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Bioengineering

自体内皮祖细胞播种技术和生物相容性在大动物模型的心血管设备的测试

doi: 10.3791/3197 Published: September 9, 2011

Summary

播种钛方法的血液接触与自体细胞和生物材料测试的生物相容性描述。此方法使用内皮祖细胞和钛管,手术植入分钟内接种于猪腔静脉。这种技术是适应许多其他的植入式生物医疗设备。

Abstract

植入式心血管设备制造人造材料(如钛(Ti),膨体聚四氟乙烯),构成了血栓形成 1,2,3的风险的。我们已经开发出一种方法,以符合人类或猪的自体血源性内皮祖细胞(EPCs)4钛管的内表面。通过植入含有猪内皮祖细胞在猪的下腔静脉(IVC)的融合层的钛管,我们测试的种子细胞表面的一个大型的动物模型血栓环境改善的生物相容性和,它比裸露的金属表面未修改5,6,7( 图1)。这种方法可用于endothelialize分钟内植入的设备和测试他们体内的抗血栓功能。

外周血获得50公斤约克夏猪和单核细胞比例的培养,分离出内皮祖细胞 4,8 。钛管(9.4毫米ID)被预先切分为三个4.5厘米的纵向部分,并用热缩管重组。建一个播种设备,允许钛管缓慢旋转。

我们进行了剖腹探查和外部猪小肠和膀胱。夏普和钝性分离其右侧肾动脉近端远端的分叉skeletonize从下腔静脉。钛管,然后充满10 RPH x 30分钟自体荧光标记EPC悬挂和旋转,实现统一的细胞涂层 9 。 100 USP /公斤肝素管理后,下腔静脉和腰静脉两端被夹住。一个4厘米veinotomy的执行和设备中插入和充满磷酸盐缓冲液。由于veinotomy 4-0普理灵连续缝合关闭,一个钳去除空气的下腔静脉。在该过程结束时,筋膜0 - PDS(polydioxanone缝合)近似,皮下空间封闭2-0薇乔和皮肤装订关闭。

经过3 - 21天,猪安乐死,explanted EN -块和固定设备。被拆卸的钛管,内表面用荧光显微镜成像。

我们发现,裸露的金属钛管完全闭塞,而EPC种子管仍然专利。此外,我们能够证明血液接触的内表面上的内皮祖细胞融合层。

最后,我们的技术可用于endothelialize与自体内皮祖细胞在几分钟内植入的钛管,以防止血栓的设备。我们的手术方法可用于测试改进这种经过修改的设备,用最少的失血和EPC种子表面中断的生物相容性。

Protocol

1。内皮祖细胞的分离

  1. EPC种子管植入前三十天,准备与抗凝枸橼酸葡萄糖溶液15毫升60毫升注射器,安全与3路从外围猪血EPC隔离停止公鸡。前24小时抽血,预涂两个12 - 1型大鼠胶原蛋白(50μg/ ml的,0.02 N醋酸溶液溶解)4板。
  2. 按照国家的关怀和使用实验动物的健康指引研究所和监督机构的动物护理和使用委员会批准后,才进行的所有动物的照顾和实验。
  3. 稳重的一个女的约克郡猪(45公斤)Acepromazine(1.1毫克/公斤),氯胺酮(22毫克/公斤)通过19政蝴蝶针肌肉注射。
  4. 插管与气管插管(30厘米长,8毫米ID)的猪,麻醉与异氟醚(4.5%潮气量面具)的猪。
  5. 在手术过程中,通过测量血氧饱和度,心率和温度监控猪。使用自动恒温手术台和加热毯和气候变暖注入液体,保持体温。
  6. 猪放置在上手术台的仰卧姿势,确保其后肢caudolaterally,清洁与洗必泰DuraPrep杀菌。然后进行悬垂的骨盆部位。
  7. 摹一个21 × 7厘米的针插入一个5楼微介绍人套件内侧可触及股动脉搏动的股静脉(股内侧的内侧和外侧的股薄肌)和cannulate静脉使用Seldinger技术。将准备60毫升注射器,血管内导管,并绘制了45毫升血液。
  8. 保持血管穿刺部位的压力,以达到止血(5分),停止麻醉和恢复猪。动物进行监测,直到完全恢复,并回到笼子里。
  9. 稀血与汉克的缓冲盐溶液的解决方案1:1(不含氯化钙 ,氯化镁,硫酸镁4)和等量Histopaque创造良好定义的层上的层。离心机(30分钟,740克,打破设置低)和收集的单核细胞(MNC)的层。悬浮和洗跨国公司x 3贝科的磷酸盐缓冲电镀前到两个12孔全面增长介质板(EBM - 2介质与2%猪血清(PS)和EGM - 2盐水(DPBS)(10分钟,515克) SingleQuots在)37℃,5%的CO 2。
  10. 慢慢地改变中期每24小时第7天,然后隔日。识别后的平均时间的EPC殖民地
    7天( 图2)。
  11. 扩大在文化的内皮祖细胞,一旦它们涵盖12孔的表面面积的四分之一。用流式细胞仪进行表面标志物CD31和缺乏CD14,CD45存在检测的EPC身份确认。可能进行的其他实验,包括细胞的形态和一氧化氮三活动曝光流量4。

2。钛管装配

  1. 举行的第3等于120度单位(长4.5厘米)钛管纵向与HHS的分切一个72齿锯的地方,看到在一个立式铣床乔木。运行在300转,并保持饱和塔魔术在切割液( 图3)在任何时候都切的切割面积。
  2. 波兰与砂轮机和思高金工轮的内表面。然后手动3M砂布进一步畅通,甚至表面波兰删除任何可见的坑。
  3. 王水具有很强的腐蚀性,清洁Alconox肥皂溶液的钛片,5分钟,淹没在王水(1:3浓硝酸浓盐酸),水10升冲洗,格外小心潜在爆炸危险的!
  4. 超声钛节× 16分钟Alconox肥皂溶液,在去离子水上升× 30和超声再次× 16分钟去离子水。允许干层流罩。
  5. 切PVC热缩管4.5厘米的长度,并彻底清洁每2.4。
  6. 使用镊子将其放置在一个支持芯棒(加工铝,8.5 mm外径)和地方PVC热缩管( 图4)围绕钛节套3清洗钛节。收缩管热风枪,同时转动芯轴均匀包裹体部分紧紧地握在一起。

3。播种设备和部件组装

  1. 剪下硅胶管长2.5厘米和3.5厘米。
  2. 第5毫升的塑料注射器0.8毫升,并保持与露儿结束“头件”。
  3. 彻底清洗2个硅部分,注射器的头片“和根据2.4所述的由超声露儿第。
  4. 硅胶管组装的钛管两端,从2.5 EXTEN丁PVC管材超过5毫米。
  5. 插入剪切注射器的头件“到硅胶管短,所以它紧靠钛管( 图5)。
  6. 密封完成露儿在特卫强邮袋和气体消毒与环氧乙烷(18小时在55 ° C)第一个钛管组装。
  7. 登上一个有机玻璃平台上的同步调速电机(10 RPH)和连接轴注射器持有人(加工铝,适合5毫升注射器)( 图6)

4。钛管内表面的EPC播种

  1. 展开的EPCs隔离在1到3融合的T - 75瓶(或至少有9 × 10 6细胞)。
  2. 在手术当天,长期染料(PKH26)11荧光标签的细胞。开始冲洗两次在无血清培养基培养的EPCs。注意限制光线照射到保护标签,期间和之后细胞。
  3. 盖细胞与4μm的稀释剂彗星在室温(PKH26染料溶液)4分钟。
  4. 停止标签加入相同体积的猪血清,染料溶液的反应。一分钟后,稀结合完整的生长介质的解决方案1:1。
  5. 吸液和冲洗细胞完全生长培养基× 3。
  6. 洗净的EPCs两次在DPBS(不含氯化钙 ,氯化镁2)。
  7. 盖胰蛋白酶孵育的细胞在37 ° C,3分钟和光显微镜下确认支队。添加在双重的胰蛋白酶的使用量胰蛋白酶中和解决方案。
  8. 吹打细胞结合成一个单一的管和混合解决方案。 10μL细胞液添加到每一个血球侧面进行计数。
  9. 离心机电池解决方案(1500 RPH,5分钟)。计数细胞和重新悬浮颗粒在2 - 2.5 × 10 6内皮祖细胞/ ml的无血清培养。注意:体积最小,以填补管组装为4.5毫升。
  10. 无菌巾,在无菌领域的生物罩。打开气体消毒的钛管装配和额外的5毫升注射器,进入无菌区。
  11. 用无菌手套,取出5毫升注射器的柱塞和领域保持供日后使用。鲁尔第贴上这个注射器。
  12. 吸取4.5 - 5毫升EPC暂停下4.9到开放的针筒。安全地返回到开放末端的注射器插入柱塞。
  13. 第注射器向上握住并删除第。露儿年底到打开硅胶管,钛管大会第一次插入注射器,直到温暖的;钛管内不提前。
  14. 锋注射器推杆缓慢,直到细胞溶液达到削减注射器的顶端“的头一件,”从系统中移除的气泡。关闭露儿帽,用胶带密封的开口端插入无菌鞘整个大会。
  15. 插入整个组装加工注射器持有3.7。在孵化器放置在37 ° C和调整的平台,使直播室的钛管部分是水平的,使用水位计( 6 )。
  16. 允许钛管装配旋转植入前30分钟。

5。钛管植入到猪的下腔静脉

  1. 二十四小时,在手术前,premedicate猪(从被孤立的EPCs)与芬太尼补丁(100微克/小时透皮;保持到位× 72小时的补丁)。
  2. 保持隔夜猪非营利组织和管理Baytril(恩诺沙星)术前在手术当天(5毫克/公斤,IM)和7天以下,每24小时为抗生素预防。
  3. 稳重,插管及麻醉的猪, 根据 1.3所述(潮气量10 -15毫升/公斤)和安全的猪,在手术室表仰卧位。在手术过程中,通过测量血氧饱和度,心率和温度监控猪。使用自动恒温手术台和加热毯和气候变暖注入液体,保持体温。
  4. 一个18 G静脉导管插入猪的耳静脉和保护猪的眼睛与Vetropolycin眼药水。
  5. 清洁,准备和悬垂性好猪的腹部在1.6。从乳腺第二盘#15手术刀刀片颅最后一组第二尾端切割中线。
  6. 携带的清扫腹部筋膜与电灼。
  7. 蚊虫钳提起腹膜,并小心地将其与梅岑鲍姆剪刀进入。
  8. 外部膀胱和膀胱壁放入一个3 - O薇乔荷包缝合。在它的中间放置一个刺切口,然后插入一个16架F尿管。管理静脉注射液(乳酸林格)滴定尿量> / = 1毫升/公斤/小时手术过程中。
  9. 之后,外部小及大肠癌和地方两个贝尔福手术拉钩暴露腹腔后方面,并确定下腔静脉(IVC)。
  10. 使用尖锐,钝性分离,仔细免费下腔静脉周围组织,并skeletonize从右侧肾动脉近端的下腔静脉远端的分叉处的船只。练习过程中的下腔静脉夹层格外小心,因为即使是在非常小的下腔静脉的缺陷可能导致出血和动物放血快速。
  11. 结扎下腔静脉段的所有分支,以确保将有没有被植入的钛管周围出血。注意:通常比较大,需要非常仔细解剖和结扎后腰椎静脉。此外,请注意,立即到下腔静脉分叉处近端,一个大腰静脉经常遇到的后内侧端,必须解剖自由和控制钳安置准备船只循环。
  12. 继续播种的钛管,同时根据 4 概述
  13. 管理100 USP /公斤肝素立即夹紧下腔静脉前。广场上腔静脉和腰静脉远端呈45度角手术夹具,然后近端。
  14. 创建一个纵向之间的近端和远端使用#11手术刀刀片扩展波茨剪刀夹子veinotomy(4厘米)。
  15. 撤离的下腔静脉血液和无菌DPBS冲洗内腔。
  16. 现在,下腔静脉插入EPC种子钛管(或裸机控制)和填充DPBS(氯化钙, 氯化镁 2),以防止干燥的细胞和疏散风。
  17. 4-0普理灵连续缝合关闭veinotomy和删除一个近端钳通过后出血少量空气的下腔静脉。通过静脉壁的PVC管材放置一个“留缝合”,随着时间的推移,以防止植入迁移。
  18. 2 - O薇乔(运行缝线)与O型PDS关闭筋膜的CT针和皮下空间。关闭带有订书钉的皮肤。
  19. 管理多达20毫升0.25%Marcaine(布比卡因)沿切口部位皮下,覆盖伤口,用纱布和Tegaderm。也给氟尼辛(2.2毫克/公斤Q 24小时)和羟吗啡酮(0.15毫克/公斤问3 - 4小时),皮下注射的痛苦,因为需要。
  20. 停止麻醉,监测,直到清醒的猪和返回笼。监控猪每日两次遇险/疼痛,站立和行走,粪便和尿液输出,和皮肤的颜色,表明正常灌注的迹象。

6。 Explantation的钛管

  1. 3周后,稳重,插管及麻醉如1.3中所述的猪- 1.4 。
  2. 继续在5.5描述了剖腹探查术- 5.8。
  3. 请注意,疤痕会隐瞒植入部位,但你可以触诊刚性钛管在原位。
  4. 5.9中所述的下腔静脉- 5.11解剖和植钛管与下腔静脉周围重剪块。
  5. 动物安乐死Euthasol安乐死的解决方案(390毫克/毫升的戊巴比妥钠和50毫克/毫升的苯妥英钠1毫升/ 10磅)。

7。固定和成像体的内表面

  1. 冲洗在DPBS溶液的静脉段切除钛管,并拍摄高分辨率的数码相机(图 7)流明(专利或闭塞)。
  2. 下面,修复淹没在3.7%多聚甲醛为至少15分钟的标本。在DPBS溶液冲洗标本。
  3. 非常小心地切开周围静脉和PVC管材打开钛管。与面临的目标/激发波长在550纳米光源和图像可视化PKH26 -标记的EPCs的红色/橙色(图8A)的内表面的荧光显微镜下放置3个部分。如果需要的话,细胞可进一步染色(如血小板内皮细胞粘附的标记(PECAM)染色可视化单元格边框( 图8B),DAPI染色可视化核等) 。

8。代表性的成果:

执行这个协议之后,医生和科学家能够与自体血源性内皮祖细胞在一个大的动物模型endothelialize固体筒结构图2可以看出 ,与我们的方法分离出内皮祖细胞与鹅卵石形态的菌落出现后约7天文化。我们的播种设备在图5和 6所示,允许与EPC悬挂和管内表面均匀覆盖结果充满9无菌条件下的钛管缓慢旋转。

用于测试的生物材料的倾向,如Ti,允许我们的植入手术,血栓形成一个大型的动物模型。我们发现,猪和容忍此过程,这个植入可只有很少的失血和没有EPC层破坏实现。

T“> 图7表明,裸露的钛管完全阻塞,而我们的EPC内衬管仍然专利,即使在低剪切环境下腔静脉血栓。进 ​​一步,一种荧光标记的细胞融合层的存在,证明这种方法的成功, 如图8所示。

图1
图1自体内皮祖细胞(EPC)的播种实验的原理图。首先,外周血取自猪。下一步,内皮祖细胞是从血液中分离和扩大在文化。内皮祖细胞,然后用于行钛(TI)管设备,然后从细胞中分离出相同的猪进入下腔静脉手术植入。

图2
图2,代表文化的EPCs,大约7天的隔离程序(DMIL一个倒置的徕卡显微镜成像相机和QCapture软件成像)殖民地。

图3
图3。钛管段组装前。钛管,切成3纵向平等的部分,然后切成4.5厘米长。使用砂轮机,砂布,以消除可见的坑,钛部分的内表面抛光。

图4
图4。PVC热缩管(蓝色)和热枪钛管段大会。支持TI部分加工的铝芯棒延伸通过TI部分和钛管内径的尺寸匹配。

图5
图5钛管组件,所有组件:露儿帽,注射器的头件,硅胶管,钛管与PVC包装(蓝色)。大会放在一起之前绝育手术使用。

图6
图6。孵化器钛管内播种设置,显示电机,平台,机加工铝,钛管注射器持有人大会,5毫升注射器。注:大会是为可视化的目的无菌无保护鞘所示。

图7
图7。植入手术的代表总成绩(A)控制裸露的金属钛管结束查看后,在植入猪的下腔静脉(IVC) 。管腔完全闭塞了坚实的血块,(二 )EPC种子钛管植入后的最终视图。管腔是完全的专利和明确的。(三)解剖控制视图(裸)钛管后3天的植入,显示血栓形成的程度(实验相同的结果进行了为期3个星期) 。

图8
图8。钛管表面内皮祖细胞,植入3天的(同一个堂堂正正的徕卡DMRB与QImaging QICAM显微镜成像单色数码相机和图像的Pro Plus软件)。 (一)聚合细胞表面呈现PKH26手术前的标签。 (二)聚合层的EPCs。红:PKH26手术前的标签。绿色:EPC PECAM -染色。

Discussion

细胞播种钛管这里介绍的方法,使医生和科学家,以快速和均匀endothelialize血液接触的植入装置的表面。既然我们孤立和扩大从外周血内皮祖,没有大的侵入过程是必需的收获这些细胞。此外,内皮祖细胞是自体,因此,任何免疫反应的细胞种子植入的风险被淘汰。不仅对钛管,但可以利用许多其他的生物材料,心血管内科利用他的协议中所表现出的原则。

在本议定书中的关键步骤是钛管细致的清理,我们发现任何污染物妥协细胞黏附贴壁膜。此外,一个缓慢的旋转速度(管直径成反比),是在播种过程中至关重要,这样内皮祖可以慢慢解决,并坚持到表面钛管。

我们立即播种前植入的方法避免了不切实际的体外培养时间;细胞坚持个别及后在体内形成一个融合的表,避免栓塞的可能性,如纸,紧随流重新建立。我们以前的研究表明,一旦内皮祖已成长为一个融合层,他们使他们坚定不移地坚持一个细胞外基质,另外尽量减少任何可能脱落的内皮细胞表。虽然栓塞脱离的可能性不能完全排除,这似乎是多方面的低比整个设备的表面血栓形成的风险,问题,这种疗法旨在防止。

我们的方法植入到低剪切,下腔静脉血栓环境利用研究血液相容性及血栓形成的设备5,6的一个最值得信赖的大动物模型。请注意,所有的动物护理和实验是在按照国家的关怀和使用实验动物的健康指引研究所和杜克大学机构动物护理和使用委员会的批准后,才进行。

为了成功地利用这种植入方法来测试的生物材料和设备,重要的是要耐心skeletonize下腔静脉段和结扎静脉分支血管都在准备,设备插入,如设备周围出血,没有在一个“假腔”起源。另一个关键的一步是添加到设备管腔内管表面上的细胞保持湿润,在封闭的veinotomy和再灌注前​​发起的DPBS。如果设备不能被发现在植入的位置,它可能已迁移的“上游”的下腔静脉。这是可以预防的配售缝合(4 - O普理灵)通过静脉壁,并通过2 - 3毫米的PVC管材管部分,因此是牢牢固定在其目前的位置。如果研究者有困难找到了荧光标记的细胞后,在其他专利的管explantation图8所示,它很可能作为一个统一的工作表,这些细胞已去皮。这是可以预防的很温柔的清扫周围静脉和显示3钛管段组装,后固定管静脉。

我们的技术提供了概念证明,通过EPC的播种,以防止心血管设备血栓。这项技术可用于在内衬与病人自身内皮祖细胞的“生源”植入发展。在我们的猪动物模型的可行性研究到临床实践这种“个性化药物”朝翻译的第一个步骤提供。

Disclosures

没有利益冲突的声明。

Acknowledgments

作者想感谢他们的宝贵意见成像钛节和双子座生物制品莱卡微系统提供在这项研究中所使用的猪血清。我们也想感谢授予NIH的支持“自体的EPC的衬里,以改善循环系统的生物相容性协助设备”,RC1HL099863 - 01。此外,我们为国家科学基金会研究生研究奖学金的亚历山德拉Jantzen的支持表示感谢。我们还要感谢协助手术过程中的许多方面和我们研究动物的处理,乔治快速,麦克Lowe和Ianthia帕克。史蒂芬欧文一直是无价的,在许多地方我们播种设备的加工和切割钛管。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Acepromazine Boehringer Ingeheim BIC670025 NAC# 10280002
Alconox Powered Precision Cleaner Alconox, Inc. 1104
Balfour Surgical Retractor Adler N/A
Baytril Bayer AG APVMA 46028/0705
Butterfly Needle (19G) Terumo Medical Corp. SV19CLK
Chlorhexidine 3M 9200
Clamps (45-degree) Aesculap FC339T
DPBS (-/-) GIBCO, by Life Technologies 14190-144
DPBS (+/+) GIBCO, by Life Technologies 14040-133
DuraPrep 3M 8635
EBM-2 Medium Lonza Inc. CC-3156 Base for both serum free and full growth medium
EGM-2 SingleQuots Lonza Inc. CC-3162 Used with EBM-2 for both serum free and full growth medium
Electrocautery Tool Valleylab SurgII-20
Emery Cloth 3M 60-0700-0425-8 240 grit
Euthasol Euthanasia Solution Virbac Animal Health ANADA #: 200-071
Fentanyl Patch Actavis NDC # 67767-120-18
Flunixin Merck & Co. NAC #: 10470183
Foley Catheter (16F) Bard 730116
HBSS Sigma-Aldrich H8264-500ML
Heat Gun Milwaukee 8988-20
Heparin NDC #: 25021
Histopaque-1077 Sigma-Aldrich H8889-500ML
Intubation Tube Mallinckrodt Baker Inc. 86113
Isoflurane MWI Veterinary Supply NDC #13985-030
IV Catheter (18G) BD Biosciences 381547
Ketamine Fort Dodge Animal Health NDC #0856-2013
Level Swanson LLA001
Luer-Lock tip cap CML Supply 909-001
Marcaine Hospira Inc. NDC #: 0409-1560-10
Metzenbaum Scissors Adler N/A
Micro-introducer (5F) Galt KIT 002-01
Mosquito Forceps Adler N/A
Motor Herbach and Rademan H1-08
Oxymorphone Endo Labs NDC: 63481-624-10
PKH26 Dye Kit Sigma-Aldrich PKH26GL-1KT
Porcine Serum Gemini Bio Products 100-115 2% concentration in full growth medium
Potts Scissors Adler N/A
Precise Vista Skin Stapler 3M 3998
PVC Tubing McMaster-Carr 7132K117 expanded ID 15.88 mm,
recovered ID 7.95 mm
Right Angle Medium Size Adler N/A
Scalpel Blade (#10-15) Bard 373910
Silicone Tubing McMaster-Carr 51735K26 16.64 mm OD, 9.52 mm ID
Syringe (5 cc) BD Biosciences 309603
Tegaderm 3M 90001
Three-way Stopcock Kendall 170060
Ti Tube Tico Titanium N/A Specified as ½" OD, .065" wall, .370" ID, .1737 lbs/ft
Trypsin Lonza Inc. CC-5012
Trypsin Neutralizing Solution (TNS) Lonza Inc. CC-5002 0.03%
Vetropolycin Pharmaderm Animal Health NAC #: 12920110
Vicryl Suture (3-0) Ethicon Inc. J808T
Water Bath Sonicator Branson B200

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Jantzen, A. E., Lane, W. O., Gage, S. M., Haseltine, J. M., Galinat, L. J., Jamiolkowski, R. M., Lin, F., Truskey, G. A., Achneck, H. E. Autologous Endothelial Progenitor Cell-Seeding Technology and Biocompatibility Testing For Cardiovascular Devices in Large Animal Model. J. Vis. Exp. (55), e3197, doi:10.3791/3197 (2011).More

Jantzen, A. E., Lane, W. O., Gage, S. M., Haseltine, J. M., Galinat, L. J., Jamiolkowski, R. M., Lin, F., Truskey, G. A., Achneck, H. E. Autologous Endothelial Progenitor Cell-Seeding Technology and Biocompatibility Testing For Cardiovascular Devices in Large Animal Model. J. Vis. Exp. (55), e3197, doi:10.3791/3197 (2011).

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