Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove

Bioengineering

עצמיים אבי האנדותל Cell-מתזמן טכנולוגיה בדיקה biocompatibility עבור התקנים לב וכלי דם במודל חיה גדולה

doi: 10.3791/3197 Published: September 9, 2011

Summary

שיטה טיטניום זריעת דם biomaterials ליצור קשר עם תאים עצמיים ו biocompatibility בדיקות מתואר. שיטה זו משתמשת ובתאים אנדותל צינורות טיטניום, זורעים בתוך דקות של ניתוח ההשתלה לתוך חזירי venae cavae. טכניקה זו ניתנת להתאמה מכשירים רבים אחרים ביו מושתלת.

Abstract

מכשירים מושתלת הלב וכלי הדם מיוצרים מחומרים מלאכותיים (כגון טיטניום (TI), הרחיבה polytetrafluoroethylene), אשר מהווים את הסיכון של היווצרות thromboemboli 1,2,3. פיתחנו שיטה לקו המשטח הפנימי של שפופרות טי עם עצמיים דם שמקורם בתאים אנושיים או חזירי אבי האנדותל (EPCs) 4. ידי השתלת צינורות טי המכיל שכבת ומחוברות של EPCs חזירי ב נחות הווריד הנבוב (IVC) של חזירים, בדקנו את biocompatibility משופרת של שטח פני התא, וזרע בסביבה prothrombotic במודל חיה גדולה והשווה אותה ללא שינוי משטחי מתכת חשוף 5,6,7 (איור 1). שיטה זו יכולה לשמש endothelialize התקנים תוך דקות ההשתלה מבחן תפקוד antithrombotic שלהם in vivo.

דם היקפיים התקבל 50 ק"ג יורקשייר החזירים שבר תא mononuclear שלה תרבותי לבודד EPCs 4,8. טי צינורות (9.4 מזהה מ"מ) היו מראש לחתוך לשלושה חלקים 4.5 ס"מ אורך ו מחדש עם צינורות חום להתכווץ. מכשיר זריעת נבנה, אשר מאפשר סיבוב איטי של צינורות טי.

ביצענו laparotomy על חזירים ועל מוחצן במעי ואת שלפוחית ​​השתן. דיסקציה שארפ ובוטה שימש skeletonize IVC מתוך הסתעפות דיסטלי אל עורק הכליה הימנית הפרוקסימלי שלו. צינורות טי היו מלאים אז עם fluorescently שכותרתו עצמיים ההשעיה וסובב EPC ב 10 דקות RPH 30 x להשיג מדים תא ציפוי 9. לאחר מתן הפרין USP / ק"ג 100, בשני הקצוות של IVC ווריד המותני היו לכודים. Veinotomy 4 ס"מ בוצע המכשיר מוכנס ומלא פוספט שנאגרו מלוחים. ככל veinotomy נסגר עם תפר Prolene 4-0 ריצה, אחד מהדק הוסר דה האוויר IVC. בסוף ההליך, fascia היה מקורב עם 0-PDS (polydioxanone תפר), שטח סגור תת עורית עם Vicryl 2-0 והעור מהודקים סגור.

אחרי 3 - 21 יום, חזירים היו מורדמים, המכשיר explanted en-בלוק קבוע. צינורות טי היו מפורקים המשטחים הפנימיים צילמו באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי.

מצאנו כי צינורות מתכת חשוף טי occluded מלא ואילו EPC-seeded צינורות נשאר פטנט. יתר על כן, הצלחנו להדגים שכבה ומחוברות של EPCs על פני דם פנייה פנימה.

לסיכום, הטכנולוגיה שלנו יכולה לשמש endothelialize צינורות טי בתוך דקות של ההשתלה עם EPCs עצמיים כדי למנוע פקקת של המכשיר. השיטה שלנו מאפשרת ניתוח לבדיקת biocompatibility משופרת של מכשירים שונה כגון עם איבוד דם מינימלי EPC-seeded שיבוש פני השטח.

Protocol

1. אבי האנדותל תא הבידוד

  1. שלושים ימים לפני ההשתלה EPC-seeded צינור, להכין מזרק 60 מ"ל עם 15 מ"ל של תמיסת ציטרט קרישה דקסטרוז ובטוחה עם הזין 3-בדרך לעצור בידוד EPC מן הדם ההיקפיים חזיר. 24 שעות לפני לשאוב את הדם, precoat 12-two גם צלחות עם קולגן סוג 1 עכברוש (50 מיקרוגרם / מ"ל, מומס 0.02 N פתרון חומצה אצטית) 4.
  2. התנהגות כל טיפול בבעלי חיים ניסויים בהתאם המכון הלאומי לבריאות הנחיות לטיפול ושימוש בחיות מעבדה ורק לאחר אישור ופיקוח טיפול בבעלי חיים מוסדיים ועדת שימוש.
  3. שלווים נקבה יורקשייר חזיר (45 ק"ג) עם Acepromazine (1.1 מ"ג / ק"ג) ו קטמין (22 מ"ג / ק"ג) תוך שרירית באמצעות מחט 19 G פרפר.
  4. לצנרר החזיר עם צינור endotracheal (30 ס"מ אורך, 8 מזהה מ"מ) להרדים חזיר עם Isoflurane (4.5% מכלל נפח גאות על ידי מסכה).
  5. צג את החזיר במהלך ההליך על ידי מדידת ריווי חמצן, קצב לב וטמפרטורה. שמור thermoregulation באמצעות שולחן הפעלה אוטומטית מחוממת שמיכה חימום על ידי ההתחממות הנוזלים רווי.
  6. מניחים את חזיר בעמדה פרקדן על שולחן הניתוחים, מאובטח הגפיים האחוריות caudolaterally, ולנקות עם chlorhexidine ואחריו DuraPrep עיקור. ואז להמשיך עם ומקשטות את אזור האגן.
  7. הכנס G 21 x 7 מחט ס"מ ערכת 5 מיקרו ההיכרויות F המדיאלי רק דופק הירך מוחשית (המדיאלי של medialis vastus ו לרוחב השריר gracilis) לתוך וריד הירך ואת cannulate את הווריד באמצעות טכניקה Seldinger. חבר את מזרק מוכן 60 מ"ל ל הקטטר intravascular ולהסיק 45 מ"ל של דם.
  8. החזק את הלחץ על האתר כלי לנקב להשיג hemostasis (5 דקות), להפסיק את ההרדמה ולשחזר את החזיר. החיה היא במעקב עד להחלמה מלאה וחזרה לכלוב שלה.
  9. פתרון לדלל את הדם 01:01 עם פתרון שנאגרו של האנק מלח (ללא CaCl 2, MgCl 2, MgSO 4) שכבת על כמויות שוות של Histopaque כדי ליצור שכבות מוגדרים היטב. צנטריפוגה (30 דקות, 740 גרם, הגדרת לשבור נמוך) ולאסוף תא שכבת mononuclear (MNC). Resuspend ולשטוף MNCs x 3 עם פוספט של Dulbecco שנאגרו מלוחים (DPBS) (10 דק ', 515 גר') לפני ציפוי לשתי -12 גם צלחות בינוני צמיחה מלא (EBM-2 בינוני עם 2% חזירי סרום (PS) ו EGM-2 SingleQuots) בשעה 37 ° C, 5% CO 2.
  10. לאט לאט לשנות בינוני כל 24 שעות במשך 7 הימים הראשונים, ולאחר מכן בכל יום אחר. זיהוי מושבות EPC לאחר זמן ממוצע
    של 7 ימים (איור 2).
  11. הרחב EPCs בתרבות פעם הם מכסים שטח של ¼ 12-היטב את פני השטח. אישור זהות EPC עם cytometry זרימה על ידי בדיקת נוכחות סמנים משטח CD31 והיעדר CD14, CD45. מבחני אחרים שעלולים להתבצע כוללים מורפולוגיה תאים תחמוצת החנקן פעילות השלישי לאחר חשיפה לזרום 4.

2. טיטניום הרכבה צינור

  1. סעיף צינור טי longitudinally לתוך 120 מעלות 3 יחידות שוות (4.5 ס"מ) עם 72 שיניים HHS שיסוף ראה מוחזק במקום על ידי סוכת ראה מכונת כרסום אנכי. הפעל אותו סל"ד 300 ולשמור את האזור חיתוך רווי נוזלים קסם חיתוך הקש בכל עת במהלך לחתוך (איור 3).
  2. הפולנים את פני השטח הפנימי עם מטחנת ספסל וגלגל Scotch-Brite מתכת. ואז ללטש ידנית עם בד שמיר 3M על משטח חלק יותר וגם כדי להסיר כל בורות גלוי.
  3. נקו את החלקים טי עם תמיסת סבון Alconox, ואחריו 5 דקות והשקיעה Regia אקווה (01:03 חומצה חנקתית מרוכזת כדי חומצה הידרוכלורית מרוכזת), ואחריו שטיפה עם כמה ליטרים של מים 10. נהג במשנה זהירות קיצוניים כמו Regia אקווה הוא מאכל מאוד נפיצה!
  4. Sonicate סעיפים טי x 16 דקות בתמיסת סבון Alconox, עלייה x 30 במים deionized ו sonicate שוב x 16 דקות במים deionized. ייבוש במנדף זרימה למינרית.
  5. גזור PVC חום לכווץ צינורות באורך 4.5 ס"מ ולנקות ביסודיות לכל 2.4.
  6. השתמש פינצטה למקום 3 חלקים לניקוי טי אל mandrel תומכת (במכונה מאלומיניום, 8.5 מ"מ OD) ו שרוול במקום צינורות חום להתכווץ PVC סביב הסעיפים טי (איור 4). הפסיכולוג צינורות עם אקדח חום תוך כדי הפיכת mandrel שווה לעטוף חלקים טי בחוזקה.

3. מתזמן התקן הרכבה רכיב

  1. חותכים צינורות סיליקון לאורך של 2.5 ס"מ ו -3.5 ס"מ.
  2. סעיף 5 סמ"ק מזרק פלסטיק סימן 0.8 מ"ל ולשמור "חתיכת ראש" עם סיום luer.
  3. לנקות ביסודיות סעיפים 2 x סיליקון, "חתיכת ראש" מזרק וכובע luer ידי sonication כמתואר תחת 2.4.
  4. הוסף צינורות סיליקון לסיים כל התאספו טי צינור מ 2.5, extenדינג ידי 5 מ"מ מעל צינורות PVC.
  5. הכנס לחתוך סוף "חתיכת ראש" מזרק לתוך צינורות סיליקון קצר, כך abuts טי שפופרת (איור 5).
  6. חותם סיים הרכבה טי צינור עם כובע one luer בכיס Tyvek וגז לעקר עם אתילן אוקסיד (18 שעות ב 55 ° C).
  7. הר מנוע תזמון סינכרוני (10 RPH) על גבי פלטפורמת פרספקס ולהתחבר הציר שלה מחזיק מזרק (במכונה מתוך אלומיניום, מתאים מזרק 5 סמ"ק) (איור 6).

4. EPC-זריעת המשטח טי הצינור הפנימי

  1. הרחב EPCs כמו מבודד תחת 1. ל 3 ומחוברות T-75 צלוחיות (או לפחות 9 x 10 6 תאים).
  2. ביום הניתוח, fluorescently תאים תווית עם צבע לטווח ארוך (PKH26) 11. בגין על ידי שטיפה EPCs תרבותי פעמיים מדיום חופשי בסרום. זהירות להגביל חשיפה לאור כדי להגן על התאים במהלך ואחרי תיוג.
  3. כיסוי תאים עם מיקרומטר 4 PKH26 ב diluent C (פתרון צבע) בטמפרטורת החדר למשך 4 דקות.
  4. עצור תיוג התגובה על ידי הוספת סרום חזירי בנפח שווה לצבוע את הפתרון. אחת דקות מאוחר יותר, לדלל פתרון משולב 01:01 עם צמיחה בינוני מלא.
  5. לשאוב נוזלים לשטוף x 3 תאים בינוניים עם צמיחה מלאה.
  6. לשטוף EPCs פעמיים DPBS (ללא CaCl 2, MgCl 2).
  7. כיסוי תאים טריפסין ו לדגור על 37 מעלות צלזיוס במשך 3 דקות לאשר ניתוק תחת מיקרוסקופ אור. הוסף פתרון טריפסין נטרול בנפח כפול של טריפסין בשימוש.
  8. שילוב פתרונות סלולריים לתוך צינור לערבב יחיד על ידי pipetting. הוסף 10 μl של פתרון התא לתוך צד של hemocytometer עבור הספירה.
  9. תא צנטריפוגה פתרון (1500 RPH, 5 דקות.). ספירת תאים ו resuspend גלולה בשעה 2-2.5 x 10 6 EPCs / מ"ל במדיום חופשי בסרום. הערה היקף מינימלי כדי למלא את מכלול צינור 4.5 מ"ל.
  10. פריסת מגבת סטרילית במנדף ביולוגי עבור שדה סטרילי. פתיחת גז עיקור הרכבה טי הצינור מזרק 5 סמ"ק נוסף למגרש סטרילי.
  11. עם כפפות סטריליות, להסיר את הבוכנה של מזרק 5 סמ"ק ולשמור על המגרש לשימוש מאוחר יותר. להטביע luer כובע כדי מזרק זה.
  12. Pipet 4.5-5 מ"ל ההשעיה EPC תחת 4.9 לתוך חבית לפתוח את המזרק. הכנס הבוכנה בבטחה אל הקצה הפתוח של המזרק.
  13. החזק מזרק עם הכובע כלפי מעלה והסר כובע. הכנס מזרק עם סיום luer הראשון לתוך צינורות סיליקון פתוח של הרכבה צינור טי עד צמוד, לא להתקדם בתוך צינור טי.
  14. מזרק מראש הבוכנה באיטיות עד פתרון התא מגיע העליון של המזרק לחתוך "חתיכה ראש," הסרת בועות מהמערכת. סגור עם כובע luer והכנס הרכבה שלם לתוך מעטפת סטרילית, איטום סוף פתוח עם הקלטת.
  15. הכנס הזה הרכבה שלם לתוך מזרק בעל במכונה של 3.7. מקום החממה ב 37 ° C ו להתאים את הפלטפורמה כך חלק צינור טי של החדר הוא זריעת ברמה, באמצעות מד מפלס המים (איור 6).
  16. לאפשר הרכבה טי צינור לסובב 30 דקות לפני ההשתלה.

5. השרשה של טי צינור לתוך הווריד הנבוב חזירי נחות

  1. עשרים וארבע שעות לפני הניתוח, premedicate את החזיר (שממנו EPCs היו מבודדים) עם תיקון פנטניל (100 מיקרוגרם / hr העור, לשמור על טלאי במקום x 72 שעות).
  2. שמור חזיר העמותה לילה ולנהל Baytril (Enrofloxacin) לפני הניתוח ביום הניתוח (5 מ"ג / ק"ג, IM) עבור 7 הימים הבאים, כל 24 שעות כמו טיפול מונע אנטיביוטי.
  3. שלווים, לצנרר ו להרדים את החזיר כמתואר תחת 1.3 (נפח אדיר של 10 -15 מ"ל / ק"ג) ולאבטח את חזיר בעמדה פרקדן על השולחן בחדר הניתוח. צג את החזיר במהלך ההליך על ידי מדידת ריווי חמצן, קצב לב וטמפרטורה. שמור thermoregulation באמצעות שולחן הפעלה אוטומטית מחוממת שמיכה חימום על ידי ההתחממות הנוזלים רווי.
  4. הכנס קטטר 18 G IV לווריד האוזן של חזיר ולהגן על עיניו של חזיר עם טיפות Vetropolycin העין.
  5. נקי, הכנה ולתלות הבטן של חזיר כמו 1.6. לחתוך את קו האמצע עם להב # 15 אזמל מהמערך 2 של בלוטות החלב cranially על 2 כדי להגדיר caudally האחרון.
  6. קח את הנתיחה עד fascia הבטן עם electrocautery.
  7. הרם את הצפק עם מלקחיים יתוש, ובזהירות להיכנס אליו עם מצנבאום מספריים.
  8. מחצינים את שלפוחית ​​השתן למקום 3-O Vicryl ארנק מיתרים תפר בקיר שלפוחית ​​השתן. מקום חתך דקירה באמצע שלה להכניס קטטר 16 F פולי. ניהול עירוי נוזלים (האצבעות לקטט) כדי לכיל את הפלט שתן> / = 1 מ"ל / ק"ג / שעה במהלך הניתוח.
  9. בעקבות, מחצינים את המעי קטנים וגדולים למקם שני retractors בלפור כירורגי כדי לחשוף את הפן האחורי של חלל הצפק ולזהות את הנחות הווריד הנבוב (IVC).
  10. שימוש לנתיחה חדה ובוטה, בזהירות לשחרר את IVC מ לרקמות ו skeletonize כלי מעורק הכליה הימנית בקרבה הסתעפות של IVC דיסטלי. תרגיל במשנה זהירות במהלך דיסקציה IVC כמו גם פגם קטן מאוד של IVC עלול להוביל לדימום exsanguination מהירה של החיה.
  11. ולקשור את כל ענפי הצד של המגזר IVC על מנת להבטיח כי לא יהיה דימום סביב הצינור Ti להיות מושתל. שים לב גדול בדרך כלל שני ורידים המותני האחורי הדורשים דיסקציה זהירה מאוד קשירת. יתר על כן, מציינים כי הפרוקסימלי מיד הסתעפות של IVC, וריד גדול המותני הוא נתקל בדרך כלל בצד posteromedial ויש גזור חינם ומבוקר עם לולאות כלי כהכנה מיקום מהדק.
  12. המשך זריעת הצינור טי במקביל כמתואר תחת 4.
  13. ניהול 100 USP / ק"ג של הפרין מיד לפני clamping IVC. מקום 45 מעלות זווית מהדק כירורגי distally על IVC ועל וריד המותני ולאחר מכן proximally.
  14. צור veinotomy האורך (4 ס"מ) בין מהדק הפרוקסימלית ומ דיסטלי באמצעות להב # 11 אזמל ואחריו סיומת פוטס עם מספריים.
  15. לפנות כל הדם מן IVC ולשטוף לומן הפנימי שלה עם DPBS סטרילית.
  16. עכשיו להכניס את EPC-seeded טי צינור (או פקד מתכת חשופה) לתוך IVC ולמלא אותו DPBS (עם 2 CaCl, MgCl 2) כדי למנוע את התאים מפני ייבוש לפנות האוויר.
  17. סגור את veinotomy עם תפר Prolene 4-0 ריצה להסיר אחד מהדק בקרבה דה באוויר IVC באמצעות כמות קטנה של דימום גב. הנח "להישאר-תפר" דרך הקיר לתוך וריד צינורות PVC כדי למנוע הגירה של השתל לאורך זמן.
  18. סגור את fascia עם O-PDS על מחט CT ו החלל תת עורית עם 2-O Vicryl (ריצה התפרים). סגור את העור עם סיכות.
  19. ניהול של עד 20 מ"ל של Marcaine 0.25% (Bupivacaine) תת עורית לאורך באתר חתך ולכסות את הפצע עם גזה Tegaderm. כמו כן לתת Flunixin (2.2 מ"ג / ק"ג ש 24 שעות) ו Oxymorphone (0.15 מ"ג / ק"ג ש 3-4 שעות) תת עורי כנדרש על הכאב.
  20. הפסק הרדמה, לפקח על חזיר עד ער לחזור לכלוב. צג חזיר פעמיים ביום למשך סימנים של עמידה, מצוקה / כאב ambulation, שרפרף השתן, וצבע עור המציין זלוף נורמלי.

6. Explantation של טי צינור

  1. לאחר 3 שבועות, שקט ורגוע, לצנרר ו להרדים את החזיר כמתואר 1.3-1.4.
  2. המשך laparotomy כמתואר 5.5-5.8.
  3. שים לב הצטלקות יסתיר את האתר שתל אבל אתה יכול למשש את צינור נוקשה טי באתרם.
  4. לנתח את IVC כמתואר 5.9-5.11 ו explant הצינור Ti en-לחסום עם IVC סביב במספריים כבדים.
  5. להרדימו עם פתרון המתת חסד Euthasol (390 מ"ג / מ"ל ​​נתרן Pentobarbital ו 50 מ"ג / מ"ל ​​פניטואין נתרן בכל מ"ל 1 / 10 ק"ג).

7. קיבוע הדמיה פני השטח הפנימי טי

  1. שוטפים את מגזר וריד נכרת עם צינור טי בפתרון DPBS ולצלם לומן שלה (פטנט או occluded) עם מצלמה דיגיטלית ברזולוציה גבוהה (איור 7).
  2. בעקבות, לתקן את הדגימה על ידי והשקיעה paraformaldehyde 3.7% עבור מינימום של 15 דקות. יש לשטוף את הדגימה בתמיסת DPBS.
  3. בזהירות לחתוך את הווריד סביב צינורות PVC כדי לפתוח את צינור טי. מניחים את 3 הסעיפים תחת מיקרוסקופ פלואורסצנטי עם משטחים בתוך מול המטרה / מקור התמונה תחת אור באורך גל 550 ננומטר עירור לדמיין PKH26 שכותרתו EPCs בצבע אדום / כתום צבע (איור 8 א). אם תרצה, תאים יכולים להיות מוכתם נוסף (למשל הידבקות טסיות תא האנדותל מרקר (PECAM)-כתם לדמיין גבולות תאים (איור 8B), DAPI-כתם לדמיין גרעינים וכו ').

8. נציג התוצאות:

בעקבות הוצאתו להורג של פרוטוקול זה, רופאים, מדענים מסוגלים endothelialize מבנים צינור מוצק עם דם שמקורם בתאי אב עצמיים אנדותל במודל חיה גדולה. איור 2 מראה כי EPCs מבודד עם השיטה שלנו מופיעים מושבות עם מורפולוגיה המרוצף לאחר כ 7 ימים תרבות. מכשיר זריעת שלנו מאויר באיורים 5 ו -6 מאפשר סיבוב איטי של צינורות טי מלאים ההשעיה ואת התוצאות EPC בכיסוי אחיד של המשטח הפנימי של הצינור בתנאים סטריליים 9.

ניתוח ההשתלה שלנו מאפשר לבחון את הנטייה של biomaterials, כגון Ti, עבור פקקת במודל חיה גדולה. מצאנו כי חזירים לסבול הליך זה טוב כי זה ההשתלה יכולה להיות מושגת רק עם אובדן דם מינימלית ללא הפרעה שכבת EPC.

t "> איור 7 מראה כי צינור חשוף טי חוסם לחלוטין, ואילו צינור EPC מצופה שלנו נשאר פטנט אפילו בסביבה גזירה prothrombotic הנמוכה של נחות הווריד הנבוב. יתר על כן, נוכחות של שכבה של תאים ומחוברות fluorescently שכותרתו מאשרת את ההצלחה של שיטה זו כפי שמוצג באיור 8.

איור 1
באיור 1. סכמטי של תא האנדותל עצמיים הניסוי אבי זריעת (EPC). ראשית, דם היקפיים שאוב חזיר. בשלב הבא, EPCs מבודדים מהדם והרחיב בתרבות. EPCs משמשים לקו התקן (TI) טיטניום צינור, אשר לאחר מכן מושתל בניתוח לתוך הווריד הנבוב נחות של חזיר שממנו בודדו תאים.

איור 2
איור 2. המושבה נציג EPCs בתרבות, כ 7 ימים בעקבות הליך בידוד (הדמיה עם מיקרוסקופ הפוך DMIL לייקה עם הדמיה מצלמה ותוכנה QCapture).

איור 3
3. איור צינור טי חלקים לפני הרכבה. צינורות טי הוא חתך לתוך 3 חלקים שווים longitudinally, לחתוך ואז אורך 4.5 ס"מ. משטחים חלקים פנימיים של טי הם מלוטש באמצעות מטחנת ספסל בד שמיר כדי להסיר בורות גלוי.

איור 4
איור 4. העצרת סעיפים טי צינור עם צינורות חום להתכווץ PVC (כחול) ואת אקדח החום. סעיפים טי נתמכים על mandrel אלומיניום במכונה המשתרע דרך סעיפים טי וגפרורים ממדי קוטר הצינור הפנימי טי.

איור 5
איור 5 הרכבה צינור טיטניום, מראה את כל הרכיבים:. Luer כובע, "חתיכת ראש," המזרק צינורות סיליקון, צינור PVC לעטוף עם טי (כחול). העצרת היא להרכיב לפני עיקור לשימוש כירורגית.

איור 6
איור 6. זריעת טי הצינור ההתקנה בתוך אינקובטור, מראה מנוע, פלטפורמה, במכונה מזרק בעל אלומיניום, הרכבה טי צינור, ואת מזרק 5 סמ"ק. הערה: העצרת מוצג ללא נדן סטרילי מגן למטרות ויזואליזציה.

איור 7
איור 7. ברוטו נציג תוצאות של ניתוח ההשתלה. (א) קצה צינור לאור השליטה חשופים טי מתכת לאחר ההשתלה של חזירי נחות הווריד הנבוב (IVC). Tube לומן הוא occluded מלא עם קריש דם מוצק. (ב) קצה צינור לאור Ti-EPC seeded לאחר ההשתלה. Tube לומן הוא פטנט באופן מלא וברור. (ג) להציג גזור השליטה (חשוף) צינור טי לאחר ההשתלה 3 יום, מראה היקף פקקת (ניסויים נערכו עד משך 3 שבועות עם תוצאות זהות).

איור 8
איור 8. EPCs על פני צינור טי הבאה ההשתלה 3 ביום (הדמיה עם מיקרוסקופ זקוף DMRB לייקה עם QICAM QImaging מונוכרום מצלמה דיגיטלית Image Pro Plus תוכנה). (א) בתאים ומחוברות על פני השטח מראה PKH26 טרום ניתוח תיוג. (ב) שכבת ומחוברות של EPCs. אדום: PKH26 טרום ניתוח תיוג. גרין: EPC PECAM-הכתם.

Discussion

השיטה של ​​התא זריעת צינורות טי המוצג כאן מאפשר רופאים ומדענים במהירות אחידה endothelialize דם פנייה פני השטח של מכשירים להשתלה. מכיוון שאנו לבודד להרחיב EPCs מתוך דגימות דם היקפיים, הליך לא פולשני הגדולות נדרש קציר תאים אלה. יתר על כן, EPCs הם עצמיים, ולכן את הסיכון של כל תגובה חיסונית להשתיל תאים seeded מסולקת. עקרונות הפגינו פרוטוקול שלו יכול להיות מנוצל לא רק צינורות טי, אבל biomaterials רבים אחרים, אשר מנוצלים ברפואה לב וכלי דם.

צעדים קריטיים בפרוטוקול זה ניקוי קפדני של צינורות טי, כפי שמצאנו שכל הסרט חסיד של דבקות פשרות המזהם התא. יתר על כן, מהירות סיבוב איטי (ביחס הפוך בקוטר הצינור) חיוני בתהליך זריעה, כגון EPCs שיכולים להתיישב לאט לדבוק פני השטח כמו צינור טי נע.

השיטה שלנו של זריעת מיד לפני ההשתלה נמנעת מעשי vivo לשעבר פעמים ותרבות; תאים לדבוק בנפרד ולאחר מכן טופס גיליון ומחוברות in vivo, למנוע את האפשרות של אמבוליזציה כסיד מיד לאחר הקמתה מחדש של תזרים. מחקרים קודמים שלנו מראים כי פעם EPCs גדלו לשכבה ומחוברות, הם עושים מטריצה ​​חוץ תאית שבה הם דבקים בחוזקה, בנוסף מזעור כל נשל אפשרי של גיליון האנדותל. למרות האפשרות של ניתוק תסחיפי לא ניתן לשלול לחלוטין החוצה, נראה שזה סיכון נמוך יותר מאשר multifold פקקת של פני השטח את המכשיר כולו, הבעיה שזה טיפול נועד למנוע.

הגישה שלנו של ההשתלה לתוך גזירה נמוכה, סביבה prothrombotic של נחות הווריד הנבוב מנצל אחד הדגמים האמינים ביותר חיה גדולה למחקר תאימות דם ופקקת של מכשירים 5,6. שים לב כי כל טיפול בבעלי חיים לניסויים נערך בהתאם המכון הלאומי לבריאות הנחיות לטיפול ושימוש בחיות מעבדה ורק לאחר אישור של הדוכס טיפול בבעלי חיים באוניברסיטת מוסדיים ועדת שימוש.

על מנת לנצל בהצלחה בשיטה זו כדי לבדוק את ההשתלה biomaterials והתקנים, חשוב בסבלנות skeletonize קטע IVC ו ולקשור את כל ענף כלי ורידי לקראת הכניסה המכשיר, כך שאין דימום סביב המכשיר מקורו "לומן שווא". שלב קריטי נוסף הוא תוספת של DPBS לתוך לומן מכשיר כזה התאים על פני השטח בתוך צינור להישאר לחה במהלך סגירת veinotomy ולפני reperfusion היא יזמה. אם המכשיר לא ניתן למצוא את המיקום שבו הוא מושתל, זה יכול להיות היגרו "במעלה הזרם" ב-IVC. זה ניתן למנוע על ידי הנחת תפר (4-O Prolene) דרך הקיר דרך וריד 2 - סעיף 3 מ"מ בצינור PVC כך צינור מעוגן היטב למקומו הנוכחי. החוקר צריך מתקשים למצוא תאים טרום fluorescently שכותרתו שמוצג באיור 8 לאחר explantation בצינור פטנט אחרת, סביר להניח כי התאים יש קילף כגיליון קוהרנטית. זה ניתן למנוע על ידי לנתיחה מאוד עדין של הווריד שמסביב דיס הרכבה של 3 חלקים טי צינור, לאחר תיקון ברוח יחד עם הצינורית.

הטכנולוגיה שלנו מספקת הוכחה של קונספט למניעת פקקת מכשיר לב וכלי דם באמצעות זריעת-EPC. טכנולוגיה זו עשויה לשמש בפיתוח שתלים "הביוגניים" מדופן התאים עצמו המטופלים אבי האנדותל. בדיקת היתכנות במודל חיה חזירי שלנו מספק את הצעדים הראשונים לקראת התרגום של "רפואה אישית" זה לתוך הפרקטיקה הקלינית.

Disclosures

אין ניגודי אינטרסים הכריז.

Acknowledgments

המחברים מבקשים להודות Leica Microsystems עצה יקר שלהם על חלקים הדמיה טיטניום ג'מיני Bio-מוצרים עבור מתן נסיוב חזירי השתמשו במחקר זה. כמו כן, אנו רוצים להודות-NIH על תמיכתם באמצעות גרנט "רירית EPC עצמיים כדי לשפר את biocompatibility של הדם ולסייע התקנים", RC1HL099863-01. יתר על כן, אנו אסירי תודה על התמיכה של הקרן הלאומית למדע בוגר מחקר של אחוות אלכסנדרה Jantzen. כמו כן, אנו רוצים להודות ג'ורג' מהירה, מייק לאו Ianthia פארקר לסיוע עם היבטים רבים של ההליך הכירורגי וטיפול בבעלי חיים במחקר שלנו. סטיבן אואן כבר לא יסולא בפז עיבוד חלקים רבים של המכשיר זריעת שלנו חיתוך צינורות טיטניום.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Acepromazine Boehringer Ingeheim BIC670025 NAC# 10280002
Alconox Powered Precision Cleaner Alconox, Inc. 1104
Balfour Surgical Retractor Adler N/A
Baytril Bayer AG APVMA 46028/0705
Butterfly Needle (19G) Terumo Medical Corp. SV19CLK
Chlorhexidine 3M 9200
Clamps (45-degree) Aesculap FC339T
DPBS (-/-) GIBCO, by Life Technologies 14190-144
DPBS (+/+) GIBCO, by Life Technologies 14040-133
DuraPrep 3M 8635
EBM-2 Medium Lonza Inc. CC-3156 Base for both serum free and full growth medium
EGM-2 SingleQuots Lonza Inc. CC-3162 Used with EBM-2 for both serum free and full growth medium
Electrocautery Tool Valleylab SurgII-20
Emery Cloth 3M 60-0700-0425-8 240 grit
Euthasol Euthanasia Solution Virbac Animal Health ANADA #: 200-071
Fentanyl Patch Actavis NDC # 67767-120-18
Flunixin Merck & Co. NAC #: 10470183
Foley Catheter (16F) Bard 730116
HBSS Sigma-Aldrich H8264-500ML
Heat Gun Milwaukee 8988-20
Heparin NDC #: 25021
Histopaque-1077 Sigma-Aldrich H8889-500ML
Intubation Tube Mallinckrodt Baker Inc. 86113
Isoflurane MWI Veterinary Supply NDC #13985-030
IV Catheter (18G) BD Biosciences 381547
Ketamine Fort Dodge Animal Health NDC #0856-2013
Level Swanson LLA001
Luer-Lock tip cap CML Supply 909-001
Marcaine Hospira Inc. NDC #: 0409-1560-10
Metzenbaum Scissors Adler N/A
Micro-introducer (5F) Galt KIT 002-01
Mosquito Forceps Adler N/A
Motor Herbach and Rademan H1-08
Oxymorphone Endo Labs NDC: 63481-624-10
PKH26 Dye Kit Sigma-Aldrich PKH26GL-1KT
Porcine Serum Gemini Bio Products 100-115 2% concentration in full growth medium
Potts Scissors Adler N/A
Precise Vista Skin Stapler 3M 3998
PVC Tubing McMaster-Carr 7132K117 expanded ID 15.88 mm,
recovered ID 7.95 mm
Right Angle Medium Size Adler N/A
Scalpel Blade (#10-15) Bard 373910
Silicone Tubing McMaster-Carr 51735K26 16.64 mm OD, 9.52 mm ID
Syringe (5 cc) BD Biosciences 309603
Tegaderm 3M 90001
Three-way Stopcock Kendall 170060
Ti Tube Tico Titanium N/A Specified as ½" OD, .065" wall, .370" ID, .1737 lbs/ft
Trypsin Lonza Inc. CC-5012
Trypsin Neutralizing Solution (TNS) Lonza Inc. CC-5002 0.03%
Vetropolycin Pharmaderm Animal Health NAC #: 12920110
Vicryl Suture (3-0) Ethicon Inc. J808T
Water Bath Sonicator Branson B200

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Achneck, H. E. Pathophysiology of bleeding and clotting in the cardiac surgery patient: from vascular endothelium to circulatory assist device surface. Circulation. 122, 2068-2077 (2010).
  2. Achneck, H. E., Sileshi, B., Lawson, J. H. Review of the biology of bleeding and clotting in the surgical patient. Vascular. 16, 6-13 (2008).
  3. Arvidsson, S., Askendal, A., Tengvall, P. Blood plasma contact activation on silicon, titanium and aluminium. Biomaterials. 28, 1346-1354 (2007).
  4. Achneck, H. E. The biocompatibility of titanium cardiovascular devices seeded with autologous blood-derived endothelial progenitor cells: EPC-seeded antithrombotic Ti Implants. Biomaterials. 32, 10-18 (2011).
  5. Kang, C., Bonneau, M., Brouland, J. P., Bal dit Sollier, C., Drouet, L. In vivo pig models of venous thrombosis mimicking human disease. Thromb Haemost. 89, 256-263 (2003).
  6. Ueberrueck, T. Comparison of the ovine and porcine animal models for biocompatibility testing of vascular prostheses. J Surg Res. 124, 305-311 (2005).
  7. Velik-Salchner, C. Normal values for thrombelastography (ROTEM) and selected coagulation parameters in porcine blood. Thromb Res. 117, 597-602 (2006).
  8. Yoder, M. C. Redefining endothelial progenitor cells via clonal analysis and hematopoietic stem/progenitor cell principals. Blood. 109, 1801-1809 (2007).
  9. Achneck, H. E. American Heart Association Scientific Sessions, Abstract Oral Sessions, Medical Aspects End Stage Heart Failure: Transplantation and Device Therapies. (2010).
  10. Achneck, H. E. Regenerating titanium ventricular assist device surfaces after gold/palladium coating for scanning electron microscopy. Microsc Res Tech. 73, 71-76 (2010).
  11. Ford, J. W., Welling, T. H., Stanley, J. C., Messina, L. M. PKH26 and 125I-PKH95: characterization and efficacy as labels for in vitro and in vivo endothelial cell localization and tracking. J Surg Res. 62, 23-28 (1996).
עצמיים אבי האנדותל Cell-מתזמן טכנולוגיה בדיקה biocompatibility עבור התקנים לב וכלי דם במודל חיה גדולה
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Jantzen, A. E., Lane, W. O., Gage, S. M., Haseltine, J. M., Galinat, L. J., Jamiolkowski, R. M., Lin, F., Truskey, G. A., Achneck, H. E. Autologous Endothelial Progenitor Cell-Seeding Technology and Biocompatibility Testing For Cardiovascular Devices in Large Animal Model. J. Vis. Exp. (55), e3197, doi:10.3791/3197 (2011).More

Jantzen, A. E., Lane, W. O., Gage, S. M., Haseltine, J. M., Galinat, L. J., Jamiolkowski, R. M., Lin, F., Truskey, G. A., Achneck, H. E. Autologous Endothelial Progenitor Cell-Seeding Technology and Biocompatibility Testing For Cardiovascular Devices in Large Animal Model. J. Vis. Exp. (55), e3197, doi:10.3791/3197 (2011).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter