Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove

Bioengineering

غشائي ذاتي السلف الخلوي البذر التكنولوجيا واختبار توافق مع الحياة للحصول على أجهزة القلب والأوعية الدموية في نموذج حيواني كبير

doi: 10.3791/3197 Published: September 9, 2011

Summary

وهناك طريقة لزرع التيتانيوم الدم بالاتصال مع الخلايا الحيوية ذاتي واختبار توافق مع الحياة الموصوفة. يستخدم هذا الأسلوب الخلايا البطانية السلف ومواسير والتيتانيوم ، والمصنفة في غضون دقائق من الزراعة الجراحية في الخنزيري الوريد الأجوف. هذا الأسلوب هو زرع أجهزة للتكيف مع العديد من الطب الحيوي.

Abstract

يتم تصنيع أجهزة القلب والأوعية الدموية التي تزرع في الجسم من المواد الاصطناعية (مثل التيتانيوم (تي) ، وسعت بولي تترافلوروإيثيلين) ، والتي تشكل خطر تشكيل thromboemboli 1،2،3. طورنا طريقة لخط السطح داخل الأنابيب مع ذاتي تي المشتقة من الدم البشري الخنزيري أو الخلايا البطانية السلف (EPCs) 4. من خلال زرع أنابيب تي تحتوي على طبقة من متموجة EPCs الخنازير في الوريد الأجوف السفلي (IVC) للخنازير ، ونحن اختبار للتوافق مع الحياة أفضل للسطح الخلية المصنفة في البيئة التخثر نموذج الحيوانات الكبيرة ومقارنته معدلة السطوح المعدنية العارية 5،6،7 (الشكل 1). ويمكن استخدام هذا الأسلوب لendothelialize الأجهزة في غضون دقائق من زرع واختبار وظائفها جرعات في الجسم الحي.

تم الحصول على الدم المحيطي من 50 كلغ يوركشاير الخنازير وكسر في الخلية وحيدة النواة مثقف لعزل EPCs 4،8. وكانت منظمة الشفافية الدولية أنابيب (9.4 ملم معرف) قبل قطع إلى ثلاثة أقسام الطول 4.5 الطولية وتجميعها مع الحرارة تنكمش الأنابيب. بنيت جهاز البذر ، والذي يسمح للدوران بطيء للأنابيب تي.

أداء لدينا البطن على الخنازير وتخريجها في الأمعاء والمثانة البولية. وقد استخدم تشريح حادة وصريحة لأصبح هيكل في IVC من التشعب لها القاصي إلى الشريان الكلوي الحق القريبة. ثم امتلأت أنابيب تي مع fluorescently المسمى ذاتي تعليق EPC وتناوب في 10 دقيقة و 30 RPH x لتحقيق موحدة الخلية طلاء 9. بعد إعطاء الهيبارين USP / 100 كجم ، وفرضت طرفي IVC والوريد القطني. وأجري veinotomy 4 سم وإدراج الجهاز ومليئة الفوسفات مخزنة المالحة. كما تم إغلاق veinotomy مع خياطة Prolene 4-0 على التوالي ، وكان لإزالة واحد المشبك IVC دي الهواء. إغلاق الفضاء تحت الجلد في نهاية هذا الإجراء ، وكان يقترب من لفافة مع PDS - 0 (polydioxanone خياطة) ، مع Vicryl 2-0 والجلد تدبيس مغلقة.

بعد 3-21 أيام ، وكان الموت الرحيم الخنازير ، الجهاز explanted ان كتلة والثابتة. وكانت مفككة تي أنابيب والأسطح الداخلية المصورة مع المجهر الفلورسنت.

وجدنا أن أنابيب معدنية عارية تماما في حين تي المغطي الأنابيب EPC المصنفة بقيت البراءة. علاوة على ذلك ، كنا قادرين على إثبات وجود طبقة من EPCs متكدسة على سطح الدم بالاتصال الداخل.

الختامية ، ويمكن استخدام التكنولوجيا لدينا لendothelialize أنابيب تي في غضون دقائق من زرع EPCs مع ذاتي لمنع تجلط الدم من الجهاز. الأسلوب الجراحي يسمح لنا لاختبار توافق مع الحياة وتحسين مثل هذه الأجهزة مع تعديل الحد الأدنى من فقدان الدم واضطراب EPC المصنفة السطح.

Protocol

1. العزلة السلف الخلية البطانية

  1. قبل ثلاثين يوما لزرع أنبوب EPC المصنفة ، وإعداد حقنة 60 مل و 15 مل من محلول سكر العنب تخثر سترات وآمنة مع وقف الديك 3 - EPC الطريق لعزل من دم الخنزير الطرفية. قبل 24 ساعة لسحب الدم ، precoat عمرهما 12 - جيدا مع لوحات نوع الكولاجين الفئران 1 (50 ميكروغرام / لتر ، 0.02 الذائب في محلول حمض الخليك N) 4.
  2. سلوك الحيوان كل الرعاية والتجريب ، وفقا للمعهد الوطني للصحة المبادئ التوجيهية لرعاية واستخدام الحيوانات المختبرية وفقط بعد الموافقة على الإشراف على رعاية الحيوان واللجنة المؤسسية الاستخدام.
  3. الأنثى رزين يوركشاير الخنازير (45 كلغ) مع آسيبرومازين (1.1 ملغ / كلغ) والكيتامين (22 ملغ / كلغ) عن طريق الحقن العضلي 19 إبرة فراشة G.
  4. Intubate الخنزير مع أنبوب القصبة الهوائية (30 سم طول و 8 ملم معرف) وتخدير الخنازير مع Isoflurane (4.5 ٪ من حجم المد والجزر بواسطة قناع).
  5. رصد الخنازير أثناء الإجراء عن طريق قياس تشبع الأكسجين ومعدل ضربات القلب ودرجة الحرارة. المحافظة على التنظيم الحراري باستخدام الآلي طاولة العمليات الساخنة والتدفئة وبطانية من قبل ارتفاع درجة حرارة السوائل التي غرست.
  6. مكان الخنزير في موقف مستلق على طاولة العمليات ، وتأمين الاطراف caudolaterally الخلفيتين ، ونظيفة مع الكلورهيكسيدين تليها DuraPrep التعقيم. ثم المضي قدما في اللف منطقة الحوض.
  7. اضافة الى وجود 21 مجموعة X 7 سم الإبرة من عدة الدقيقة 5 introducer F الإنسي فقط لنبضة الفخذ واضح (الإنسي إلى الوحشي والإنسي المتسعة لعضلة الناحلة) في الوريد الفخذي ويقني ؛ يدخل القنية في الوريد باستخدام طريقة سيلدينغر. أعد توصيل حقنة 60 مل لقسطرة الأوعية الدموية واستخلاص 45 مل من الدم.
  8. عقد الضغط على موقع السفينة ثقب لتحقيق الإرقاء (5 دقائق) ، وبوقف التخدير واسترداد الخنزير. ويتم رصد هذا الحيوان حتى الشفاء التام ، وعاد إلى قفصه.
  9. تمييع الدم 1:01 حل بمحلول ملح هانك مخزنة (بدون CaCl 2 ، MgCl 2 ، MgSO 4) ، وطبقة على كميات متساوية من Histopaque لخلق طبقات واضحة المعالم. الطرد المركزي (30 دقيقة ، 740 غ ، وانخفاض الإعداد استراحة) وجمع الخلايا وحيدة النواة (MNC) طبقة. التخزين المؤقت Resuspend وغسل الشركات المتعددة الجنسيات × 3 مع الفوسفات Dulbecco والمالحة (DPBS) (10 دقيقة ، 515 غ) قبل الطلاء في لوحات 12 - جيدا اثنين في المتوسط ​​النمو الكامل (EBM - 2 المتوسطة مع المصل خنزيري 2 ٪ (PS) وغير العادية 2 SingleQuots) عند 37 درجة مئوية ، 5 ٪ CO 2.
  10. تتغير ببطء المتوسط ​​كل 24 ساعة لمدة 7 أيام أولا ، ثم مرة كل يومين. تحديد المستعمرات EPC بعد وقت المتوسط
    7 أيام (الشكل 2).
  11. توسيع EPCs مرة واحدة في الثقافة أنها تغطي ربع مساحة سطح من 12 أيضا. تأكيد الهوية EPC مع التدفق الخلوي عن طريق اختبار لوجود علامات السطح وعدم وجود CD31 CD14 ، CD45. المقايسات الأخرى التي يمكن أداؤها تشمل مورفولوجيا الخلايا والنشاط الثالث اكسيد النتريك بعد التعرض لتدفق 4.

2. التيتانيوم أنبوب التجميع

  1. شهد عقد المقطع طوليا أنبوب تي في 3 وحدات 120 درجة متساوية (4.5 سم) مع الأسنان 72 HHS الحز في مكان من الشجرة ورأى في آلة الطحن العمودي. تشغيله في 300 دورة في الدقيقة ، وإبقاء المنطقة القطع مشبعة ماجيك الحنفية قطع السوائل في جميع الأوقات خلال خفض (الشكل 3).
  2. تلميع السطح الداخلي مع طاحونة مقاعد البدلاء ، وعجلة ، سكوتش برايت المعادن. ثم صقل يدويا بقطعة قماش الصنفرة 3M على السطح على نحو سلس وكذلك حتى لإزالة أي حفر مرئية.
  3. تنظيف القطع تي بمحلول الصابون Alconox ، تليها 5 دقائق الانغمار في ريجيا المائية (01:03 حمض النيتريك مركزة ليتركز حامض الهيدروكلوريك) ، تليها الشطف مع عدة لترات من الماء 10. احترس المدقع كما هو الماء الملكي والأكالة انفجار!
  4. يصوتن المقاطع تي × 16 دقيقة في محلول الصابون Alconox ، وارتفاع × 30 في الماء منزوع الأيونات ويصوتن مرة أخرى × 16 دقيقة في ماء منزوع الأيونات. السماح ليجف في غطاء تدفق الصفحي.
  5. قطع البلاستيكية الحرارية تقلص الأنابيب على طول 4،5 سم ونظيفة تماما في 2.4.
  6. استخدام ملاقط لتنظيف المكان من 3 أقسام تي في الصعود إلى مغزل داعمة (تشكيله من الألمنيوم ، 8.5 مم OD) والأكمام مكان الأنابيب البلاستيكية الحرارية تقلص حول المقاطع تي (الشكل 4). انكماش الأنابيب بمسدس الحرارة في حين تحول مغزل التفاف الفروع بالتساوي تي معا بإحكام.

3. الجهاز البذر والتجمع المكون

  1. قطع أنابيب السيليكون إلى طول 2.5 سم والطول 3.5.
  2. حقنة القسم 5 سم مكعب من البلاستيك عند علامة 0.8 مل والحفاظ على "قطعة الرأس" مع نهاية luer.
  3. 2 نظيفة تماما المقاطع سيليكون س ، 'قطعة الرأس" حقنة وقبعة luer بواسطة صوتنة كما هو موضح تحت 2.4.
  4. إضافة إلى كل أنبوب السيليكون نهاية أنبوب تي تجميعها من 2.5 ، extenقرع بنسبة 5 ملم خلال الأنابيب البلاستيكية.
  5. تضاف قطع نهاية 'قطعة الرأس" حقنة في أنابيب السيليكون قصيرة ، بحيث يتاخم تي أنبوب (الشكل 5).
  6. الانتهاء من ختم تي التجمع أنبوب واحد في الحقيبة غطاء luer تايفك مع وأكسيد الإيثيلين (18 ساعة عند درجة حرارة 55 مئوية) تعقيم الغاز.
  7. جبل محرك توقيت متزامن (10 RPH) على منصة وربط شبكي المحور لحامل حقنة (تشكيله من الألمنيوم ، ويناسب حقنة 5 سم) (الشكل 6).

4. EPC - البذر من سطح أنبوب تي الداخلية

  1. توسيع EPCs ومعزولة تحت 1. متموجة إلى 3 T - 75 قوارير (أو على الأقل 9 × 10 خلايا 6).
  2. في يوم من الجراحة ، والخلايا تسمية fluorescently على المدى الطويل من صبغة (PKH26) 11. أبدأ الشطف EPCs مثقف مرتين في المتوسط ​​مجانا المصل. الحذر للحد من التعرض للضوء لحماية الخلايا أثناء وبعد وضع العلامات.
  3. تغطية الخلايا مع 4 ميكرومتر PKH26 في C مخفف (صبغة الحل) في درجة حرارة الغرفة لمدة 4 دقائق.
  4. وقف العلامات رد فعل عن طريق إضافة مصل الخنازير في حجم مساو لصبغ الحل. دقيقة واحدة في وقت لاحق ، تمييع الحل مجتمعة 01:01 المتوسطة مع النمو الكامل.
  5. نضح السوائل والخلايا شطف × 3 مع متوسط ​​النمو الكامل.
  6. غسل EPCs مرتين في DPBS (بدون CaCl 2 ، MgCl 2).
  7. تغطية الخلايا في التربسين واحتضان عند 37 درجة مئوية لمدة 3 دقائق ، وتأكيد انفصال تحت المجهر الخفيفة. إضافة التربسين تحييد الحل في حجم المزدوج للالتربسين المستخدمة.
  8. الجمع بين حلول الخلية في أنبوب واحد ومزيج من قبل pipetting. أضف 10 ميكرولتر من محلول خلية في كل جانب من عدادة الكريات لفرزها.
  9. حل الخلية الطرد المركزي (1500 RPH ، 5 دقائق). عدد الخلايا وبيليه في resuspend 2 -- في المتوسط ​​مجانا المصل 2.5 × 10 6 EPCs / مل. ملاحظة حجم الحد الأدنى لملء أنبوب التجميع هو 4.5 ملم.
  10. وضع منشفة معقمة في غطاء المحرك البيولوجي لحقل معقمة. فتح الغاز أنبوب تعقيم تي التجمع وخارج محقنة 5 سم على حقل معقمة.
  11. مع قفازات معقمة ، إزالة المكبس من المحاقن 5 سم والحفاظ على مجال لاستخدامها لاحقا. luer يضعوا الغطاء لهذه الحقنة.
  12. الماصة لل4،5-5 تعليق EPC 4.9 مل في إطار برميل حقنة مفتوحة. إدراج المكبس آمن بالعودة الى نهاية مفتوحة من المحاقن.
  13. عقد المحاقن مع سقف أعلى وإزالة الغطاء. إدراج المحاقن مع نهاية luer الأولى في أنابيب السيليكون فتح أنبوب تي في التجمع حتى دافئ ؛ لا تقدم داخل أنبوب تي.
  14. حقنة قبل المكبس ببطء حتى تصل إلى حل الخلية قطع رأس المحقنة 'قطعة الرأس ،' إزالة الفقاعات من النظام. وثيق مع غطاء luer وإدراج التجمع بأكمله في غمد العقيمة ، وختم الشريط مع نهاية مفتوحة.
  15. إدراج هذا التجمع بأكمله إلى صاحب حقنة تشكيله من 3.7. مكان في الحاضنة في 37 درجة مئوية وتعديل النظام الأساسي بحيث جزء أنبوب تي غرفة البذر هو مستوى ، وذلك باستخدام المياه قياس مستوى الشكل (6).
  16. تسمح تي التجميع أنبوب لتدوير 30 دقيقة قبل الزرع.

5. زرع أنبوب تي في الوريد الأجوف السفلي الخنازير

  1. أربع وعشرين ساعة قبل الجراحة ، ويمهد للتخدير الخنزير (التي كانت معزولة EPCs) مع التصحيح الفنتانيل (100 ميكروغرام / ساعة عبر الجلد ؛ إبقاء التصحيح في مكان × 72 ساعة).
  2. NPO إبقاء الخنازير بين عشية وضحاها وإدارة Baytril (Enrofloxacin) قبل الجراحة في اليوم لعملية جراحية (5 ملغ / كلغ ، IM) ولمدة 7 أيام التالية ، كل 24 ساعة والوقاية بالمضادات الحيوية.
  3. رزين ، وintubate تخدير الخنازير كما هو موضح تحت 1.3 (حجم المد والجزر من 10 -15 مل / كغ) وتأمين الخنازير في موقف ضعيف على طاولة غرفة العمليات. رصد الخنازير أثناء الإجراء عن طريق قياس تشبع الأكسجين ومعدل ضربات القلب ودرجة الحرارة. المحافظة على التنظيم الحراري باستخدام الآلي طاولة العمليات الساخنة والتدفئة وبطانية من قبل ارتفاع درجة حرارة السوائل التي غرست.
  4. إدراج 18 قسطرة الوريد في الرابع G أذن الخنزير وحماية العينين الخنزير مع قطرات العين Vetropolycin.
  5. النظيفة ، والإعدادية ، وثنى بطن الخنزير كما في 1.6. شق خط الوسط بشفرة مشرط رقم 15 من مجموعة من الغدد الثديية 2 cranially إلى 2 لمشاركة مجموعة caudally.
  6. حمل تشريح أسفل البطن لفافة مع كاو كهربي.
  7. رفع الصفاق مع ملقط البعوض ، وأدخل بعناية مع مقص Metzenbaum.
  8. تخريج المثانة البولية ووضع 3 - O Vicryl خياطة صارة في جدار المثانة. شق مكان طعنة في منتصفه ، وتضاف قسطرة فولي 16 F. إدارة السوائل الوريدية (اللاكتات قارعو الأجراس) ليعاير إخراج البول ل> / = 1 مل / كغ / ساعة خلال عملية جراحية.
  9. التالية ، وتخريج الامعاء الصغيرة والكبيرة ومكان اثنين الكامشات بلفور الجراحية للكشف عن الجانب الخلفي من التجويف البريتوني والتعرف على الوريد الأجوف السفلي (IVC).
  10. به تشريح حادة وصريحة ، بعناية تحرير IVC من الأنسجة المحيطة وأصبح هيكل السفينة من الشريان الكلوي الحق الأقرب إلى التشعب من IVC القاصي. ممارسة الحذر الشديد أثناء تشريح IVC حتى عيب صغير جدا في IVC قد يؤدي إلى نزف واستنزاف سريع للحيوان.
  11. Ligate جميع فروع الجانب من قطاع IVC لضمان انه لن يكون هناك نزيف حول أنبوب تي أن يكون مزروع. علما اثنين الخلفي كبيرة عادة الأوردة القطنية التي تتطلب تشريح دقيق للغاية ، وربط. علاوة على ذلك ، علما بأن القريبة على الفور إلى التشعب من IVC ، تم مصادفة عموما وريد كبير في الجانب القطني خلفي إنسي ويجب أن تكون حرة وتشريح للرقابة مع حلقات السفينة تمهيدا لوضع المشبك.
  12. المضي قدما في بذر أنبوب تي في وقت واحد كما هو مبين في الفقرة 4.
  13. إدارة USP 100 / كغ من الهيبارين مباشرة قبل لقط وIVC. مكان المشابك 45 درجة زاوية الجراحية بشكل أقصى على IVC والوريد القطني ، وقريب بعد ذلك.
  14. إنشاء veinotomy طولية (4 سم) بين المشابك القريبة والبعيدة باستخدام شفرة # 11 مشرط تليها التمديد مع مقص بوتس.
  15. إخلاء أي من الدم وتدفق IVC التجويف الداخلى مع DPBS العقيمة.
  16. إدراج الآن EPC المصنفة تي أنبوب (أو السيطرة المعدن) في IVC وملء مع DPBS (مع CaCl 2 ، MgCl 2) لمنع الخلايا من التجفيف ولاجلاء الهواء.
  17. إغلاق veinotomy مع خياطة Prolene 4-0 على التوالي وإزالة أحد المشبك الأقرب إلى IVC دي في الهواء من خلال كمية صغيرة من الدم الى الوراء. وضع "البقاء الدرز" من خلال جدار الوريد إلى أنابيب البلاستيكية لمنع الهجرة من الزرع على مر الزمن.
  18. إغلاق اللفافة مع O - PDS على إبرة CT والمساحة تحت الجلد مع 2 - O Vicryl (تشغيل الغرز). إغلاق الجلد بدبابيس.
  19. ادارة ما يصل الى 20 مل من Marcaine 0.25 ٪ (بوبيفاكايين) تحت الجلد على طول شق موقع وتغطية الجرح بشاش وTegaderm. أيضا إعطاء فلونيكسين (2.2 ملغ / كلغ س 24 ساعة) وOxymorphone (0.15 ملغم / كغم س 3 -- 4 ساعات) تحت الجلد حسب الحاجة للألم.
  20. وقف التخدير ومراقبة الخنازير حتى مستيقظا والعودة إلى القفص. رصد الخنازير مرتين يوميا لمدة علامات الوقوف ، استغاثة / الألم والتمشي ، البراز والبول ، ولون الجلد يشير نضح العادي.

6. Explantation من أنبوب تي

  1. بعد 3 أسابيع ، وقور ، وintubate تخدير الخنازير كما هو موضح في 1،3-1،4.
  2. المضي قدما في البطن كما هو موضح في 5،5-5،8.
  3. وسوف نلاحظ أن تندب اخفاء موقع الزرع ولكن يمكنك جس أنبوب تي جامدة في الموقع.
  4. تشريح خارج IVC كما هو موضح في 5،9-5،11 ويزدرع أنبوب تي أون لبنة مع IVC المحيطة مع مقص الثقيلة.
  5. الموت ببطء الحيوان مع الحل Euthasol القتل الرحيم (390 ملغ / مل و 50 بنتوباربيتال الصوديوم الصوديوم فينيتوين ملغم / لتر في 1 مل / رطل 10).

7. التثبيت والتصوير تي السطح الداخلي

  1. شطف الجزء الوريد رفعه مع أنبوب تي في حل DPBS وصورة التجويف والخمسين (البراءة أو المغطي) مع كاميرا رقمية عالية القرار (الشكل 7).
  2. التالية ، وتحديد العينة التي الانغمار في بارافورمالدهيد 3.7 ٪ لمدة لا تقل عن 15 دقيقة. شطف العينة في حل DPBS.
  3. جدا بعناية شق الوريد المحيطة والأنابيب البلاستيكية لفتح أنبوب تي. مكان المقاطع 3 تحت المجهر الفلورسنت مع الأسطح داخل تواجه الهدف / مصدر الضوء والصورة تحت 550 نانومتر الطول الموجي الإثارة لتصور PKH26 المسمى EPCs في أحمر / برتقالي اللون ، الشكل (8A). إذا رغبت في ذلك ، يمكن أن يكون كذلك خلايا ملون (مثل صفائح الدم التصاق الخلية البطانية ماركر (PECAM) وصمة عار لتصور حدود الخلية (8B الشكل) ، دابي وصمة عار لتصور النوى ، الخ).

8. ممثل النتائج :

بعد تنفيذ هذا البروتوكول ، والأطباء والعلماء قادرون على endothelialize هياكل متينة مع أنبوب نقل الدم الذاتي المستمدة من الخلايا الاصلية البطانية في نموذج حيواني كبير. ويبين الشكل 2 أن EPCs معزولة مع اسلوبنا تظهر المستعمرات مع التشكل الحصوه بعد حوالي 7 أيام في الثقافة. لدينا جهاز البذر هو موضح في الأرقام 5 و 6 يسمح للتناوب بطء تي أنابيب مملوءة تعليق EPC ونتائج موحدة في التغطية على سطح الأنبوب الداخلية تحت ظروف معقمة 9.

جراحة زرع يسمح لنا لاختبار ميل الحيوية ، مثل تي ، لتجلط الدم في نموذج حيواني كبير. وجدنا أن الخنازير تحمل هذا الإجراء بشكل جيد وأنه يمكن تحقيق هذا الزرع مع فقدان الحد الأدنى من الدم فقط ودون انقطاع طبقة EPC.

ر "> ويبين الشكل 7 أن أنبوب تي العارية occludes تماما ، في حين لدينا EPC مبطنة أنبوب تبقى البراءة حتى في بيئة منخفضة القص التخثر من الوريد الأجوف السفلي. وعلاوة على ذلك ، فإن وجود طبقة من الخلايا متموجة fluorescently المسمى يؤكد نجاح هذا الأسلوب كما هو موضح في الشكل 8.

الشكل 1
الشكل 1. تخطيطي لذاتي الخلية البطانية السلف تجربة البذر (EPC). الأولى ، يوجه الدم المحيطي من الخنزير. المقبل ، يتم عزل EPCs من الدم وتوسع في الثقافة. ثم يتم استخدام EPCs إلى خط أنبوب جهاز التيتانيوم (تي) ، الذي هو مزروع جراحيا ثم في الوريد الأجوف السفلي من الخنزير نفسه الذي تم عزل الخلايا.

الشكل 2
الشكل 2. مستعمرة ممثل EPCs في الثقافة ، وحوالي 7 أيام بعد إجراء العزل (تصوير مع مجهر مقلوب DMIL ايكا مع كاميرا التصوير والبرمجيات QCapture).

الشكل 3
الرقم 3 أنبوب تي. أقسام قبل التجمع. منظمة الشفافية الدولية هو قطع الأنابيب إلى 3 أقسام متساوية طوليا ، ثم تنخفض إلى 4.5 سم طول. يتم تلميع الأسطح الداخلية للأبواب تي باستخدام طاحونة مقاعد البدلاء ، وقماش الصنفرة لإزالة الحفر وضوحا.

الشكل 4
الشكل 4. أقسام الجمعية أنبوب تي مع الأنابيب البلاستيكية الحرارية تقلص (الأزرق) وبندقية الحرارة. وتدعم منظمة الشفافية الدولية المقاطع على مغزل تشكيله الألومنيوم الذي يمتد من خلال الأبواب والمباريات تي أبعاد أنبوب قطره الداخلي تي.

الشكل 5
الشكل 5 التيتانيوم أنبوب التجمع ، والتي تبين جميع مكونات : luer كأب ، 'قطعة الرأس ،" حقنة أنابيب من السيليكون ، وتي أنبوب PVC مع التفاف (الأزرق). يتم وضع التجمع معا قبل التعقيم الجراحي للاستخدام.

الشكل 6
الشكل 6. تشكيله تي الإعداد بذر أنبوب داخل الحاضنة ، وتبين السيارات ، ومنصة ، والالومنيوم صاحب المحاقن ، وأنبوب تي التجميع ، و 5 حقنة سم مكعب. ملاحظة : يظهر الجمعية دون غمد المعقمة الواقية لأغراض التصور.

الشكل 7
الشكل 7. النتائج الإجمالية للجراحة زرع الممثل : (أ) نهاية نظرا لسيطرة عارية أنبوب معدني تي بعد زرع في الوريد الأجوف السفلي الخنازير (IVC). غير المغطي بالكامل مع أنبوب التجويف جلطة الصلبة (B) نهاية نظرا لأنبوب تي EPC المصنفة بعد الزرع. أنبوب التجويف هو البراءة واضحة تماما (C) عرض تشريح للتحكم (العارية) بعد زرع أنبوب تي 3 أيام ، والتي تبين مدى التخثر (وقد أجريت التجارب حتى مدة 3 أسابيع مع نتائج مماثلة).

الشكل 8
(تصوير أحادي مع المجهر تستقيم DMRB ايكا مع QICAM QImaging الكاميرا الرقمية والصور برو بلس البرمجيات) الرقم 8. EPCs على سطح أنبوب تي زرع التالية لمدة 3 أيام. (أ) على سطح الخلايا مندمج تظهر PKH26 قبل الجراحة التوسيم. (ب) طبقة من EPCs مندمج. الحمراء : PKH26 قبل الجراحة التوسيم. الخضراء : EPC PECAM وصمة عار.

Discussion

طريقة أنابيب تي خلية بذر المعروضة هنا تمكن الأطباء والعلماء بسرعة وبشكل موحد endothelialize الدم الاتصال أسطح الأجهزة التي تزرع في الجسم. منذ أن عزل وتوسيع EPCs عينات من الدم المحيطي ، لا يلزم إجراء الغازية الرئيسية لحصاد هذه الخلايا. علاوة على ذلك ، EPCs هي ذاتي ، وبالتالي يتم القضاء على خطر من أي رد فعل جهاز المناعة لزرع الخلايا المصنف. ويمكن استخدام المبادئ تظاهروا في البروتوكول له ليس فقط لأنابيب تي ، ولكن لالحيوية الأخرى الكثيرة التي تستخدم في مجال الطب القلب والأوعية الدموية.

خطوات حاسمة في هذا البروتوكول والتنظيف الدقيق للأنابيب تي ، كما وجدنا أن أي فيلم ملتصق من الملوثات التقيد الخلية تنازلات. مزيد من سرعة دوران بطيء (متناسبة عكسيا مع أنبوب قطره) ضروري أثناء عملية البذر ، يمكن تسوية مثل هذه EPCs ببطء والتمسك السطح مثل أنبوب تي يتحرك.

لدينا وسيلة لزرع البذور مباشرة قبل غرس ثقافة يتجنب عملي مرات خارج الحي ؛ الخلايا الالتزام الفردي وشكل في وقت لاحق ورقة متكدسة في الجسم الحي ، وتجنب إمكانية الانصمام كورقة مباشرة بعد إعادة إنشاء التدفق. دراساتنا السابقة تبين أنه بمجرد أن EPCs نمت إلى طبقة متموجة ، لأنها تجعل مصفوفة الخلوية الإضافية التي كانوا متمسكين بقوة ، بالإضافة إلى التقليل من أي النزع ممكن من ورقة البطانية. على الرغم من عدم إمكانية انفصال صمي أن يستبعد بالكامل ، فإنه يبدو أن الخطر أقل متعدد الجوانب من التخثر من سطح الجهاز كله ، فإن المشكلة التي تم تصميمها لمنع هذا العلاج.

نهجنا من زرع في القص منخفضة ، والبيئة التخثر من الوريد الأجوف السفلي ويستخدم واحد من النماذج الحيوانية الأكثر ثقة كبيرة للبحث التوافق تخثر الدم والأجهزة 5،6. علما بأن كل الرعاية وأجريت التجارب في الحيوان وفقا للمعهد الوطني للصحة المبادئ التوجيهية لرعاية واستخدام الحيوانات المختبرية وفقط بعد الموافقة على رعاية الحيوان في جامعة ديوك المؤسسية واللجنة الاستخدام.

من أجل الاستفادة من هذه الطريقة بنجاح لاختبار زراعة الحيوية والأجهزة ، من المهم أن أصبح هيكل بصبر الجزء IVC ligate جميع السفن وفرع وريدي استعدادا للالإدراج الجهاز ، بحيث لا حول نزيف الجهاز ينشأ في 'معة كاذبة". آخر خطوة حاسمة في إضافة DPBS في تجويف جهاز من هذا القبيل أن الخلايا على السطح داخل أنبوب تبقى رطبة خلال إغلاق veinotomy وقبل بدء ضخه. إذا لا يمكن أن يكون الجهاز وجدت في الموقع حيث تم زرعها فيه ، قد هاجروا أنه "المنبع' في IVC. ويمكن منع هذا عن طريق وضع خياطة (4 - O Prolene) من خلال جدار الوريد ، ومن خلال 2-3 المقطع ملم من الأنابيب البلاستيكية بحيث يتم راسخ الأنبوب في موقعه الحالي. وينبغي أن يكون الباحث صعوبة في العثور على خلايا fluorescently قبل المسمى هو مبين في الشكل 8 بعد explantation في أنبوب البراءات خلاف ذلك ، فمن المرجح أن الخلايا قد خلع كورقة متماسكة. ويمكن منع ذلك من خلال تشريح لطيف جدا من الوريد ديس المجاورة والتجميع من المقاطع 3 أنبوب تي ، بعد تحديد السياق مع الأنبوب.

لدينا التكنولوجيا يوفر إثبات صحة مفهوم لمنع تخثر الأوعية الدموية عن طريق جهاز EPC - البذر. ويمكن استخدام هذه التكنولوجيا في تطوير زراعة "الاحيائية" اصطف مع المرضى أنفسهم الخلايا البطانية السلف. دراسة الجدوى في نموذجنا حيوان الخنزير تنص على الخطوات الأولى نحو ترجمة هذه "الطب شخصية" في الممارسة السريرية.

Disclosures

الإعلان عن أي تضارب في المصالح.

Acknowledgments

فإن الكتاب أود أن أشكر لايكا مايكروسيستمز لنصائحهم القيمة على أقسام التصوير والتيتانيوم الجوزاء المنتجات الحيوية لتوفير المصل الخنزير المستخدمة في هذه الدراسة. نود أيضا أن نشكر المعهد الوطني للصحة للحصول على الدعم من خلال المنح "بطانة EPC ذاتي لتحسين الدورة الدموية للتوافق مع الحياة مساعدة الأجهزة" ، RC1HL099863 - 01. كذلك ، ونحن ممتنون للدعم المؤسسة الوطنية للعلوم بحوث الدراسات العليا للزمالة Jantzen الكسندرا. نود أيضا أن نشكر جورج السريع ، ولوي مايك باركر Ianthia للمساعدة في جوانب عديدة من عملية جراحية ومعالجة الحيوانات أبحاثنا. وقد ستيفن أوين لا تقدر بثمن في أجزاء كثيرة من الجهاز الآلي لدينا البذر وقطع أنابيب التيتانيوم.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Acepromazine Boehringer Ingeheim BIC670025 NAC# 10280002
Alconox Powered Precision Cleaner Alconox, Inc. 1104
Balfour Surgical Retractor Adler N/A
Baytril Bayer AG APVMA 46028/0705
Butterfly Needle (19G) Terumo Medical Corp. SV19CLK
Chlorhexidine 3M 9200
Clamps (45-degree) Aesculap FC339T
DPBS (-/-) GIBCO, by Life Technologies 14190-144
DPBS (+/+) GIBCO, by Life Technologies 14040-133
DuraPrep 3M 8635
EBM-2 Medium Lonza Inc. CC-3156 Base for both serum free and full growth medium
EGM-2 SingleQuots Lonza Inc. CC-3162 Used with EBM-2 for both serum free and full growth medium
Electrocautery Tool Valleylab SurgII-20
Emery Cloth 3M 60-0700-0425-8 240 grit
Euthasol Euthanasia Solution Virbac Animal Health ANADA #: 200-071
Fentanyl Patch Actavis NDC # 67767-120-18
Flunixin Merck & Co. NAC #: 10470183
Foley Catheter (16F) Bard 730116
HBSS Sigma-Aldrich H8264-500ML
Heat Gun Milwaukee 8988-20
Heparin NDC #: 25021
Histopaque-1077 Sigma-Aldrich H8889-500ML
Intubation Tube Mallinckrodt Baker Inc. 86113
Isoflurane MWI Veterinary Supply NDC #13985-030
IV Catheter (18G) BD Biosciences 381547
Ketamine Fort Dodge Animal Health NDC #0856-2013
Level Swanson LLA001
Luer-Lock tip cap CML Supply 909-001
Marcaine Hospira Inc. NDC #: 0409-1560-10
Metzenbaum Scissors Adler N/A
Micro-introducer (5F) Galt KIT 002-01
Mosquito Forceps Adler N/A
Motor Herbach and Rademan H1-08
Oxymorphone Endo Labs NDC: 63481-624-10
PKH26 Dye Kit Sigma-Aldrich PKH26GL-1KT
Porcine Serum Gemini Bio Products 100-115 2% concentration in full growth medium
Potts Scissors Adler N/A
Precise Vista Skin Stapler 3M 3998
PVC Tubing McMaster-Carr 7132K117 expanded ID 15.88 mm,
recovered ID 7.95 mm
Right Angle Medium Size Adler N/A
Scalpel Blade (#10-15) Bard 373910
Silicone Tubing McMaster-Carr 51735K26 16.64 mm OD, 9.52 mm ID
Syringe (5 cc) BD Biosciences 309603
Tegaderm 3M 90001
Three-way Stopcock Kendall 170060
Ti Tube Tico Titanium N/A Specified as ½" OD, .065" wall, .370" ID, .1737 lbs/ft
Trypsin Lonza Inc. CC-5012
Trypsin Neutralizing Solution (TNS) Lonza Inc. CC-5002 0.03%
Vetropolycin Pharmaderm Animal Health NAC #: 12920110
Vicryl Suture (3-0) Ethicon Inc. J808T
Water Bath Sonicator Branson B200

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Achneck, H. E. Pathophysiology of bleeding and clotting in the cardiac surgery patient: from vascular endothelium to circulatory assist device surface. Circulation. 122, 2068-2077 (2010).
  2. Achneck, H. E., Sileshi, B., Lawson, J. H. Review of the biology of bleeding and clotting in the surgical patient. Vascular. 16, 6-13 (2008).
  3. Arvidsson, S., Askendal, A., Tengvall, P. Blood plasma contact activation on silicon, titanium and aluminium. Biomaterials. 28, 1346-1354 (2007).
  4. Achneck, H. E. The biocompatibility of titanium cardiovascular devices seeded with autologous blood-derived endothelial progenitor cells: EPC-seeded antithrombotic Ti Implants. Biomaterials. 32, 10-18 (2011).
  5. Kang, C., Bonneau, M., Brouland, J. P., Bal dit Sollier, C., Drouet, L. In vivo pig models of venous thrombosis mimicking human disease. Thromb Haemost. 89, 256-263 (2003).
  6. Ueberrueck, T. Comparison of the ovine and porcine animal models for biocompatibility testing of vascular prostheses. J Surg Res. 124, 305-311 (2005).
  7. Velik-Salchner, C. Normal values for thrombelastography (ROTEM) and selected coagulation parameters in porcine blood. Thromb Res. 117, 597-602 (2006).
  8. Yoder, M. C. Redefining endothelial progenitor cells via clonal analysis and hematopoietic stem/progenitor cell principals. Blood. 109, 1801-1809 (2007).
  9. Achneck, H. E. American Heart Association Scientific Sessions, Abstract Oral Sessions, Medical Aspects End Stage Heart Failure: Transplantation and Device Therapies. (2010).
  10. Achneck, H. E. Regenerating titanium ventricular assist device surfaces after gold/palladium coating for scanning electron microscopy. Microsc Res Tech. 73, 71-76 (2010).
  11. Ford, J. W., Welling, T. H., Stanley, J. C., Messina, L. M. PKH26 and 125I-PKH95: characterization and efficacy as labels for in vitro and in vivo endothelial cell localization and tracking. J Surg Res. 62, 23-28 (1996).
غشائي ذاتي السلف الخلوي البذر التكنولوجيا واختبار توافق مع الحياة للحصول على أجهزة القلب والأوعية الدموية في نموذج حيواني كبير
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Jantzen, A. E., Lane, W. O., Gage, S. M., Haseltine, J. M., Galinat, L. J., Jamiolkowski, R. M., Lin, F., Truskey, G. A., Achneck, H. E. Autologous Endothelial Progenitor Cell-Seeding Technology and Biocompatibility Testing For Cardiovascular Devices in Large Animal Model. J. Vis. Exp. (55), e3197, doi:10.3791/3197 (2011).More

Jantzen, A. E., Lane, W. O., Gage, S. M., Haseltine, J. M., Galinat, L. J., Jamiolkowski, R. M., Lin, F., Truskey, G. A., Achneck, H. E. Autologous Endothelial Progenitor Cell-Seeding Technology and Biocompatibility Testing For Cardiovascular Devices in Large Animal Model. J. Vis. Exp. (55), e3197, doi:10.3791/3197 (2011).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter