Summary
Альтернативный способ выделения мышиных эмбриональных мотонейроны от спинного мозга описывается. Метод принимает во внимание тот факт, что лектина может связываться с низким сродством роста нервов p75NTR рецептор фактора. Это лектина основе preplating позволяет очистки аналогичен режиму, специфических антител против p75NTR.
Abstract
Спинной мотонейронов развиваться в направлении постмитотических стадии, через раннее эмбриональное развитие нервной системы, а затем вырастают из дендритов и аксонов. Нейроэпителиальных клеток нервной трубки, которые выражают Nkx6.1 являются уникальными клеток-предшественников для спинальных мотонейронов 1. Хотя постмитотических мотонейронов продвижения к их окончательное положение и организовать себя в колонны вдоль спинного тракта 2,3. Более 90% всех этих дифференцированных и расположены мотонейроны выразить транскрипционных факторов Островок 1 / 2. Они иннервируют мышцы конечностей, а также тела и внутренних органов. Среди прочего, мотонейроны обычно выражают высокую рецепторов сродством к мозгу нейротрофического фактора (BDNF) и нейротрофина-3 (NT-3), тропомиозин связанных киназы В и С (TrkB, TrkC). Они не выражают тропомиозин связанных киназы (TrkA) 4. Рядом две высокие рецепторы близости, мотонейроны действительно выражают низким сродством нейротрофина рецептор p75 NTR. P75 NTR может связать все нейротрофинов с аналогичными, но более низким сродством ко всем нейротрофинов, чем высокое сродство рецепторов свяжет зрелых нейротрофинов. В течение эмбрионального спинного мозга, p75 NTR исключительно выраженную спинного мотонейронов 5. Это были использованы для разработки методов мотонейрона изоляции, чтобы очистить клетки от подавляющего большинства окружающих клеток 6. Изоляция мотонейронов с помощью специфических антител (панорамирование) против внеклеточные домены p75 NTR имеет оказалась дорогой метод, как количество антител, используемых для одного эксперимента высок из-за размера пластины используются для панорамирования. Гораздо более экономичной альтернативой является использование лектина. Лектин было показано, что специфически связываться с p75 NTR, а 7. Следующий метод описывает альтернативные технологии с использованием агглютинин зародышей пшеницы для preplating процедуру вместо p75 NTR антител. Лектин очень недорогая альтернатива p75 NTR антител и очистки классов использованием лектина сопоставимы, что и p75 NTR антител. Мотонейронов из эмбрионального спинного мозга могут быть изолированы с помощью этого метода, выжить и развиваться из нейритов.
Protocol
Для специальных реагентов: см. табл. 1. Все другие реагенты перечисленные в культуре клеток класса качества полученных из Sigma Aldrich.
1. PORN-H/laminin покрытия посуды / покровные
- Подготовка рабочего раствора 0,5 мг / мл Poly-DL-орнитин гидробромид (ПОРНО-H) в 150 мМ боратном буфере рН 8,35.
- Маточного раствора 50 мг ПОРНО / 1 мл буфера борат может быть подготовлен заранее и хранить при температуре -20 ° C.
- Стерилизовать стекла покровные на пылающий в 100% этанола, и пусть они воздушно-сухой.
- Обложка поверхности с достаточным ПОРНО-H решение в течение ночи при 4 ° C.
- На следующий день мыть три раза стерилизованной воды и воздушно-сухой покровные.
- Подготовка рабочего раствора 2,5 мкг / мл ламинин в HBSS
- Порции могут храниться при температуре -20 ° C. Оттепель при 4 ° С непосредственно перед применением.
- Обложка поверхности ПОРНО-H-покрытием покровные с ламинин решение, и пусть они инкубировать в течение 2 ч при комнатной температуре до использования.
2. Лектин покрытие очистки пластины
- Приготовить раствор из 10 мМ Трис в стерилизованной воды, рН 9,5.
- Добавить лектина (решения лектина (Sigma L9640) порошка в HBSS) до конечной концентрации 10 мкг / мл.
- Пальто поверхности 10 см клеточных культур блюдо с 8 мл лектина решение и пусть он инкубировать в течение 30 мин при комнатной температуре.
- Промыть пластины в три раза с HBSS и хранить в HBSS до использования.
- Подготовка 30мм KCl, 0,8% (м / о) NaCl деполяризации-решения. Стерилизовать фильтрацией и хранят при комнатной температуре (RT).
3. Мотонейрона культуральной среде
- Оттепель лошадиной сыворотки на ночь при 4 ° С и инактивируют при 55 ° С в течение 30 мин, Алиготе в 5 мл и хранят при температуре -20 ° C. Оттепель аликвоту непосредственно перед использованием при комнатной температуре.
- Магазин B27-дополнение в 1 мл aliqouts при температуре -20 ° C. Оттепель B27 дополнения при комнатной температуре непосредственно перед применением. Избегайте замораживания и оттаивания.
- Алиготе glutamax в 0,5 мл аликвоты и храните при температуре от -20 ° C и использовать его на 1:100.
- Подготовка исходного раствора 10 мкг / мл CNTF в стерилизованной воды с 0,1% БСА. Хранить при -20 ° C.
- Смешайте 46 мл neurobasal среде с 2,5 мл лошадиной сыворотки, 1 мл B27-дополнения и 0,5 мл glutamax непосредственно перед использованием.
- Добавить CNTF до конечной концентрации 10 нг / мл среды и предварительно теплой среды до 37 ° C.
4. Спинной рассечение шнур
- Жертва E12.5 беременной мыши и удалить эмбрионов тщательно. Добавьте достаточно РТ HBSS, чтобы полностью покрыть эмбрионов.
- Удалите головы и хвоста и положите эмбриона резервное копирование с оседлала конечностей.
- Fix эмбриона с одним щипцами и удалить внешнюю оболочку с другими щипцами.
- Удаление спинного мозга, прокалывая щипцов под нее и поднимите ее с пилообразный движений по обе стороны от спинного мозга.
- Передача изолированных спинного мозга новое блюдо с HBSS и открытый центральный канал спинного мозга на спинной стороне.
- Удалить спинной ганглий корень, удалив ограждающих мозговых оболочек спинного мозга.
- Сбор поясничного отделов спинного мозга до 6 эмбрионов в лектина пластинки в трубку Eppendorf реакции заливается 1 HBSS мл и хранят на льду до подготовки делается.
5. Обогащение мотонейронов на основе лектина очистки
Примечание: Перед началом следующего шага, последние здесь готовят и prewarm среды (см. п. 3).
- Подготовка раствора трипсина, решая 1 г трипсина в 100 мл HBSS, хранить при температуре -20 ° С и оттаивания при температуре 4 ° C.
- Смешать 1 г трипсин-ингибитор с 98 мл HBSS и 2 мл 1 М HEPES рН 7,4, 1 мл аликвоты следует хранить при температуре 4 ° C.
- Передача трубка с спинной мозг, чтобы капот культуре клеток и осторожно удалить 700 мкл HBSS.
- Добавить 7,5 мкл раствора трипсина и смесь тщательно обращения трубки.
- Выполните trypsination в течение 8 минут при температуре 37 ° C.
- Остановить реакцию добавлением 30 мкл ингибитора трипсина и пипетку вверх и вниз (измельченного в порошок) тщательно 10-15 раз с 1000 мкл кончика пипетки, пока больше агрегатов ячейки видны. Повторите растирания с 20-200 мкл пипетки и соответствующие чаевые.
- Внесите ячейки раствор в HBSS заполненные лектина пластины и дисперсных клетки, мягко вращающиеся пластины.
- Держите лектина пластине в течение 60 минут при комнатной температуре на вибрации поверхности. Обложка его, чтобы избежать загрязнения.
- Удалить HBSS очень мягко и промыть пластины тщательно 4 раза подогретого HBSS, чтобы удалить фрагменты клеток и не привязан / одиноких клеток.
- Сразу же после последней промывки, добавьте 500 мкл раствора деполяризации на тарелку и дайте ему инкубировать 1 мин.
- Содействие отряд лектин связан клетки путем встряхивания инажав пластину.
- Заполнение пластина с 2 мл подогретого культуральной среде и передачи в трубке 15 мл сокола.
- Граф числа клеток с камеры подсчета Нойбауэр.
- Пластина ячейку ламинин покрытием или покровных пластин в соответствующее число в зависимости от приложения.
- Выполните среда обмена на 1-й день, а затем каждый второй день тщательным замены 50% от старой среды. Всегда используйте предварительно нагревают, свежеприготовленный новой среде культуры.
6. Представитель Результаты:
Эмбриональные мотонейронов может быть получен из мышиных эмбрионов на E12 на E14. 2-3% от общей численности населения ячейки поясничного спинного мозга состоит из мотонейронов и, как задний корешок ганглиозных нейронов являются p75 NTR-положительные, так, важно, чтобы избавиться от этих клеток, прежде чем начать лектина основе preplating процедуры ( Для обзора см. Рисунок 1 и Рисунок 2). Во-вторых, мозговые оболочки включают сильно делящихся клеток, которые должны быть исключены, а также, поскольку они не могут быть полностью удалены от лектина основе preplating процедуры (рис. 2 и рис 3). В худшем случае, эти клетки могут перерасти культуры пластин. Представитель фотографии на рис 3B и 3D также дает представление о низкой плотности клеток после мытья процедуры были выполнены (см. шаг 5.9 протокола). Культуры эмбриональных мотонейронов мыши, как правило, поддерживается на срок до пяти-семи дней. За это время клетки установить их нейритов до максимальной длины (рис. 4). Нейритов длины сильно зависят от подложки, на пластины 8. Типичный субстрат ламинин который нанесен на ПОРНО-H покрыты блюда культуры. Мотонейронов может расти на других или менее определены субстратов, как и внеклеточных матриц, порожденных воды лизис 8. В тех случаях, субоптимального покрытия, нейритов длины и площади роста конуса снизилась и гибель клеток обычно увеличивается. Трофические поддержка играет ключевую роль для выживания эмбриональных мотонейронов мыши в культуре. Выживание первоначально покрытием клеток на день семь снизится до 10% до 20% без трофических поддержки 6. Мозг нейротрофического фактора (BDNF) и цилиарного нейротрофических факторов (CNTF) являются наиболее часто используемых факторов, но другие могут способствовать выживанию, а также [Лейкемия фактора тормозных (LIF), Cardiotrophin-1 (СТ-1), основной фактор роста фибробластов (bFGF ), инсулин-подобного фактора роста 1 (IGF-1), 9].
Рисунок 1. Поток схема подготовки эмбриональных мотонейронов мыши. Схематический рисунок иллюстрирует различные шаги для изоляции и культуре мышиных эмбриональных мотонейронов. Сокращения: SC: спинного мозга; HBSS: Хэнкс сбалансированный солевой раствор; МН: мотонейрона.
Рисунок 2 Выделение поясничной части спинного мозга от E12.5 мыши:.. E12.5 эмбриона мыши. Для следующего шага, голова и хвост удаляются, а тело находится в спинном положении вверх B: Эмбрион в спинном положении вверх. Пинцет слева и справа от спинного мозга эмбриона фиксации тела в его положении. Один из щипцов впоследствии используется для резки кожи и нарезать под спинной мозг других используется для фиксации эмбриона в своей позиции C:. Изолированные спинного мозга от E12.5 эмбриона мыши. Части спинного мозга (шейный, грудной, поясничный) указаны. Спинной мозг окружен мозговые оболочки и часть спинных ганглиев корень еще приложить к ним D:. Спинного мозга продольно вырезом на спинной стороне, чтобы открыть его в сторону центрального канала E:. Мозговые оболочки на брюшной стороне в настоящее время вылетел из уплощенной спинной мозг. Примечание: В то время снял, поясничной части отмечен небольшой разрез F:. Только поясничной части спинного мозга, принимается для дальнейших процедур.
Рисунок 3 Определение и изоляция Островок-позитивные клетки от поясничного спинного мозга эмбрионов мыши E12.5:.. Островок-1 / 2 антитела этикетки мотонейрона столбцы в эмбриональном поясничного спинного мозга (красный, стрелка) и Hoechst этикетки всех ядер в пределах раздела. Поперечное сечение E12.5 LUMAR спинного мозга. E12.5 эмбрионов мыши были погружения фиксировали в 4% параформальдегида в течение 6 ч, промывали 3 раза фосфатным буферным раствором и обрабатывают сахарозы в соответствии со стандартными процедурами. Cryosections 20 мкм были сделаны с помощью криостата и разделы были обработаны для окрашивания immunhistochemical соответствии со стандартными процедурами 11. Разделы изделия впоследствии помечены Hoechst для локализации клеточных ядер. Обратите внимание, чтозадний корешок ганглиозных нейронов являются Islet-1/2-positive, а также и о том, что подготовка методика исключает эту ткань части из изоляции процедура B:. Островок-1 / 2 помечены (красный, стрелка) диссоциированных поясничного клеток спинного мозга от E12. 5 эмбрионов, слева - до, так и справа - после лектина основе preplating. Клетки контрастно с Hoechst визуализировать все клеточные ядра C:. Количественная оценка Islet-1/2-positive клетки до и после лектина основе preplating D:. Nkx6.1 меченых мотонейронов от E12.5 эмбрионов после одного дня в области культуры. Клетки контрастно с Hoechst в cisualieze всех ядер. Обратите внимание, что 90% всех клетках Nkx6.1 положительным. Сокращения: SC: спинного мозга; МН: мотонейрона; DRG: спинной ганглий корня.
Рисунок 4 Характеристика E12.5 мотонейронов мыши и B:.. Обогащенный изолированных E12.5 мыши поясничного спинного мотонейронов выразить p75 NTR на 0 дней в пробирке (0div) и на 2-й день в пробирке (2div). Клетки фиксировали 4% параформальдегида, а затем окрашивают в течение p75 NTR в соответствии со стандартными процедурами. Клетки контрастно использованием Hoechst для визуализации всех ядер C:. Обогащенный мотонейронов через 5 дней в пробирке (5div) на ПОРНО-H и ламинин, как культура субстратов и в присутствии окрашенных CNTF для β-III-тубулина. Обратите внимание, что клетки выросли задолго невриты и отображения типичной морфологией мотонейрона с одним дольше (разветвленные) процесса и одного или нескольких коротких процессов (аксонов и дендритов). Сокращения: MN: мотонейрона; дел: дней в лабораторных условиях.
| После диссоциации без Лектин основе preplating | |||
| Общее количество клеток / SC | Трипановый сине-позитивных клеток [%] | Islet-1/2- позитивных клеток [%] | |
| 1 | 995,0 | 13,1 | 9,5 |
| 2 | 889,4 | 8,0 | 10,0 |
| 3 | 1.180.0 | 11,0 | 10,8 |
| Среднее ± SD | 1.021.0 ± 147,1 | 10,7 ± 2,6 | 10,1 ± 0,7 |
| С лектина основе preplating | |||
| Количество клеток после preplating / SC | Трипановый сине-позитивных клеток [%] | Islet-1/2- позитивных клеток [%] | |
| 1 | 189,6 | 9,9 | 70,5 |
| 2 | 168,8 | 3,7 | 76,1 |
| 3 | 125,0 | 0,0 | 72,5 |
| Среднее ± SD | 161,1 ± 33,0 | 4,5 ± 5,0 | 73,0 ± 2,8 |
Таблица 1. Резюме представителя процедуры изоляции для мышиных эмбриональных мотонейроны со сцены E12.5. Результаты 3-х различных процедурах изоляции специально для этой цели даются как общее число или процент числа ± SD. Сокращенное наименование: SC: спинного мозга; SD: стандартное отклонение.
| Островок-1 / 2 положительных клеток с p75 панорамирование [%] | Островок-1 / 2 положительных клеток с лектина основе панорамирование [%] |
| 92,0 ± 3,5 1 | 73,0 ± 2,8 |
Таблица 2. Сравнение Лектин основе и p75 основе 1 панорамирование номера мотонейрона клетки. Результаты представлены в процентах числа ± SD.
Discussion
Преимущество этого лектина основе preplating техники является то, что дешевле, чем p75 NTR основе панорамирование процедуры, и лектин более стабилен, чем антитела. Обогащения приведены на рис. 2 и Tab. 1 показывает, что процедура позволяет очистки одинаковое число клеток и что большинство из них клетки экспрессируют маркер мотонейрона Островок-1 / 2. Наиболее важным шагом является изоляция процедура поясничного спинного мозга. Удаление мозговых оболочек и ДРГ (рис. 2) имеет важное значение для следующей процедуры очистки лектина основе preplating. Если бы это было правильно управлять, почти все клетки экспрессируют p75 NTR (для репрезентативную картину см. рис. 3а). Причина разницы между выражением Островок-1 / 2 и p75 NTR, скорее всего, потому что поясничных мотонейронов дифференциально выразить высшие и низшие уровни Островок-1 / 2 10. В случае низкого уровня Островок-1 / 2 выражение это, возможно, избежал нашего внимания в immuncytochemical окрашивания и последующего подсчета, как мы были строгими по отношению к положительным по сравнению с отрицательным клеток (табл. 1). Кроме того, в таблице 1 наглядно показывает, что изолированные клетки выживают процедура в здоровом состоянии, как Есть только несколько трипанового-синих положительных клеток, которые указывают, что клетки необратимо повреждены. Это альтернативой процедура также позволяет изоляции мотонейроны из одного эмбриона и, следовательно, смешанных пометов генотипа из эмбриональных мышей. В заключение, эта альтернатива панорамирование процедуру с p75 NTR антител 6 имеет аналогичные, если не идентичными возможностями с точки зрения возможных областей применения и обеспечивает дешевый и эффективный альтернативный метод очистки для мышиных эмбриональных мотонейронов.
Disclosures
Нет конфликта интересов объявлены.
Acknowledgments
Мы благодарим Сандра Bargen за отличную техническую поддержку. Эта работа была поддержана белка научно-исследовательского отдела (ПДР, Т. П. А1.2 (RC и TS), а рублей исследований Фондом, Rektoratsprogramme -. Wissenschaftlicher Nachwuchs (AK) моноклональные антитела 39.4D5 и F55A10 были получены из Гибридома развитием исследований Банк (DSHB, Iowa City, IA).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Poly-DL-ornithine hydrobromide | Sigma-Aldrich | P8638 | |
| Laminin | Invitrogen | 23017-015 | |
| HBSS | GIBCO, by Life Technologies | 14170 | |
| Glass coverslips | Thermo Fisher Scientific, Inc. | 10 or 14mm | |
| Lectin | Sigma-Aldrich | L5142 | |
| Cell culture dish | Nalge Nunc international | 150350 | Nunclon delta surface |
| Horse serum | Linaris | SHD3250ZK | Each batch has to be tested for MN culture |
| B27 Supplement | GIBCO, by Life Technologies | 17504-044 | |
| Glutamax | GIBCO, by Life Technologies | 35050-038 | |
| CNTF | Sigma-Aldrich | N0513 | |
| BSA | Applichem | A1391 | |
| Neurobasal | GIBCO, by Life Technologies | 21103-041 | |
| Forceps | Stainless steel, size 4 or 5 | ||
| Trypsin | Worthington Biochemical | LS003707 | |
| Trypsin-Inhibitor | Sigma-Aldrich | T6522 | |
| Anti-Islet-1 | DSHB | 39.4D5 | Cell culture supernatant |
| Anti-Nkx6.1 | DSHB | F55A10 | Cell culture supernatant |
| Anti-p75NTR | Abcam | Ab8874 | |
| Table 3. Table of specific reagents and equipment. | |||
References
- Vallstedt, A. Different levels of repressor activity assign redundant and specific roles to Nkx6 genes in motor neuron and interneuron specification. Neuron. 31, 743-755 (2001).
- Tsuchida, T. Topographic organization of embryonic motor neurons defined by expression of LIM homeobox genes. Cell. 79, 957-970 (1994).
- Lin, J. H. Functionally related motor neuron pool and muscle sensory afferent subtypes defined by coordinate ETS gene expression. Cell. 95, 393-407 (1998).
- Wiese, S., Beck, M., Karch, C., Sendtner, M. Signalling mechanisms for survival of lesioned motoneurons. Acta Neurochir. , 21-35 (2004).
- Gavins, F. N., Chatterjee, B. E. Intravital microscopy for the study of mouse microcirculation in anti-inflammatory drug research: focus on the mesentery and cremaster preparations. J. Pharmacol. Toxicol. Methods. 49, 1-14 (2004).
- Bullen, A. Microscopic imaging techniques for drug discovery. Nat. Rev. Drug Discov. 7, 54-67 (2008).
- Hazelwood, K. L. Entering the Portal: Understanding the Digital Image Recorded Through a Microscope. Imaging Cellular and Molecular Biological Functions. , 3-43 (2007).
- Hickey, M. J. L-selectin facilitates emigration and extravascular locomotion of leukocytes during acute inflammatory responses in vivo. J. Immunol. 165, 7164-7170 (2000).
- Cara, D. C., Kubes, P. Intravital microscopy as a tool for studying recruitment and chemotaxis. Methods Mol. Biol. 239, 123-132 (2004).
- Liu, L. LSP1 is an endothelial gatekeeper of leukocyte transendothelial migration. J. Exp. Med. 201, 409-418 (2005).
- Heit, B. PI3K accelerates, but is not required for, neutrophil chemotaxis to fMLP. J. Cell Sci. 121, 205-214 (2008).
