Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove

Bioengineering

Otolog Endotelyal progenitör Hücre-Yayımlama Teknoloji ve Büyük Hayvan Modeli Kardiyovasküler Cihazlar için Biyouyumluluk Testleri

doi: 10.3791/3197 Published: September 9, 2011

Summary

Kan ile temas eden otolog hücre ve test biyouyumluluk biyomalzemeler tohumlama titanyum için bir yöntem açıklanmıştır. Bu yöntem, cerrahi implantasyon dakika içinde domuz venae kava numaralı seribaşı endotel progenitör hücrelerin ve titanyum tüpler, kullanır. Bu teknik, diğer birçok implante biyomedikal cihazlar için uyarlanabilir.

Abstract

Vücuda Yerleştirilebilir tromboemboli oluşumu 1,2,3 risk teşkil yapay malzeme (örneğin titanyum (Ti), genişletilmiş politetrafloroetilen), kardiyovasküler cihazlar üretilmektedir. Biz otolog kan kaynaklı insan veya domuz endotel progenitör hücrelerin (EPC) 4 Ti tüplerin iç yüzeyi hattı için bir yöntem geliştirdiler. Ti tüpler implante domuzların inferior vena kava (IVC), domuz EPC konfluent katmanı içeren, büyük bir hayvan modeli protrombotik ortamda hücre numaralı seribaşı yüzeyi gelişmiş biyouyumluluk test edilmiş ve değiştirilmemiş çıplak metal yüzeyleri karşılaştırdık 5,6,7 (Şekil 1). Bu yöntem, implantasyon dakika içinde cihazların endothelialize ve in vivo olarak antitrombotik fonksiyon testi için kullanılabilir .

Periferik kan, 50 kg Yorkshire domuz ve EPC 4,8 izole etmek için kültürü mononükleer hücre fraksiyonu elde edildi . Ti tüpleri (9.4 mm ID), üç 4.5 cm boykesit içine önceden kesilmiş ve ısıyla daralan boru ile yeniden birleştirilen. Ti tüpler yavaş dönüş için olanak sağlayan bir tohumlama cihazının inşa edildi.

Biz domuz bir laparotomi ve bağırsak ve mesane dışsallaştırdığı. Keskin ve künt diseksiyon proksimal sağ renal arter distalinde, çatallanma IVC iskeletini kullanılmıştır. Ti tüpler sonra, tek tip hücre kaplama 9 elde etmek için 10 RPH x 30 dakika EPC süspansiyon ve yatık otolog floresan etiketli doluydu . 100 USP / kg heparin uygulamasından sonra, IVC ve lumbar ven her iki ucunda klempe edildi. A 4 cm veinotomy ve cihaz yerleştirilir ve fosfat tamponlu tuzlu su ile doluydu. Veinotomy 4-0 Prolen çalışan sütür ile kapatıldı, bir kelepçe de hava IVC kaldırıldı. Prosedürün sonunda, fasya 0-PDS (polidioksanon dikiş) ile yaklaşık 2-0 vicryl, subkutan alan kapalı ve cilt kapalı zımbalanmış.

Sonra 3 - 21 gün, domuz ötenazi, en-blok eksplante ve sabit cihaz. Ti tüpler demonte ve iç yüzeyleri bir floresan mikroskobu ile görüntülenmiş.

Biz EPC numaralı seribaşı tüpleri patent kaldı ise çıplak metal Ti tüpler tam tıkalı bulundu. Ayrıca, kan ile temas eden iç yüzeyi EPC bir konfluent katmanı göstermek mümkün.

Sonuç olarak, bizim teknoloji cihaz trombozu önlemek için otolog EPC implantasyon dakika içinde Ti tüpler endothelialize kullanılabilir. Cerrahi yöntem, az kan kaybı ve EPC numaralı seribaşı yüzey bozulması ile bu değiştirilmiş cihazların gelişmiş biyouyumluluk test etmek için izin verir.

Protocol

1. Endotel progenitör hücre izolasyonu

  1. EPC numaralı seribaşı tüp implantasyonu otuz gün önce, 15 ml antikoagülan sitrat dekstroz çözeltisi ile, 60 ml şırınga hazırlamak ve EPC, periferik domuz kandan izolasyonu için 3-yollu vanasını ile güvenli. 24 saat önce kan beraberlik, Astar iki Tip 1 sıçan kolajen (50 mg / ml 0,02 N asetik asit çözeltisi içinde çözünmüş) 4 ile 12 kuyucuğu.
  2. Ulusal Enstitüsü Laboratuvar Hayvanları Bakım ve Kullanım Sağlık Rehberi doğrultusunda ve sadece nezaret Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Kurulu onayından sonra, tüm hayvan bakımı ve deney gerçekleştirin.
  3. Bir kadın Yorkshire Acepromazine sakinleştirmek ile domuz (45 kg) (1.1 mg / kg) ve Ketamin (22 mg / kg), 19 G kelebek iğne ile intramüsküler.
  4. Endotrakeal tüp (30 cm uzunluğunda, 8 mm ID) ile domuz entübe ve İsofluranın (maske ile gelgit hacmi% 4.5) ile domuz uyutmak.
  5. Oksijen satürasyonu, kalp hızı ve sıcaklığı ölçerek işlem sırasında domuz izleyin. Otomatik bir ısıtılmış ameliyat masasında ve ısıtma battaniyesi kullanarak ve infüze edilen sıvı ısınmanın termoregülasyon koruyun.
  6. Domuz ameliyat masasına yatar pozisyonda yerleştirin caudolaterally arka bacaklarda, güvenli ve DuraPrep sterilizasyon takip Klorheksidin ile temizleyin. Daha sonra pelvik bölgede draping devam edin.
  7. Femoral ven içine palpabl femoral nabız (vastus medialis ve gracilis kası lateral medial) sadece medial 5 F mikro-introducer kiti, 21 G x 7 cm iğne takın ve Seldinger tekniği kullanılarak damar cannulate. Intravasküler kateter, hazırlanan 60 ml şırınga bağlayın ve 45 ml kan çekmek.
  8. Hemostaz (5 dk) elde etmek için damar ponksiyonu sitesi üzerinde baskı tutun, anestezi durdurma ve domuz kurtarmak. Hayvan tam iyileşme kadar takip ve kendi kafesine döndü.
  9. Kan çözüm Hank tamponlu tuz solüsyonu ile 1:1 (CaCl 2, MgCl 2, MgSO 4 olmadan) ve eşit miktarda iyi tanımlanmış katmanlar oluşturmak için Histopaque katman sulandırınız. Santrifüj (30 dk, 740 g, düşük bir kırılma ayarı) ve toplamak mononükleer hücre (ÇUŞ) katmanı. Süspanse edin ve Dulbecco'nun Fosfat yıkama ÇUŞ x 3 tam büyüme orta iki 12-iyi plakaları (EBM-2 orta% 2 Domuz Serum (PS) ve EGM-2 ile içine kaplama önce Tuzlu (DPBS) (10 dak, 515 gr) Tamponlu SingleQuots) 37 ° ° C,% 5 CO 2.
  10. Yavaş yavaş daha sonra ilk 7 gün, her gün her 24 saatte bir, orta değiştirin. Ortalama bir süre sonra EPC koloniler tespit
    7 gün (Şekil 2).
  11. 12-iyi bir yüzey alanı ¼ kapağı bir kez kültür EPC genişletin. Flow sitometri ile CD14 CD31 ve yokluğu, CD45 yüzey belirteçlerinin varlığı için test EPC kimlik onaylayın. Diğer testleri yapılabilir 4. akışına maruz kaldıktan sonra, hücre morfolojisi ve nitrik oksit III aktivite içerir .

2. Titanyum boru montaj

  1. HHS dilme 72 dişlere sahip boyuna Bölüm 3 eşit 120 derecelik birimleri (4,5 cm uzunluğunda) içine bir Ti borusu dikey freze testere mili tarafından yerinde tutulur gördüm. 300 RPM çalıştırın ve kesim esnasında her zaman dokunun Magic Kesme Yağı (Şekil 3) ile doymuş kesim alanı tutmak.
  2. Lehçe bir tezgah değirmeni ve bir Scotch-Brite metal işleme simidi ile iç yüzeyi. Sonra daha da pürüzsüz ve yüzey 3M zımpara bezle elle lehçe görünür bir çukurları kaldırmak için.
  3. Aqua regia oldukça aşındırıcı ve su altında 5 dakika, birkaç litre su 10 ile durulama ardından aqua regia (01:03 konsantre hidroklorik asit ve konsantre nitrik asit), Egzersiz son derece dikkatli takip Ti adet, Alconox sabun solüsyonu ile temizleyin Potansiyel olarak patlayıcı!
  4. Sonikasyon Ti bölümler x 16 dk Alconox sabun çözeltisi, deiyonize su x 30 yükselişi ve deiyonize su x 16 dk tekrar sonikasyon. Laminer akış kaput kurumasını bekleyin.
  5. 4.5 cm uzunluğunda ve 2.4 ortalama temiz Kes PVC ısı küçültmek boru.
  6. 3 temizlenir Ti bölümleri destekleyici bir mandrel (alüminyum, 8,5 mm OD işlendi) ve Ti bölümleri etrafında PVC ısı shrink boru (Şekil 4) kol üzerine yerleştirmek için cımbız kullanın. Eşit Ti bölümleri birbirine sıkıca sarın mandrel açarken bir ısı tabancası ile şirink tüplerde.

3. Seeding cihaz ve montaj

  1. Silikon tüp, 2,5 cm ve 3,5 cm uzunluğunda kesin.
  2. Bölüm 5 cc plastik 0.8 ml şırınga ve döner sonu ile 'başlık' tutmak.
  3. 2 x silikon bölümleri, şırınga 'başlık' ve 2.4 'de açıklandığı gibi bir döner kap sonication iyice temizleyin.
  4. Mikolojik monte Ti tüpün her iki ucunda, 2.5 silikon tüp ekle5 mm PVC boru üzerinde ding.
  5. Abuts Ti borusu (Şekil 5), böylece, kısa bir silikon tüp içine şırınga 'başlık' ucu yerleştirin.
  6. Seal Tyvek çantası ve etilen oksit gazı (18 saat 55 ° C) ile sterilize bir döner kap Ti boru montaj bitirdi.
  7. Senkron bir zamanlama motor (10 RPH) pleksiglas bir platform üzerine monte edin ve bir şırınga tutucu (alüminyumun işlenmiş, 5 cc şırınga uyan) (Şekil 6) aks bağlamak.

4. EPC-Ti tüp iç yüzeyi tohumlama

  1. 1 altında izole olarak EPC genişletin. T-75 şişeler 3 konfluent (veya en az 9 x 10 6 hücre).
  2. Ameliyat günü, uzun vadeli boya (PKH26) 11 ile floresan etiket hücreleri. Iki kez serum serbest orta kültürlü EPC durulama başlayın. Dikkat etiketleme sırasında ve sonrasında hücreleri korumak için ışık maruz kalma sınırı.
  3. 4 dakika boyunca oda sıcaklığında Dilüent C 4 mcM PKH26 (boya solüsyonu) ile hücreleri örtün.
  4. Eşit miktarda boya çözüm domuz serumu ekleyerek reaksiyon etiketleme durdurun. Bir dakika sonra, tam büyüme ortamı ile birlikte çözüm 01:01 sulandırmak.
  5. Sıvı aspire edin ve tam besi hücreleri x 3 durulayın.
  6. (CaCl 2, MgCl 2 olmadan) iki kez DPBS EPC yıkayın.
  7. 3 dakika 37 tripsin ve inkübe hücreleri ° C Kapak ve ışık mikroskobu altında dekolmanı onaylamak. Kullanılan tripsin çift ses tripsin Nötralizasyon Çözüm ekleyin.
  8. Pipetleme tarafından tek bir tüp ve karışımı içine hücre çözümleri birleştirin. 10 ul hücre çözüm saymak için bir hemasitometre her tarafına ekleyin.
  9. Santrifüj hücre çözümü (1500 RPH, 5 dk.) 2 hücreleri ve tekrar süspansiyon pelet sayısı 2.5 x 10 6 EPC / ml serum serbest ortamda. Boru montaj 4,5 ml doldurmak için minimum hacim unutmayın.
  10. Steril alan için biyolojik kaput steril havlu yerleştirin. Açık gaz steril steril sahaya Ti boru montaj ve ilave 5 cc şırınga.
  11. Steril eldiven, 5 cc şırınga pistonu kaldırmak ve daha sonra kullanmak üzere alan üzerinde tutmak. Bu şırınga sabitleyiniz döner kap.
  12. Pipetleyin 4.5 - 4.9 altında açık şırınga varil içine 5 ml EPC süspansiyon. Piston geri şırınga açık ucunu güvenli bir şekilde yerleştirin.
  13. Yukarı kap şırınga tutun ve kapağı çıkarın. Ti tüp içinde ilerleme yok; rahatça kadar ilk döner sonuna Ti boru montaj açık silikon tüp içine şırınga takın.
  14. Avans şırınga pistonu yavaş yavaş hücre çözümü kabarcıklar sistemden kaldırma ', baş parça kesme şırınga üst ulaşana kadar. Luer kapağı ile kapatın ve tüm montaj bandı ile sızdırmazlık, açık ucunu steril kılıf içine yerleştirin.
  15. Tüm bu meclis 3.7 işlenmiş şırınga tutucunun içine yerleştirin. 37 inkübatörde Yeri ° C ve tohumlama odasının bu Ti tüp kısmı su seviye göstergesi (Şekil 6) kullanarak, böylece bir platform ayarlayın.
  16. Ti boru montaj implantasyon 30 dakika önce döndürmek için izin verin.

5. Domuz vena kavaya Ti tüp implantasyonu

  1. Ameliyat öncesinde yirmi dört saat, Fentanil bir patch (yama yer x 72 saat 100 mg / saat transdermal) ile domuz premedicate (EPC izole edildiği).
  2. Domuz NPO gecede tutun ve ameliyat günü (5 mg / kg, IM) ve 7 gün süreyle antibiyotik profilaksisi olarak her 24 saatte bir, aşağıdaki preoperatif Baytril (Enrofloxacin) yönetmek.
  3. Sakinleştirmek, entübe ve 1.3 altında açıklandığı gibi domuz uyutmak (10 -15 ml / kg tidal volüm) ve ameliyathane masaya yatar pozisyonda domuz güvenli. Oksijen satürasyonu, kalp hızı ve sıcaklığı ölçerek işlem sırasında domuz izleyin. Otomatik bir ısıtılmış ameliyat masasında ve ısıtma battaniyesi kullanarak ve infüze edilen sıvı ısınmanın termoregülasyon koruyun.
  4. , 18 G IV kateter domuz kulak damar içine yerleştirin ve Vetropolycin göz damlaları ile domuz gözleri korumak.
  5. Temiz, hazırlık ve 1.6 olarak domuz karın asmak. Kaudal son meme bezlerinin cranially 2. 2. # 15 neşter bıçak ile orta hat İnsizyon.
  6. Elektrokoter ile karın fasya diseksiyonu aşağı taşıyın.
  7. Sivrisinek forseps ile periton kaldırın ve Metzenbaum makası ile dikkatlice girin.
  8. Mesane Externalize ve 3-O Vicryl çanta-string sütür mesane duvar içine yerleştirin. Onun ortasında bir bıçak kesi yerleştirin ve 16 F Foley kateter yerleştirin. Idrar çıkışı titre intravenöz sıvılar (Laktat Ringers) Yönetici> / = 1 ml / kg / saat ameliyat sırasında.
  9. Sonra, ince ve kalın bağırsak ve yeri iki Balfour cerrahi retraktörlere peritoneal kavitenin posterior yönünü ortaya çıkarmak ve inferior vena kava (IVC) tanımlamak için dışa.
  10. Dikkatli, keskin ve künt diseksiyon IVC dokusu çevresindeki ücretsiz ve IVC distal bifurkasyon proksimal sağ renal arter damar deri bir kemik. IVC bile çok küçük bir kusur hayvan hızlı kanama ve exsanguination neden olabileceğinden IVC diseksiyonu sırasında son derece dikkatli olun.
  11. Implante Ti tüp etrafında kanama olacağı sağlamak için IVC segmentinde tüm yan dalları Arter. Çok dikkatli diseksiyon ve ligasyon gerektiren genellikle büyük iki posterior lomber venler unutmayın. Ayrıca, IVC bifurkasyosunda hemen proksimal, büyük bir lumbar ven genellikle posteromedial tarafında karşılaştı ve ücretsiz ve kelepçe yerleştirme için hazırlık gemi döngüler ile kontrol disseke olmalıdır unutmayın.
  12. Ti tüp aynı anda 4 altında belirtildiği gibi tohumlama ile devam edin.
  13. 100 USP / kg heparin hemen önce IVC sıkma yönetin. IVC ve lumbar ven distalde 45 derecelik açı cerrahi kelepçeler yerleştirin ve sonra proksimale.
  14. Potts makas ile uzantısı takip # 11 neşter bıçak kullanarak proksimal ve distal kelepçeler arasında uzunlamasına veinotomy (4 cm) oluşturun.
  15. IVC herhangi bir kan boşaltın ve iç lümen steril DPBS ile yıkayın.
  16. Şimdi IVC içine yerleştirin ve EPC numaralı seribaşı Ti borusu (veya çıplak metal kontrolü), kurumasını hücreler önlemek ve hava tahliye DPBS (CaCl 2, MgCl 2) ile doldurun .
  17. Veinotomy 4-0 Prolen çalışan sütür ile kapatın ve arka kanama küçük bir miktar ile de hava IVC bir proksimal klemp kaldırmak. Zamanla implant göçü önlemek için PVC boru içine damar duvarına bir 'stay-dikiş' koyun.
  18. 2-O Vicryl (sütürlerinin) ile BT iğne ve subkutan alan O-PDS ile fasya kapatın. Zımba ile cilt kapatın.
  19. 20 ml kadar kesi boyunca subkutan% 0.25 Marcaine (Bupivakain) Yönetici ve gazlı bez ve Tegaderm yara kapsayacak. Subkutan olarak ağrı için gerekli Flunixin (2.2 mg / kg S 24 saat) ve Oxymorphone (4 saat 0.15 mg / kg 'Q 3) vermek.
  20. Anestezi durdurun, uyanık kadar domuz izlemek ve kafes dönmek. Sıkıntı / ağrı, ayakta durma ve ambulasyon, dışkı ve idrar çıkışına ve ten rengi normal perfüzyon gösteren işaretleri için günde iki kez domuz izleyin.

6. Ti tüp, kaçırmanın

  1. 3 hafta sonra, oturaklı, entübe ve 1.3 'de açıklandığı gibi domuz uyutmak - 1.4.
  2. 5.8 - 5.5 'de açıklandığı gibi bir laparotomi ile devam edin.
  3. Ancak in situ sert Ti tüp palpe skarlasma implant yeri gizlemek unutmayın.
  4. 5.9 de açıklandığı gibi IVC teşrih - 5.11 ve Ti tüp ağır makas ile çevredeki IVC ile en-blok eksplant.
  5. Euthasol ötenazi çözüm (390 mg / ml pentobarbital Sodyum ve 50 mg / ml Fenitoin Sodyum 1 ml / 10 lbs) ile hayvan Euthanize.

7. Fiksasyon ve görüntüleme Ti iç yüzey

  1. DPBS çözüm Ti tüp ile ven segmenti eksize durulayın ve yüksek çözünürlüklü bir dijital kamera (Şekil 7) ile lümen (patent veya tıkalı) fotoğraf.
  2. Ardından, 15 dakika en az% 3.7 paraformaldehid dalma örnek düzeltmek. DPBS çözümü numune durulayın.
  3. Çok dikkatli bir şekilde çevredeki ven ve Ti borusu açmak için PVC boru insizyon. Floresan kırmızı / turuncu renk (Şekil 8A) PKH26-etiketli EPC görselleştirmek için 550 nm dalgaboyu / ışık kaynağı ve görüntü altında objektif bakan iç yüzeyleri ile mikroskop altında 3 bölümden yerleştirin. İsterseniz, hücreler (örneğin, Platelet Endotel Hücre Adezyon Marker (PECAM hücre kenarlıkları (Şekil 8B), çekirdekleri görselleştirmek için DAPI leke vb görselleştirmek için)-leke) daha da lekeli olabilir.

8. Temsilcisi sonuçları:

Bu protokolün uygulanması sonrasında, doktorlar ve bilim adamları, büyük bir hayvan modeli otolog kan endotel progenitör hücreler ile katı tüp yapıları endothelialize mümkün. Şekil 2 yöntemi ile izole EPC arnavut kaldırımlı morfolojisi ile yaklaşık 7 gün sonra koloniler olarak görünür kültürü. Şekil 5 ve 6 gösterildiği tohumlama cihazı, steril koşullar 9 altında tüp iç yüzeyi düzgün kapsama EPC süspansiyon ve sonuçları ile dolu Ti tüpler yavaş dönüşü sağlar .

Bizim implantasyon cerrahisinde büyük bir hayvan modelinde tromboz, Ti gibi Biyomalzemelerin eğilimi, test etmek için izin verir. Biz domuz bu yordamı iyi tolere olduğunu ve bu implantasyon sadece az kan kaybı ve EPC katman kesinti olmadan elde edilebilir bulundu.

Ayrıca, bizim EPC çizgili tüp inferior vena kava protrombotik düşük kesme ortamda bile patent kalır ise çıplak bir Ti tüp tamamen tıkar ki t "> Şekil 7 göstermektedir. floresan etiketli konfluent tabakası hücrelerinin varlığını teyit Bu yöntemin başarı olarak Şekil 8'de gösterilmiştir.

Şekil 1
Şekil 1 otolog endotelyal progenitör hücre (EPC) tohumlama deneyi şematik. İlk olarak, periferik kan domuz çizilir. Sonra, EPC kandan izole ve kültür genişledi. EPC sonra cerrahi hücreler izole edildiği aynı domuz inferior vena kava içine implante bir titanyum (Ti) tüp cihaz, sonra satır için kullanılır.

Şekil 2
Şekil 2 kültür EPC, izolasyon prosedürü izleyerek yaklaşık 7 gün (Görüntüleme kamera ve QCapture yazılım ters bir Leica DMIL mikroskobu ile görüntülenmiş) Temsilcisi koloni.

Şekil 3
Montajdan önce Şekil 3 Ti tüp bölümlerini. Ti boru boyuna 3 eşit bölüme kesme ve daha sonra 4,5 cm uzunlukta kesilir. Ti bölümlerde iç yüzeyleri görünür çukurları kaldırmak için bir tezgah taşlama ve zımpara bezi kullanarak parlatılır.

Şekil 4
Şekil 4 PVC ısıyla daralan boru (mavi) ve ısı tabancası ile Ti tüp bölümlerini Meclisi. Ti bölümleri, Ti bölümleri uzanır ve Ti tüp iç çapı boyutları ile eşleşen bir işlenmiş alüminyum mandrel desteklenmektedir.

Şekil 5
Şekil 5, tüm bileşenleri gösteren Titanyum tüp tertibatı, döner kapağı, şırınga 'başlık' silikon tüp, ve Ti borusu, PVC wrap (mavi ). Meclis cerrahi kullanım için sterilizasyon için önce birlikte alınır.

Şekil 6
Şekil 6, motor, platformu gösteren kuvöz içinde Ti tüp tohumlama kurulum, işlenmiş alüminyum şırınga tutucu, Ti boru montaj ve 5 cc şırınga . Not: Montaj görselleştirme amaçlı steril koruyucu kılıf olarak gösterilir.

Şekil 7
Şekil 7 implantasyon cerrahisi Temsilcisi brüt domuz inferior vena kava (IVC) implantasyon sonrası (A) kontrolü çıplak metal Ti tüp End görünümü. Tüp lümen sağlam bir pıhtı ile tamamen tıkalı (B) EPC numaralı seribaşı Ti tüp sonu görünümü, implantasyon sonrası . Tüp lümen tamamen patent ve net. Kontrolü (C) Dissected görünümü (çıplak) Ti tüp, 3 gün implantasyon sonra, tromboz ölçüde (deneyler aynı sonuçları ile süresi 3 hafta kadar yapılmıştır) .

Şekil 8
3 gün implantasyon sonrası Ti tüp yüzey Şekil 8 EPC (QImaging QICAM dik bir Leica DMRB mikroskobu ile görüntülenmiş, dijital kamera ve Image Pro Plus yazılımı tek renkli) . (A) yüzeye Konfluent hücrelerin PKH26 ameliyat öncesi etiketleme gösteriyor. (B) EPC konfluent katmanı. Kırmızı: PKH26 ameliyat öncesi etiketleme. Yeşil: EPC PECAM-leke.

Discussion

Burada sunulan hücre-ekim Ti tüpler yöntem hızlı ve düzgün endothelialize doktorlar ve bilim adamları kan ile temas eden yüzeyleri implante edilebilir cihazlar. Izole etmek ve periferik kan örnekleri EPC genişletmek yılından bu yana, önemli bir invaziv prosedür bu hücrelerin hasat için gereklidir. Ayrıca, EPC otolog, bu nedenle hücre numaralı seribaşı implant için herhangi bir immün reaksiyon riskini ortadan kaldırır. Onun protokolde gösterilen ilkeler Ti tüpler için değil sadece, ama birçok diğer biyomateryaller, kardiyovasküler tıp alanında kullanılmaktadır kullanılabilir.

Bu protokol Kritik adımlar bulduğumuz gibi, Ti tüpler titiz bir temizlik olduğunu kirletici tavizler hücre bağlılığın herhangi bir yandaşı bir film. Ayrıca, yavaş bir dönüş hızı (boru çapı ile ters orantılıdır) tohumlama işlemi sırasında önemlidir, öyle ki EPC, yavaş yavaş yerleşmeye ve Ti borusu hareket olarak yüzeye yapışır.

Implantasyon öncesi hemen ekim yöntemi pratik ex vivo kültür kez önler, hücreleri tek tek yapışır ve daha sonra, hemen akışının yeniden kurulması ardından bir yaprak gibi embolizasyon imkanı kaçınarak, in vivo olarak konfluent sayfalık formu. Bizim önceki çalışmalar, EPC konfluent bir katmana büyüdü sonra, ek olarak endotel bir levha olası dökülmesi en aza indirmek, onlar sıkıca yapışır ekstra bir matriks yaptığınız göstermektedir. Embolik dekolmanı olasılığı tamamen göz ardı rağmen, tüm aygıt yüzeyinin trombozu daha multifold düşük risk, bu tedavinin önlemek için tasarlanmış olduğunu sorun gibi görünüyor.

Düşük kesme içine implantasyonu Bizim yaklaşımımız, inferior vena kava protrombotik ortam kan uyumluluk ve cihazlar 5,6 trombozu araştırmak için en güvenilir büyük hayvan modellerinde kullanmaktadır. Tüm hayvan bakımı ve deney Ulusal Enstitüsü Laboratuvar Hayvanları Bakım ve Kullanım Sağlık Kuralları ve sadece Duke Üniversitesi Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Kurulu onayından sonra uygun yapılmıştır unutmayın.

Biyomalzemeler ve cihazları test etmek için bu implantasyonu yöntemi başarıyla yararlanmak için, sabırla IVC segmentinde iskeletini, cihazın etrafında kanama bir 'yalancı lümenin' çıktığını cihazın yerleştirilmesi için hazırlık tüm venöz şube gemileri, Arter önemlidir. Diğer önemli adım, iç tüp yüzey hücreleri veinotomy kapatılması sırasında nemli kalır ve reperfüzyon başlamadan önce olduğu gibi cihaz lümenine ek DPBS. Cihaz implante yerini tespit edilemezse, IVC 'upstream' göç etmiş olabilir. - Bu 3 mm PVC boru bölümünde tüp bugünkü konumu iyice demirlemiş böylece damar duvarının üzerinden 2 ile dikiş (4-O Prolen) koyarak engelledi olabilir. Araştırmacı, bir başka patent tüp eksplantasyonu sonra Şekil 8'de gösterilen floresan önceden etiketli hücreleri bulmakta zorluk olması halinde, bu hücrelerin tutarlı bir sayfa olarak soyulmuş olması muhtemeldir . Bu tüp ile birlikte ven sabitleme sonra, 3 Ti tüp bölümlerini çevreleyen damar ve dis-montaj çok nazik diseksiyon ile önlenebilir.

Teknolojimiz, EPC-tohumlama yoluyla kardiyovasküler cihaz trombozu önlemek için proof-of-concept sağlar. Bu teknoloji, hastanın kendi endotel progenitör hücreleri ile kaplı 'biyojenik' implantların geliştirilmesinde kullanılıyor olabilir. Bizim domuz hayvan modelinde klinik pratikte bu 'kişiye özel tıp' Çeviri doğru ilk adımları için fizibilite çalışması sağlar.

Disclosures

Çıkar çatışması ilan etti.

Acknowledgments

Yazarlar, bu çalışmada kullanılan domuz serum sağlamak için görüntüleme titanyum bölümleri ve İkizler Bio-Ürünler değerli tavsiye için Leica Microsystems teşekkür etmek istiyorum. Ayrıca, RC1HL099863-01 "Otolog EPC astar dolaşım, biyouyumluluk yardımcı cihazlar geliştirmek için" Hibe yoluyla NIH verdikleri destek için teşekkür etmek istiyorum. Ayrıca, Ulusal Bilim Vakfı Yüksek Lisans Araştırma Bursu Alexandra Jantzen destek için minnettarız. Ayrıca, cerrahi prosedür birçok açıdan yardımcı ve araştırma hayvanların işleme George Hızlı, Mike Lowe ve Ianthia Parker teşekkür etmek istiyorum. Steven Owen bizim tohumlama cihazın işleme pek çok yerinde çok değerli ve titanyum borular vardır.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Acepromazine Boehringer Ingeheim BIC670025 NAC# 10280002
Alconox Powered Precision Cleaner Alconox, Inc. 1104
Balfour Surgical Retractor Adler N/A
Baytril Bayer AG APVMA 46028/0705
Butterfly Needle (19G) Terumo Medical Corp. SV19CLK
Chlorhexidine 3M 9200
Clamps (45-degree) Aesculap FC339T
DPBS (-/-) GIBCO, by Life Technologies 14190-144
DPBS (+/+) GIBCO, by Life Technologies 14040-133
DuraPrep 3M 8635
EBM-2 Medium Lonza Inc. CC-3156 Base for both serum free and full growth medium
EGM-2 SingleQuots Lonza Inc. CC-3162 Used with EBM-2 for both serum free and full growth medium
Electrocautery Tool Valleylab SurgII-20
Emery Cloth 3M 60-0700-0425-8 240 grit
Euthasol Euthanasia Solution Virbac Animal Health ANADA #: 200-071
Fentanyl Patch Actavis NDC # 67767-120-18
Flunixin Merck & Co. NAC #: 10470183
Foley Catheter (16F) Bard 730116
HBSS Sigma-Aldrich H8264-500ML
Heat Gun Milwaukee 8988-20
Heparin NDC #: 25021
Histopaque-1077 Sigma-Aldrich H8889-500ML
Intubation Tube Mallinckrodt Baker Inc. 86113
Isoflurane MWI Veterinary Supply NDC #13985-030
IV Catheter (18G) BD Biosciences 381547
Ketamine Fort Dodge Animal Health NDC #0856-2013
Level Swanson LLA001
Luer-Lock tip cap CML Supply 909-001
Marcaine Hospira Inc. NDC #: 0409-1560-10
Metzenbaum Scissors Adler N/A
Micro-introducer (5F) Galt KIT 002-01
Mosquito Forceps Adler N/A
Motor Herbach and Rademan H1-08
Oxymorphone Endo Labs NDC: 63481-624-10
PKH26 Dye Kit Sigma-Aldrich PKH26GL-1KT
Porcine Serum Gemini Bio Products 100-115 2% concentration in full growth medium
Potts Scissors Adler N/A
Precise Vista Skin Stapler 3M 3998
PVC Tubing McMaster-Carr 7132K117 expanded ID 15.88 mm,
recovered ID 7.95 mm
Right Angle Medium Size Adler N/A
Scalpel Blade (#10-15) Bard 373910
Silicone Tubing McMaster-Carr 51735K26 16.64 mm OD, 9.52 mm ID
Syringe (5 cc) BD Biosciences 309603
Tegaderm 3M 90001
Three-way Stopcock Kendall 170060
Ti Tube Tico Titanium N/A Specified as ½" OD, .065" wall, .370" ID, .1737 lbs/ft
Trypsin Lonza Inc. CC-5012
Trypsin Neutralizing Solution (TNS) Lonza Inc. CC-5002 0.03%
Vetropolycin Pharmaderm Animal Health NAC #: 12920110
Vicryl Suture (3-0) Ethicon Inc. J808T
Water Bath Sonicator Branson B200

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Achneck, H. E. Pathophysiology of bleeding and clotting in the cardiac surgery patient: from vascular endothelium to circulatory assist device surface. Circulation. 122, 2068-2077 (2010).
  2. Achneck, H. E., Sileshi, B., Lawson, J. H. Review of the biology of bleeding and clotting in the surgical patient. Vascular. 16, 6-13 (2008).
  3. Arvidsson, S., Askendal, A., Tengvall, P. Blood plasma contact activation on silicon, titanium and aluminium. Biomaterials. 28, 1346-1354 (2007).
  4. Achneck, H. E. The biocompatibility of titanium cardiovascular devices seeded with autologous blood-derived endothelial progenitor cells: EPC-seeded antithrombotic Ti Implants. Biomaterials. 32, 10-18 (2011).
  5. Kang, C., Bonneau, M., Brouland, J. P., Bal dit Sollier, C., Drouet, L. In vivo pig models of venous thrombosis mimicking human disease. Thromb Haemost. 89, 256-263 (2003).
  6. Ueberrueck, T. Comparison of the ovine and porcine animal models for biocompatibility testing of vascular prostheses. J Surg Res. 124, 305-311 (2005).
  7. Velik-Salchner, C. Normal values for thrombelastography (ROTEM) and selected coagulation parameters in porcine blood. Thromb Res. 117, 597-602 (2006).
  8. Yoder, M. C. Redefining endothelial progenitor cells via clonal analysis and hematopoietic stem/progenitor cell principals. Blood. 109, 1801-1809 (2007).
  9. Achneck, H. E. American Heart Association Scientific Sessions, Abstract Oral Sessions, Medical Aspects End Stage Heart Failure: Transplantation and Device Therapies. (2010).
  10. Achneck, H. E. Regenerating titanium ventricular assist device surfaces after gold/palladium coating for scanning electron microscopy. Microsc Res Tech. 73, 71-76 (2010).
  11. Ford, J. W., Welling, T. H., Stanley, J. C., Messina, L. M. PKH26 and 125I-PKH95: characterization and efficacy as labels for in vitro and in vivo endothelial cell localization and tracking. J Surg Res. 62, 23-28 (1996).
Otolog Endotelyal progenitör Hücre-Yayımlama Teknoloji ve Büyük Hayvan Modeli Kardiyovasküler Cihazlar için Biyouyumluluk Testleri
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Jantzen, A. E., Lane, W. O., Gage, S. M., Haseltine, J. M., Galinat, L. J., Jamiolkowski, R. M., Lin, F., Truskey, G. A., Achneck, H. E. Autologous Endothelial Progenitor Cell-Seeding Technology and Biocompatibility Testing For Cardiovascular Devices in Large Animal Model. J. Vis. Exp. (55), e3197, doi:10.3791/3197 (2011).More

Jantzen, A. E., Lane, W. O., Gage, S. M., Haseltine, J. M., Galinat, L. J., Jamiolkowski, R. M., Lin, F., Truskey, G. A., Achneck, H. E. Autologous Endothelial Progenitor Cell-Seeding Technology and Biocompatibility Testing For Cardiovascular Devices in Large Animal Model. J. Vis. Exp. (55), e3197, doi:10.3791/3197 (2011).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter