл 0,5 М ЭДТА, рН 8,0 акции с милли- Q водой до полного объема. Фильтры стерилизовать решение, аликвоты и хранить замороженные.
- Подготовка 1000x запас тетродотоксин (TTX), сделав 1 мМ раствора в милли-Q H 2 O. Аликвоты ТТХ могут храниться при температуре -20 ° C.
- Подготовка 10x Буфер Стимуляция делая растворе 100 мМ трис (рН 7,5), 5 мМ Na 2 HPO 4, 4 мМ KH 2 PO 4, 40 мМ NaHCO 3, и 800 мМ NaCl в милли-Q воды. Склада, может храниться при 4 ° C.
- Предварительное охлаждение центрифуг до 4 ° C.
- Подготовка исходного раствора Isosmotic Перколла (SIP), добавив 9 томов Перколла (18 мл) до 1 объемом 2,5 М сахарозы (2 мл) в милли-Q воды и хорошо перемешать.
- Подготовка 3, 10, 15 и 23% слоев градиент путем добавления соответствующего количества SIP для GM буфера и смешивания каждого из них:
- Залейте градиентом слоев с помощью пипетки 2 мл каждая из 23, 15, 10, 3% isosmotic решения Перколла в трубы центрифуги Beckman с колпачками использованием P1000 Gilson Pipetman. Интерфейс между слоями должны быть четко заметной без перемешивания слоев. Магазин градиентов при 4 ° С в течение по крайней мере 20 минут перед использованием. Градиенты могут храниться до 24 часов, хотя тот же день использования рекомендуется. [Неопытные сотрудники лаборатории могут практиковать подготовку градиенты, добавив синего красителя к isomotic решения Перколла для визуализации границ раздела слоев.]
2. Мышь рассечение 1
- Убедитесь, что все хозяйства мыши и эвтаназии процедуры выполняются в соответствии с НИЗ и Университета руководящих принципов. Эвтаназии щенков (возраст P13 на P21) углекислым газом удушья или метод одобрил в животном протокола.
- Pin мыши рассечение борту и брызг задней части шеи и головы с этанолом. Использование острыми ножницами прорезать спинного мозга в основании черепа, удалить кожу от верхней части черепа, разрезать череп с боков между теменной кости и кости межтеменной или между головного мозга и коры регионах. Затем вырежьте череп от основания к носу (вдоль сагиттальной шва), осторожно снимите мягкой теменной кости, потянув каждого полушария в сторону и снять кору с помощью шпателя. Вставьте шпатель в мозг выше мозжечка, а затем выкопайте коры и поместить его в ледяной буфера GM. Немедленно приступить к гомогенизации шаг. Не позволяйте коры сидеть в ледяной буфера очень долго, так как это отрицательно влияет на формирование СН.
3. Подготовка гомогената и СН 1-4
- Промыть коры в ледяной буфера GM и передача два коры на стакан Dounce гомогенизатор, содержащий 5 мл холодного буфера GM.
- Аккуратно гомогенизированный коры с 5-10 ударов свободные пестика (пестик ""), а затем на 5-10 ударов плотно пестиком (пестик "B"). Удары должны быть быстрыми, но достаточно медленно, чтобы не наносить воздушные пузыри. Картина гомогената после гомогенизации в схеме 1. Количество ударов будет варьироваться в зависимости от индивидуальных гомогенизатор и сопровождающих пестики. По окончании градиенты должны дать сильную полосу С.Н., если нет, регулировать количество ударов.
- Передача гомогената на 15 мл конические и центрифуге при 1000xg в течение 10 мин при 4 ° С в роторе размахивая ведром (Allegra 6KR центрифуги) в гранулах распада клеток и ядер. Изображение выделяемых гомогенат на схеме 1.
- Layer 2 мл супернатанта в Перколла-градиенте сахарозы, крышка трубы, и центрифуге при 32500 мкг в течение 5 мин при 4 ° С фиксированным углом ротора (Beckman J2-21 центрифуг, JA-17 ротор) с помощью соответствующих адаптеров ( Смотрите Реактивы и оборудование таблицу).
- Внесите выходные и отбросить решение выше группы С. Н. использованием стеклянной пипетки Пастера. Внесите от группы С. Н. на 15/23% интерфейсом, перевод на конической и хранить на льду. Каждый градиент или один коры будет производить 0,9-1,1 мл SN.
- Отрегулируйте концентрации солей СН, добавив одну десятую объема буфера 10x стимуляции, добавить 1000x CaCl 2 до конечной концентрации 12 нМ, и добавьте 1 мМ ТТХ акции конечной концентрации 1 мкМ для подавления неспецифической возбуждения. (Добавление CaCl 2 не является обязательным, если он будет мешать течению приложений SN).
- Определение концентрации белка СН использованием белка Micro BCA Пробирной Kit. (Анализ Брэдфорд белок не рекомендуется из-за вывода из Перколла.)
- СН может быть использован непосредственно и быстро для белка трансляцииТион исследований. Для других приложений SN лизат может быть очищен или концентрированный использованием Пирс SDS-PAGE Пример Prep Kit.
4. Представитель результаты:
Когда мышь коры гомогенизировали и разделены на разрывной Перколла-сахарозы градиенты (Схема 1), 6 полос или фракции видели (рис. 1). Ранее было показано, для коры головного мозга крыс 3,5, что компоненты с высоким молекулярным весом полосы были сломаны мембраны и миелин и гранулированный материал, содержащийся или органеллы митохондрии (табл. 1). 23% / 15% интерфейс (группа 5), содержащиеся обогащенного СН.
Полоса 23% / 15% интерфейса, содержащего нетронутыми СН, был снят и исследовали с помощью электронной микроскопии (ЭМ), как описано выше. 2,6 EM показали наличие интактных синаптических пузырьков и сохранение пресинаптических и постсинаптических элементов (рис. 2). Выделение пре-и постсинаптического отсеков имеет важное значение для изучения сигнализации и синтез белка, который происходит в обоих отсеках. 7-13 Перколла-сахарозы градиент сырой очистки, чтобы мы увидели незначительных клеточном, ядерной и органелл загрязнения во фракции, но С. Н. общее разделение было хорошо.
Когда рассматривается пятно Западной, Перколла фракций, содержащихся ожидается маркеров белков с увеличением синаптических чистоты в группе С. Н. (рис. 3, таблица 2). Synaptic и нейронных маркеров были сохранены в группе обогащенного SN (группа 5), но обилие других маркеров была значительно уменьшена. В частности, наличие GFAP, маркером астроцитов и опухолевые клетки глии происхождения, а Ламин-B1, ядерных маркеров, были незначительны, в то время структурные и синаптических маркеров были сохранены и усилены. Кроме того, было сохранение маркеров для органелл, таких, как митохондрии и Гольджи, которые играют роль в синтезе белка.
Типичные дает для группы С. Н. были 250-500 нг белка на мкл, как это определено анализа белка ДСС. Деятельность СН определяли количество де синтез белка заново представить как контролируется [35С]-Met регистрации (рис. 4). 2 Базальные переводческой деятельности был увеличен 1,56 раз, когда СН были стимулированы с 50 мкМ glutamate/10 мкМ глицин (Glu), или 5,12 раза при активации с юглон ингибитор Pin1. Pin1 торможение, как известно, приводит к увеличению синтеза белка. 2 Чтобы подтвердить, что увеличение [35С]-Met включение было связано с де-синтез белка заново, мы добавили 40 мкМ anisomycin, ингибиторов синтеза белка, и увидел заметное снижение включения в присутствии и отсутствии Glu по сравнению с базальной уровнях. Кроме того, при добавлении 2% Triton-X 100, что нарушает целостность СН, базальных перевод был снижен на 75%. 2 Кроме того, при рассмотрении полос (В4-В6), которые показали самые синаптические маркер обогащения, СН или группы 5, наибольшую активность для вновь синтез белка (рис. 5). Таким образом, разрывные Перколла-сахарозы градиенты быстро создавать высокую активность и обогатил С. Н. группа, которая может быть использована для изучения трансляции белка.
Разрывных Перколла-градиенте сахарозы процедура является более выгодным, чем другие методы, поскольку механические повреждения вызвано более жесткими условиями. По сравнению с методом фильтрации, в котором очищается корковых гомогената пропускается через серию фильтров, которые уменьшаются в размерах, 3,14-15 Перколла метод формы более СН с большей активностью. Как видно на рисунке 6, когда аликвоту СН подготовленный метод фильтрации был передан Перколла-градиенте сахарозы Существуют гораздо менее СН на 15/23%, а интерфейс большее количество сломанной мембран. Когда заново синтез белка была измерена с помощью S35-мет регистрации, СН подготовленный метод фильтрации были гораздо менее активны (рис. 7). Чтобы максимально переводческой деятельности мы используем мышей, которые в возрасте между P14 и P18. С. Н. могут быть получены из взрослых мышей, но мы наблюдали значительно увеличили переводческой деятельностью с С. Н. приготовленный из несовершеннолетних мышей (рис. 8).
Таблица 1. Составляющие группы из разрывных Перколла градиента фракционирования гомогенизированных коры мыши. 3,5
Таблица 2. Резюме Западной анализ разрывных болтов Перколла-сахарозы трехсторонние градиент группы. Относительная концентрация белка для каждой группы фракций выделяли с помощью разрывных Percolл-градиенте сахарозы были определены иммуноблоттинга. Нет белок присутствует (-), 0 ≥ 0.2 (+), 0,2 ≥ 0,8 (++), или> 0,8 (+++) раза больше, чем белки присутствуют в супернатант (S, центрифугируют гомогенат коры), представитель п = 3.
Схема 1: Схема подготовки SN использовании разрывных Перколла-сахарозы градиента плотности коре мозга мышей были вскрыты, гомогенизировали и центрифугировали при низкой скорости, чтобы удалить без гомогенизированной ткани, клетки, целые органеллы, такие как ядра и оболочки.. Разрывным градиентом должна иметь четко определенные слои. Вставке показана картина пример слоев, которые были окрашенных синим только для иллюстрации того, чтобы визуализировать слои. Супернатант слой поверх разрывных Перколла-градиенте сахарозы и центрифугировали при средней скорости. Группа С. Н. затем извлекается из градиента и готов к использованию.
Рисунок 1. Гомогената фракционирования на разрывной Перколла-градиенте сахарозы. Мышь коры гомогенизировали и разделены на разрывной Перколла-градиенте сахарозы что приводит к 6 полос или фракции. Очищенной, активная СН (*) были обнаружены в группе 5.
Рисунок 2. С. Н. подготовку дают разнородных СН, которые сохраняют пресинаптических и постсинаптических элементов. Электронная микрофотография подготовки SN приготовленный из C57BL / 6 мышей (возраст P13 на P21) проводили, как описано выше и показывает СН с сохраненной пресинаптические и постсинаптические элементы 2. , 6 Красная точка стрелки постсинаптической плотности. Шкала бар 1 мкм.
Рисунок 3. Западные анализы пятно препаратов С. Н. показал, что синаптические и нейронных маркеры сохраняются в очищенной СН (Band 5), но обилие других маркеров была значительно уменьшена. Иммуноблотов супернатанта (S, центрифугируют гомогенат коры) и Группы 1-6 из разрывных Перколла-градиенте сахарозы были исследованы для β-актина (структурные, загрузка контроль), GFAP (астроцитов), GP73 (Гольджи), HSC70 (цитоплазматических и ядерных) Ламин-B1 (ядерной), Prohibitin (митохондриальных), PSD95 (постсинаптической плотности ), SNAP25 (синаптической), Synaptophysin (синаптической) и β3-тубулина (нейрон-специфической). Полосы были визуализированы использованием Буря 860 Phosphorimager, представитель п = 3.
Рисунок 4. СН активны и обладают заново синтез белка через [35С]-Met регистрации. СН были заранее доведены до 37 ° С в течение 10 мин. Затем СН были неочищенных или предварительно в течение 15 мин с 40 anisomycin мкМ или 1 мкМ юглон при 37 ° С с последующим добавлением [35С]-Met, 20 мкл Express Pro Этикетка Mix S35 Легкая тегов, плюс-минус Glu при 37 ° С в течение 30 мин. Образцы были приготовлены с использованием Пирс SDS-PAGE Пример Подготовка комплекта, работает на 15% полиакриламидном геле, высушивают и количественно использованием молекулярной динамики Буря 860 phosphorimager, представитель п = 3, ± SEM.
Рисунок 5. Группа 5 из разрывных Перколла-градиенте сахарозы, содержащейся высокий уровень де синтез белка заново. Группы 4, 5 и 6, а супернатант (S, центрифугировали корковых гомогената) были заранее доведены до 37 ° С в течение 10 мин. Тогда, [35S]-Met, Express Pro Этикетка Mix S35 Легкая Tag, был добавлен, плюс-минус Glu при температуре 37 ° С в течение 30 мин. Образцы были приготовлены с использованием Пирс SDS-PAGE Пример Подготовка комплекта, работает на 15% полиакриламидном геле, высушивают и количественно использованием молекулярной динамики Буря 860 phosphorimager, представитель п = 3, ± SEM.
Рисунок 6. СН приготовленный из метод фильтрации содержат больше сломанной мембран и менее чем в целом СН СН приготовленный из разрывных Перколла-сахарозы градиентным методом. СН были подготовлены, передавая гомогенизированный коры через серию фильтров с уменьшением размера пор, как описано выше. 3,14-15 аликвоту СН подготовленный метод фильтрации центрифугировали над разрывным Перколла-градиенте сахарозы и по сравнению с эквивалентным количеством материала с помощью разрывных Перколла-сахарозы градиентным методом.
Рисунок 7. СН приготовленный из метод фильтрации содержат меньше заново синтез белка активность, чем СН подготовлены сюдам разрывных Перколла-сахарозы градиентным методом. СН были подготовлены, передавая гомогенизированный коры через серию фильтров с уменьшением размера пор, как описано выше, 3,14-15 и разрывных Перколла-сахарозы градиентные методы. СН от обоих препаратов, предварительно уравновешенной до 37 ° С в течение 10 мин. Тогда, [35S]-Met, Express Pro Этикетка Mix S35 Легкая Tag, был добавлен, плюс-минус Glu при температуре 37 ° С в течение 30 мин. Образцы были приготовлены с использованием Пирс SDS-PAGE Пример Подготовка комплекта, работает на 15% полиакриламидном геле, высушивают и количественно использованием молекулярной динамики Буря 860 phosphorimager, представитель п = 3, ± SEM.
Рисунок 8. СН от молодых мышей (P14) обладают большей активностью, чем поступательного старых мышей (P85). СН были получены из различных старых мышей использовании разрывных Перколла-сахарозы градиентный метод, preequilibrated при температуре 37 ° С в течение 10 мин, обработанных и необработанных с Glu в Наличие [35С]-Met (Express Pro Этикетка Mix S35 Легкая тегов) в течение 30 мин, оснастки заморожены, а затем очищается с Пирсом SDS-PAGE Kit Подготовка проб. СН были выполняться на 12% SDS-полиакриламидном геле, высушивают и отображается на молекулярной динамики Буря 860 phosphorimager, представитель п = 3, ± SEM. СН от P14 мышей, по крайней мере в 3 раза более активен, чем P85 мышей.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Разрывных Перколла-градиенте сахарозы подготовки описаны в настоящем документе, быстрый, надежный способ, чтобы изолировать активных СН, который может быть использован в разнообразных экспериментах синаптической передачи. Этот градиент метод, который основан на методике, разработанной Данкли и соавт., 3,4 является субклеточных процедуре фракционирования мозга, которая изолирует как до, так и постсинаптические мембраны полученных пузырьков, которые связаны друг с другом. Без дальнейшей очистки этих СН совместимы с целым рядом методов молекулярной биологии, в том числе иммунопреципитации, западные блоттинг, проточная цитометрия, мониторинг заново синтез белка через [35С]-Met регистрации, электронной микроскопии и различных ферментов анализов деятельности, включая и изомеразы анализы киназы.
Разрывных Перколла-градиенте сахарозы процедура относительно прямой вперед, однако он имеет ключевое значение для решения и держать мозг материала при температуре 4 ° С на протяжении подготовки и предварительного холод градиентов. Хотя гомогената сохраняется ледяной во все времена, чтобы минимизировать протеолиза, для лучшей урожайности с большей активностью лучше не допустить, чтобы коре сидят на льду в буфер GM слишком долго, прежде гомогенизации. Образование СН лучше всего, когда коры промывают, а затем оперативно гомогенизации. Гомогената, однако, могут быть сохранены на льду до первого центрифугирования без неблагоприятных последствий. Скорость вопрос раз коры были собраны, поэтому изоляция СН должна быть завершена как можно быстрее. Хотя СН может сохранить высокую активность в течение 1-2 часов, длительный период времени между этапами приведет к снижению активности. Возраст мышей, используемых для подготовки SN также является ключевым вопросом. Как было показано ранее, что существует возрастного снижения синаптической пластичности у грызунов. 16-19 Мы видели тот же самый эффект в СН. Хотя старые мыши могут быть использованы для трансляционно активное СН, мы обнаружили, что молодые мыши (P14), имеют большую переводческой деятельностью, то старых мышей (P85).
Есть несколько вариантов и комбинаций фильтрации, центрифугирования 5,14-15,20-23, 24-27 и 26-29 градиентные методы, которые были использованы для подготовки СН, и каждый имеет свои преимущества и недостатки. Фильтрации и центрифугирования методы могут привести к механическому повреждению СН. Методы, которые использовали различные поры размером фильтров в результате больший процент сломанной мембран и выход значительно меньше, СН. Мы старались фильтра методом, 5,14-15, который проходит гомогената через серию фильтров с уменьшением размера пор и обнаружили, что СН подготовленный метод фильтрации были значительно менее активны. Центрифугирования методы также привести к механическим повреждениям из-за длительного спинов при высоких скоростях, которые гранул или компакт-СН в нижней части трубы и требуют ресуспендирования. Перколла работают более мягких условиях, что избежать фильтрации или гранулирования СН, которая может раздавить или лизировать СН. С. Н. процедуры, которые используют Ficoll 28,30-32 или высокой molarities сахарозы 4,31 также привести к поврежденным или менее активную СН, нарушения биологических функций и морфологических изменений. 31-32 Ficoll могут вызвать нежелательные агрегации клетка при физиологических рН и дает осмотический градиент с увеличением концентрации. 31-32 Для поддержания изотонического условиях, градиенты должны быть компенсированы с солью градиента. 31 СН подготовлен при высокой концентрации сахарозы (1.4-0.8 М) приводит к меньшим и менее активными СН 4.
Разрывных Перколла-сахарозы метод преодолевает многие вопросы, связанные с другими СМИ и центрифугирования процедур. Основным преимуществом этого метода является использование Перколла, который обладает низкой вязкостью, низкой осмолярности и относительно не токсичность для клеток и их составляющих, что делает его лучше подходит для градиента плотности экспериментов, чем альтернативные варианты. 4,29 Кроме того, можно Перколла быть готовым с сахарозой поддерживать осмолярность необходимо сохранить С. Н. целостности. 4 Использование разрывных Перколла-сахарозы градиенты снижает центрифугирования времени от 30-45 мин до 5 мин, что позволяет расширить полезную продолжительность жизни СН, которые имеют ограниченный срок службы для деятельности . Еще одно преимущество Перколла градиентов более высокую доходность и деятельности СН по сравнению с методами, которые используют фильтры для формирования СН. Мы побежали СН из фильтра метода перед Перколла-градиенте сахарозы. Мы обнаружили, едва заметной С. Н. группу и изобилие более высокой молекулярной массой сломанной мембран на градиент. Кроме того, поступательная деятельность СН подготовленных методом Перколла была значительно выше, чем с фильтром метод. В целом, Перколла предпочтительнее других методов, поскольку она использует более мягких условиях, что избежать фильтрации и гранулирования СН resultinг в дольше задерживается в синаптической активности и лучше везикул формирования. Преимущество нашего метода перед Данкли, и др., 3,4 в том, что стекло, стекло Dounce гомогенизатора был использован здесь, в отличие от двигателем тефлон, стеклянного гомогенизатора, который повреждает наиболее постсинаптических терминал привязанностей и приводит к постсинаптические элементы подвергаясь средства массовой информации и очень мало быть вписана интактными мембран.
Значительная работа была сосредоточена на синтез белка в пост-синаптической плотности 11-13, но мало работы было сделано для изучения синтеза белков в пресинаптических отсеков. Тем не менее, есть данные, что синтез белка происходит в пресинаптических терминалах. 7-10 Как можно видеть в электронная микрофотография СН, пре-и постсинаптических вложений существует в подготовке С.Н. что делает их идеальной системой для дальнейшего изучения переводческой деятельности в обоих отсеках.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Нет конфликта интересов объявлены.
Acknowledgments
Мы хотели бы поблагодарить BK августа из Университета Висконсин-Мэдисон Фонда электронного микроскопа для электронной микроскопии. Эта работа была поддержана грантами NIH R01-DA026067 и P30-HD03352 (для JSM).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
| Micro BCA Protein Assay Kit | Pierce | 23235 | |
| CaCl2 | Fisher | C79-500 | |
| CO2 gas | Airgas (UW-MDS) | CD 50 | |
| EDTA | RPI | E57020 | |
| EtOH | Fisher | A407SK-4 | |
| HCl | Fisher | A142-212 | |
| Percoll | GE Healthcare | 17-0891-01 | |
| KH2PO4 | Fisher | P285-500 | |
| PierceSDS-PAGE Sample Prep Kit | Pierce | 89888 | |
| NaCl | RPI | S23020 | |
| NaHCO3 | Fisher | BP328-500 | |
| Na2PHO4 | Fisher | S381-500 | |
| Sucrose | RPI | S24060 | |
| Tris Base | RPI | T60040 | |
| Tetrodotoxin | Sigma | T5651 | |
| Express Pro Label Mix S35 Easy Tag | Perkin Elmer | NEG772 | |
| Equipment | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
| Dissection tools | |||
| Dounce homogenizer, 7 mL (comes with two glass pestles labled " A" and "B") | Wheaton | ||
| P1000 Gilson Pipetman | Gilson | F123602 | |
| Allegra 6KR Centrifuge | Beckman Coulter | 366830 | |
| GH 3.8 Rotor, Swinging bucket rotor | Beckman Coulter | 360581 | |
| Beckman J2-21 Centrifuge | Beckman | ||
| Beckman tubes with caps | Beckman | 355672 | |
| White walled adapters | Beckman | 342327 | |
| Blue walled adapters | Beckman | ||
| JA-17 Rotor, Fixed-angle rotor | Beckman | 369691 | |
Table of antibodies used for western blots: |
|||
| Name of Antibody | Company | Catalogue number | Host Species |
| β-Actin | Sigma | A5441 | mouse |
| GFAP | Santa Cruz | sc-65343 | mouse |
| GP73 | Santa Cruz | Sc-134509 | rabbit |
| HSC70 | Santa Cruz | sc-7298 | mouse |
| Laminβ | Santa Cruz | Sc-6261 | goat |
| Prohibitin | Santa Cruz | sc-28259 | rabbit |
| PSD95 | Millipore | MAB1596 | mouse |
| SNAP25 | AbCam | ab5666-100 | rabbit |
| Synaptophysin | Millipore | MAB368 | mouse |
| β-3-Tubulin | Santa Cruz | sc-80016 | mouse |
|
|||
References
- Westmark, C. J., Malter, J. S. FMRP mediates mGluR5-dependent translation of amyloid precursor protein. PLoS Biol. 5, e52-e52 (2007).
- Westmark, P. R., Westmark, C. J., Wang, S., Levenson, J., O'Riordan, K. J., Burger, C., Malter, J. S. Pin1 and PKMzeta sequentially control dendritic protein synthesis. Sci Signal. 3, ra18-ra18 (2010).
- Dunkley, P. R., Heath, J. W., Harrison, S. M., Jarvie, P. E., Glenfield, P. J., Rostas, J. A. A rapid Percoll gradient procedure for isolation of synaptosomes directly from an S1 fraction: Homogeneity and morphology of subcellular fractions. Brain Res. 441, 59-71 (1988).
- Dunkley, P. R., Jarvie, P. E., Robinson, P. J. A rapid Percoll gradient procedure for preparation of synaptosomes. Nat. Protoc. 3, 1718-1728 (2008).
- Hollingsworth, E. B., McNeal, E. T., Burton, J. L., Williams, R. J., Daly, J. W., Creveling, C. R. Biochemical characterization of a filtered synaptoneurosome preparation from guinea pig cerebral cortex: cyclic adenosine 3':5'-monophosphate-generating systems, receptors, and enzymes. J. Neurosci. 5, 2240-2253 (1985).
- Yi, H., Leunissen, J., Shi, G., Gutekunst, C., Hersch, S. A novel procedure for pre-embedding double immunogold-silver labeling at the ultrastructural level. J. Histochem. Cytochem. 49, 279-284 (2001).
- Akins, M. R., Berk-Rauch, H. E., Fallon, J. R. Presynaptic translation: stepping out of the postsynaptic shadow. Front. Neural Circuits. 3, (2009).
- Jin, I., Kandel, E. R., Hawkins, R. D. Whereas short-term facilitation is presynaptic, intermediate-term facilitation involves both presynaptic and postsynaptic protein kinases and protein synthesis. Learn. Mem. 18, 96-102 (2011).
- Lyles, V., Zhao, Y., Martin, K. C. Synapse formation and mRNA localization in cultured Aplysia neurons. Neuron. 49, 349-356 (2006).
- Wagatsuma, A., Azami, S., Sakura, M., Hatakeyama, D., Aonuma, H., Ito, E. De Novo synthesis of CREB in a presynaptic neuron is required for synaptic enhancement involved in memory consolidation. J. Neurosci. Res. 84, 954-9560 (2006).
- Sutton, M. A., Schuman, E. M. Local translational control in dendrites and its role in long-term synaptic plasticity. J. Neurobiol. 64, 116-131 (2005).
- Li, K. -W., Hornshaw, M. P., Van der Schors, R. C., Watson, R., Tate, S., Casetta, B., Jimenez, C. R. Proteomics analysis of rat brain postsynaptic density: implications of the diverse protein functional groups for the integration of synaptic physiology. J. Biol. Chem. 279, 987-1002 (2004).
- Peng, J., Kim, M. J., Cheng, D., Duong, D. M., Gygi, S. P., Sheng, M. Semi-quantitative proteomic analysis of rat forebrain postsynaptic density fractions by mass spectrometry. J. Biol. Chem. 279, 21003-21011 (2004).
- Kim, S. H., Fraser, P. E., Westaway, D., St. George-Hyslop, P. H. Group II metabotropic glutamate receptor stimulation triggers production and release of Alzheimer's amyloid β42 from isolated intact nerve terminals. J. Neurosci. 30, 3870-3875 (2010).
- Weiler, I. J., Greenough, W. T. Potassium ion stimulation triggers protein translation in synaptoneurosomal poiyribosomes. Mol. Cell. Neurosci. 2, 305-314 (1993).
- Billard, J. M. Ageing, hippocampal synaptic activity and magnesium. Magnes Res. 19, 199-215 (2006).
- Murphy, G. G., Fedorov, N. B., Giese, K. P., Ohno, M., Friedman, E., Chen, R., Silva, A. J. Increased neuronal excitability, synaptic plasticity, and learning in aged Kvbeta1.1 knockout mice. Curr. Biol. 14, 1907-1915 (2004).
- Norris, C. M., Halpain, S., Foster, T. C. Reversal of Age-Related Alterations in Synaptic Plasticity by Blockade of L-Type Ca21 Channels. J. Neurosci. 18, 3171-3179 (1998).
- Sallert, M., Malkki, H., Segersträlea, M., Tairaa, T., Lauri, S. E. Effects of the kainate receptor agonist ATPA on glutamatergic synaptic transmission and plasticity during early postnatal development. Neuropharm. 52, 1354-1365 (2007).
- Quinlan, E. M., Philpot, B. D., Huganir, R. L., Bear, M. F. Rapid, experience-dependent expression of synaptic NMDA receptors in visual cortex in vivo. Nat. Neurosci. 2, 357-35 (1999).
- Scheetz, A. J., Nairn, A. C., Constantine-Patton, M. NMDA receptor-mediated control of proteins synthesis at developing synapses. Nat. Neurosci. 3, 211-216 (2000).
- Villasana, L. E., Klann, E., Tejada-Simon, M. V. Rapid isolation of synaptoneurosomes and postsynaptic densities from adult mouse hippocampus. J. Neurosci. Methods. 158, 30-36 (2006).
- Weiler, I. J., Greenough, W. T. Metabotropic glutamate receptors trigger postsynaptic protein synthesis. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 90, 7168-7171 (1993).
- Gray, E. G., Whittaker, V. P. The isolation of nerve endings from brain: An electron microscopic study of cell fragments derived by homogenization and centrifugation. J. Anat. 96, 79-88 (1962).
- Gylys, K. H., Fein, J. A., Yang, F., Cole, G. M. Enrichment of Presynaptic and Postsynaptic Markers by Size-Based Gating Analysis of Synaptosome Preparations From Rat and Human Cortex. Cytometry A. 60, 90-96 (2004).
- Hajós, F. An improved method for the preparation of synaptosomal fractions in high purity. Brain Res. 93, 485-489 (1975).
- Bai, F., Witzmann, F. A. Synaptosome Proteomics. Subcell. Biochem. 43, 77-98 (2007).
- Rao, A., Steward, O. Evidence that protein constituents of postsynaptic membrane specializations are locally synthesized: analysis of proteins synthesized within synaptosomes. J Neurosci. 11, 2881-2895 (1991).
- Pertoft, H., Laurent, T. C. Isopycnic separation of cells and cell organelles by centrifugation and modified colloidal silica gradients. Methods of Cell Separation. Catsimpoolas, N. , Plenum Press. New York. 25-65 (1977).
- Ramarao, C. S., Acharya, S. R., Krishnan, K. S., Kenkare, U. W. High affinity uptake of L-glutamate and γ-aminobutyric acid in Drosophila melanogaster. J. Biosci. 11, 119-135 (1987).
- Munteanu, L. S., Dinu, A. Fractionation of granulocytes from whole human blood by centrifugation. Practical hints. Romanian J. Biophys. 14, 53-58 (2004).
- Cell separation composition, kit and method. US patent. Vlasselaer, P., Van Palathumpat, V. , 019713 (1997).
