Summary
ووصف طريقة بديلة لعزل العصبونات الحركية الفأر الجنينية من الحبل الشوكي. الأسلوب يأخذ في الاعتبار حقيقة أن lectin يمكن ربط العصب تقارب منخفضة p75NTR مستقبلات عوامل النمو. هذا preplating lectin المستندة يسمح تنقية مماثلة لتلك التي مع الأجسام المضادة المحددة ضد p75NTR.
Abstract
العصبونات الحركية في العمود الفقري نحو تطوير المراحل الجنينية المبكرة تالية للتفتل من خلال تطوير النظام العصبي ، وتنمو في وقت لاحق من التشعبات والمحاور. خلايا عصبية ظهارية من الأنبوب العصبية التي تعبر عن Nkx6.1 هي الخلايا السليفة فريدة للعصبونات حركية الشوكي 1. على الرغم من التحرك نحو حركية مماثلة تالية للتفتل موقفهم النهائي وتنظيم أنفسهم في أعمدة على طول المسالك 2،3 الشوكي. أكثر من 90 ٪ من كل هذه العصبونات الحركية متباينة ، ووضع تعبير عن عوامل النسخ جزيرة 1 / 2. انهم يعصب عضلات الاطراف وكذلك من الجسم والأجهزة الداخلية. من بين أمور أخرى ، أعرب العصبونات الحركية عادة مستقبلات عامل تقارب عالية للعصبية في الدماغ مشتقة (BDNF) وNeurotrophin 3 (NT - 3) ، والتروبوميوزين ذات الصلة كيناز باء وجيم (TrkB ، TrkC). انها لا تعبر عن كيناز التروبوميوزين المتصلة A 4 (TrkA). بجانب مستقبلات two تقارب عالية ، والعصبونات الحركية لا تعبر عن انخفاض مستقبلات neurotrophin تقارب NTR P75. يمكن ربط جميع NTR P75 neurotrophins مع تقارب مماثلة لكنها أقل لجميع neurotrophins من المستقبلات عالية تقارب وربط neurotrophins ناضجة. داخل النخاع الشوكي الجنينية ، وأعرب عن حصرا NTR P75 من العصبونات الحركية في العمود الفقري 5. وقد استخدمت هذه المعرفة لتطوير تقنيات العزل العصبون الحركي لتنقية الخلايا من الغالبية العظمى من الخلايا المحيطة 6. تحولت عزل العصبونات الحركية مع مساعدة من أضداد محددة (بالغسل) ضد من المجالات خارج الخلية P75 NTR إلى أن تكون وسيلة مكلفة وكمية الأجسام المضادة المستخدمة في تجربة واحدة هي عالية نظرا لحجم لوحة المستخدمة لبالغسل. وثمة بديل أكثر اقتصادا هو استخدام lectin. وقد تبين Lectin ربط خصيصا لP75 NTR فضلا 7. الأسلوب التالي يصف أسلوب بديل باستخدام القمح الجرثومية راصة لإجراء preplating بدلا من الأضداد NTR P75. وlectin هو بديل رخيص الثمن للغاية على الضد NTR P75 وتنقية الصفوف باستخدام lectin مماثلة لتلك التي في جسم NTR P75. يمكن عزل العصبونات الحركية من الحبل الشوكي الجنينية باستخدام هذا الأسلوب ، البقاء والنمو خارج neurites.
Protocol
لكواشف خاصة : انظر تبويب. 1. كل الكواشف الأخرى المدرجة في خلية ثقافة الجودة الصف تم الحصول عليها من الدريتش سيغما.
1. PORN-H/laminin طلاء أطباق / coverslips
- يعد حل العاملة من 0.5 هيدروبروميد بولي DL - الأورنيثين ملغ / مل (PORN - H) في 150 ملي بورات 8.35 درجة الحموضة عازلة.
- ويمكن إعداد محلول المخزون من 50 ملغ PORN / 1 مل العازلة بورات مسبقا وحفظها عند درجة حرارة -20 درجة مئوية.
- coverslips تعقيم الزجاج المشتعلة في الإيثانول 100 ٪ والسماح لهم الجو الجاف.
- تغطية السطح مع حل PORN - H كافية بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية.
- في اليوم التالي يغسل ثلاث مرات بالماء المعقم وcoverslips الهواء الجاف.
- يعد حل العاملة من 2.5 ميكروغرام / مل في laminin HBSS
- يمكن تخزينها في Aliquots -20 درجة مئوية. ذوبان الجليد في 4 درجات مئوية على الفور قبل استخدامه.
- تغطية سطح coverslips PORN - H - المغلفة مع الحل laminin والسماح لهم لاحتضان ما لا يقل عن 2 ساعة في درجة حرارة الغرفة حتى الاستخدام.
2. Lectin طلاء من لوحة تنقية
- يعد حل تريس 10 مم في الماء المعقم ، ودرجة الحموضة 9.5.
- إضافة lectin (حل lectin (سيغما L9640) المسحوق في HBSS) إلى التركيز النهائي من 10 ميكروغرام / مل.
- معطف سطح صحن 10 سم ثقافة الخلية مع 8 مل من محلول lectin والسماح لها احتضان ما لا يقل عن 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
- غسل لوحة ثلاث مرات مع HBSS وتخزينها في HBSS حتى الاستخدام.
- إعداد بوكل 30mM ، 0.8 ٪ (ث / ت) كلوريد الصوديوم ، depolarisation الحل. تعقيم بواسطة الترشيح وتخزينها في درجة حرارة الغرفة (طن).
3. العصبون الحركي مستنبت
- حصان المصل ذوبان الجليد بين عشية وضحاها في 4 درجة مئوية و 55 درجة في تعطيل مئوية لمدة 30 دقيقة ، قسامة في 5 مل وتخزينها في -20 درجة مئوية. قسامة ذوبان الجليد قبل استخدامه مباشرة في RT.
- تخزين B27 - 1 في الملحق aliqouts مل في -20 درجة مئوية. ذوبان الجليد في ملحق B27 RT مباشرة قبل الاستعمال. تجنب تجميد والذوبان الدورات.
- glutamax قسامة إلى 0.5 مل aliquots وتخزينها في -20 درجة مئوية ، واستخدامه في 1:100.
- إعداد محلول المخزون من 10 ميكروغرام / لتر في مياه معقمة CNTF مع جيش صرب البوسنة 0.1 ٪. المحل في -20 درجة مئوية.
- مزيج 46 مل المتوسطة neurobasal مع 2.5 مل من مصل الحصان ، B27 - 1 مل و 0.5 مل تكملة glutamax مباشرة قبل الاستعمال.
- إضافة إلى تركيز CNTF النهائي المتوسطة نانوغرام / مل (10) والمتوسطة قبل الدافئة إلى 37 درجة مئوية.
4. تشريح الحبل الشوكي
- التضحية ماوس E12.5 الحوامل والأجنة إزالة بعناية. إضافة ما يكفي لتغطية RT HBSS تماما الأجنة.
- إزالة الرأس والذيل ووضع الجانب الخلفي الجنين مع الاطراف قللت.
- الإصلاح الجنين مع واحد ملقط وإزالة الجلد الخارجي مع ملقط الأخرى.
- إزالة الحبل الشوكي بواسطة ملقط اختراق تحتها ورفع هذا الامر مع ورأى مثل التحركات على جانبي الحبل الشوكي.
- نقل النخاع الشوكي لعزل طبق جديد مع HBSS وفتح القناة المركزية للحبل الشوكي على الجانب الظهري.
- إزالة العقد الجذرية الظهرية عن طريق إزالة أرفق السحايا من الحبل الشوكي.
- جمع الأجزاء القطنية من النخاع الشوكي لتصل إلى 6 أجنة في لوحة lectin في أنبوب رد فعل إيبندورف مليئة HBSS 1 مل وتخزينها على الجليد حتى القيام به هو إعداد.
5. إثراء العصبونات الحركية التي lectin المستندة تنقية
ملاحظة : قبل البدء في الخطوات المقبلة ، وآخر هنا إعداد وprewarm المتوسط (راجع الخطوة 3).
- يعد حل عن طريق حل التربسين التربسين 1 غرام في HBSS 100 مل ، في تخزين -20 درجة مئوية ، وذوبان الجليد في 4 درجات مئوية.
- مزيج 1G مثبط التربسين ، مع HBSS مل 98 و 2 مل من 1 M 7.4 درجة الحموضة HEPES ، ينبغي أن يتم تخزين 1 aliquots مل في 4 درجة مئوية.
- نقل الأنبوب مع النخاع الشوكي إلى خلية ثقافة وإزالة الغطاء بعناية 700 ميكرولتر من HBSS.
- إضافة 7.5 حل التربسين ميكرولتر وتخلط بواسطة أنبوب لعكس بدقة.
- trypsination لتنفيذ 8 دقيقة في 37 درجة مئوية.
- وقف رد الفعل من خلال إضافة 30 مثبط التربسين ميكرولتر ماصة وصعودا وهبوطا (متمزج) بعناية 10-15 مرات مع تلميح ميكرولتر ماصة 1000 حتى المجاميع خلية لا أكثر مرئية. مع تكرار سحن ماصة 20-200 ميكرولتر وطرف المقابل.
- ماصة حل الخلية في لوحة مليئة HBSS lectin وتفريق الخلايا عن طريق تناوب بلطف لوحة.
- الحفاظ على لوحة lectin لمدة 60 دقيقة في RT على سطح الاهتزاز الحر. تغطية ذلك لتجنب التلوث.
- إزالة HBSS بلطف شديد ، ويغسل وحة بعناية مع 4 مرات قبل تحسنت HBSS لإزالة أجزاء الخلايا والخلايا غير مرفقة / غير مرتبط.
- مباشرة بعد الخطوة غسل الماضي ، إضافة 500 ميكرولتر حل depolarisation إلى لوحة ، والسماح لها لاحتضان 1min.
- تيسير مفرزة من خلايا ملزمة lectin التي تهتز والتنصت على لوحة.
- تملأ اللوحة مع 2 مل مستنبت قبل تحسنت ونقل إلى أنبوب 15 مل الصقر.
- عد عدد الخلايا مع غرفة الفرز نويباور.
- لوحة الخلية على coverslips والمغلفة أو لوحات laminin في عدد مناسب اعتمادا على التطبيق.
- إجراء تبادل المتوسطة في يوم 1 و بعد ذلك كل يوم الثاني على التوالي عن طريق استبدال حذرا من 50 ٪ من متوسط العمر. استخدم دائما قبل تحسنت ، الطازجة المتوسطة ثقافة جديدة.
6. ممثل النتائج :
ويمكن الحصول على العصبونات الحركية جنينية من أجنة فئران في E12 E14 ل. 2-3 ٪ من مجموع السكان الخلايا من النخاع الشوكي القطني ويتكون من العصبونات الحركية والخلايا العصبية الجذرية الظهرية العقدية هي P75 NTR إيجابية كذلك ، فمن المهم للتخلص من هذه الخلايا قبل البدء في إجراء preplating lectin على أساس ( لمحة عامة انظر الشكل 1 والشكل 2). وثانيا ، السحايا وتشمل الخلايا المنقسمة بشدة التي ينبغي استبعادها أيضا ، كما أنها لا يمكن إزالتها بشكل صحيح عن طريق إجراء preplating lectin القائم على (الشكل 2 والشكل 3). في أسوأ الحالات ، يمكن لهذه الخلايا لوحات اكتسى الثقافة. صور تمثيلية في الشكل 3B و 3D أيضا إعطاء انطباع عن وأقل كثافة الخلية بعد الغسيل الإجراءات التي تم تنفيذ (انظر الخطوة 5.9 من البروتوكول). وعادة ما يتم الاحتفاظ ثقافات العصبونات الحركية الماوس الجنينية لمدة تصل إلى خمسة أو سبعة أيام. خلال هذه الفترة الزمنية لإنشاء خلايا neurites على ما يصل إلى أقصى طول (الشكل 4). أطوال Neurite تعتمد بشدة على الركيزة لوحات 8. الركيزة نموذجي هو الذي laminin المغلفة على PORN - H الأطباق الثقافة تغطيتها. يمكن أن تنمو العصبونات الحركية أيضا على ركائز أخرى أو تعريف أقل ، مثل مصفوفات خارج الخلية التي تم إنشاؤها بواسطة تحلل المياه 8. في حالات طول الأمثل ، والطلاء والنمو neurite منطقة مخروط وانخفض موت الخلايا ويزيد عادة. الدعم الغذائي يلعب دورا حاسما لبقاء العصبونات الحركية الفأر الجنينية في الثقافة. البقاء على قيد الحياة من خلايا مطلي في البداية على إسقاط سبعة أيام إلى 10 ٪ إلى 20 ٪ دون دعم غذائي 6. عامل التغذية العصبية في الدماغ مشتقة (BDNF) وعامل التغذية العصبية الهدبية (CNTF) هي العوامل الأكثر شيوعا ولكن يمكن للآخرين وكذلك تعزيز بقاء العوامل المثبطة bFGF اللوكيميا (LIF) ، Cardiotrophin - 1 (CT - 1) ، وعامل نمو الخلايا الليفية الأساسية ([ ) ، الذي يشبه الانسولين عامل النمو 1 (IGF - 1) 9].
مخطط تدفق الرقم 1. لإعداد العصبونات الحركية الماوس الجنينية. الرسم التخطيطي يوضح الخطوات المختلفة لعزل وثقافة حركية مماثلة الفأر الجنينية. الاختصارات : SC : الحبل الشوكي ؛ HBSS : هانكس محلول الملح المتوازن ؛ MN : العصبون الحركي.
الشكل 2 عزل الجزء القطني من النخاع الشوكي من E12.5 ماوس :. E12.5 جنين الفأر. للخطوة التالية ، تتم إزالة الرأس والذيل ويتم وضع الجسم في موقف الظهرية B المتابعة : الأجنة في موقف الظهرية الهاتفي. ملقط في اليسار واليمين من الحبل الشوكي وتحديد الجسم الجنين في موقفها. يستخدم لاحقا واحدا من ملقط لقطع الجلد وقطع أسفل الحبل الشوكي يستخدم الآخر لإصلاح الجنين في موقفها C : الحبل الشوكي متفرقة من جنين فأر E12.5. يشار إلى أن أجزاء من الحبل الشوكي (عنق الرحم ، والصدر ، أسفل الظهر). وتحيط بالحبل الشوكي التي السحايا وجزء من العقد الجذرية الظهرية لا تزال تعلق لهم D : هو قطع الحبل الشوكي طوليا وعلى الجانب الظهري لفتحه في اتجاه قناة مركزية E :. السحايا وعلى الجانب البطني الآن أقلعت من الحبل الشوكي التي سويت بالأرض. ملاحظة : في حين أقلعت ، ويتميز الجزء القطني من قطع صغيرة F : يؤخذ عندها فقط الجزء القطني من النخاع الشوكي لمزيد من الإجراءات.
الشكل 3 تعيين وعزل جزيرة إيجابية الخلايا من النخاع الشوكي القطني من أجنة الفئران E12.5 ج :. التسميات جزيرة - 1 / 2 الضد الأعمدة العصبون الحركي داخل الحبل الشوكي القطني الجنينية (الأحمر والسهم) والتسميات هويشت جميع النوى داخل القسم. مقطع عرضي من الحبل الشوكي lumar E12.5. وأجنة الفئران E12.5 الغمر الثابتة في بارافورمالدهيد 4 ٪ لمدة 6 ساعات ، وغسلها 3 مرات مع الفوسفات مخزنة المالحة وتعامل مع السكروز وفقا للإجراءات القياسية. وقد اتخذت Cryosections من 20 ميكرون مع ناظم البرد وتمت معالجة الأجزاء لتلطيخ immunhistochemical وفقا للاجراءات المتبعة 11. لوير المقاطع المسمى لاحقا مع هويشت لتوطين نواة الخلية. علما بأنالخلايا العصبية الجذرية الظهرية العقدية هي Islet-1/2-positive وكذلك أن هذا الإجراء لا يشمل هذا إعداد أجزاء من النسيج لإجراء العزل B : جزيرة - 1 / 2 المسمى (أحمر ، السهم) فصل خلايا النخاع الشوكي القطني من E12. 5 الأجنة واليسار -- واليمين قبل -- بعد lectin المستندة preplating. وcounterstained الخلايا مع هويشت لتصور كل نواة خلية C :. الكمي لخلايا Islet-1/2-positive قبل وبعد lectin المستندة preplating D : Nkx6.1 العصبونات الحركية المسمى E12.5 من أجنة بعد يوم واحد في مجال الثقافة. وcounterstained الخلايا مع هويشت لcisualieze جميع النوى. علما بأن 90 ٪ من جميع الخلايا Nkx6.1 إيجابية. الاختصارات : SC : الحبل الشوكي ؛ MN : العصبون الحركي ؛ DRG : الظهرية العقدة الجذر.
توصيف الشكل 4 من العصبونات الحركية الماوس E12.5 ألف وباء :. اليورانيوم معزولة E12.5 الفأر الشوكي القطني عصبونات حركية التعبير P75 NTR في 0 أيام في المختبر (0div) وفي يوم 2 في المختبر (2div). تم إصلاح الخلايا مع بارافورمالدهيد 4 ٪ والملون لاحقا P75 NTR وفقا للاجراءات المتبعة. وكانت الخلايا باستخدام counterstained هويشت لتصور كل نواة C : العصبونات الحركية اليورانيوم بعد 5 أيام في المختبر (5div) على PORN - H وlaminin بمثابة ركائز الثقافة وبحضور ملطخة CNTF عن β - III - تويولين. لاحظ أن الخلايا قد نمت خارج neurites طويلة وعرض نموذجي مورفولوجيا العصبون الحركي مع أحد أطول (تشعبت) عملية واحدة أو أكثر من العمليات أقصر (محاور و dendrites). الاختصارات : MN : العصبون الحركي ؛ DIV : أيام في المختبر.
| بعد تفكك دون Lectin المستندة preplating | |||
| مجموع عدد الخلايا / SC | التريبان الأزرق إيجابية الخلايا [٪] | خلايا Islet-1/2- إيجابية [٪] | |
| 1 | 995.0 | 13،1 | 9،5 |
| 2 | 889.4 | 8،0 | 10،0 |
| 3 | 1.180.0 | 11،0 | 10،8 |
| يعني ± SD | 1.021.0 147.1 ± | 10،7 ± 2،6 | 10،1 ± 0،7 |
| مع lectin المستندة preplating | |||
| عدد من الخلايا بعد preplating / SC | التريبان الأزرق إيجابية الخلايا [٪] | خلايا Islet-1/2- إيجابية [٪] | |
| 1 | 189.6 | 9،9 | 70،5 |
| 2 | 168.8 | 3،7 | 76،1 |
| 3 | 125.0 | 0،0 | 72،5 |
| يعني ± SD | 161.1 ± 33.0 | 4،5 ± 5،0 | 73،0 ± 2،8 |
الجدول 1. وتعطى نتائج موجز إجراءات عزل العصبونات الحركية ممثل عن الفأر الجنينية من مرحلة E12.5. الفترة من 3 إجراءات العزل مختلفة خاصة لهذا الغرض والعدد الإجمالي أو أرقام مئوية ± SD. الاختصار : SC : الحبل الشوكي ؛ SD : الانحراف المعياري.
| جزيرة - 1 / 2 الخلايا إيجابية مع P75 [٪] بالغسل | جزيرة - 1 / 2 الخلايا إيجابية مع Lectin المستندة بالغسل [٪] |
| 92،0 ± 3،5 1 | 73،0 ± 2،8 |
الجدول 2. وترد مقارنة Lectin القاعدة ومقرها P75 - 1 بالغسل أرقام خلية العصبون الحركي النتائج كأرقام مئوية ± SD.
Discussion
ميزة هذه التقنية preplating lectin المستندة هو أنه أقل تكلفة من الإجراء NTR المستندة P75 بالغسل ، وlectin هي أكثر استقرارا من الأجسام المضادة. إثراء المدرجة في الشكل. (2) وتبويب. 1 يبين أن الإجراء يسمح لتنقية عدد مماثل من الخلايا وأن غالبية هذه الخلايا تعبر عن علامة العصبون الحركي جزيرة - 1 / 2. الخطوة الأكثر أهمية هو الإجراء لعزل النخاع الشوكي القطني. إزالة السحايا وDRGs في (الشكل 2) أمر ضروري لتنقية الإجراء التالي lectin المستندة preplating. إذا كان قد نجح هذا صحيح ، وتقريبا جميع خلايا تعبر عن NTR P75 (صورة لممثل انظر الشكل 3A). سبب الفرق بين التعبير عن جزيرة - 1 / 2 وP75 NTR هو على الارجح بسبب التعبير عن حركية مماثلة القطني تفاضليا المستويات العليا والدنيا للجزيرة 1 / 2 10. في حالة وجود مستويات منخفضة من جزيرة 1 - التعبير / 2 قد هربوا هذا اهتمامنا في تلطيخ immuncytochemical والفرز اللاحقة كما كنا صارمة فيما يتعلق الخلايا إيجابية في مقابل سلبية (Tab. 1). بالإضافة إلى ذلك ، ويبين الجدول 1 بوضوح أن الخلايا المعزولة الإجراء البقاء في حالة صحية جيدة ، وهناك عدد قليل فقط التريبان الأزرق الخلايا الإيجابية التي تشير إلى أن تلف الخلايا بشكل لا رجعة فيه. هذا الإجراء بديل يسمح أيضا عزل العصبونات الحركية من أجنة واحدة ، وبالتالي من الفضلات الوراثي مختلطة من الفئران الجنينية. في الختام ، هذا البديل إلى إجراء بالغسل مع الضد NTR P75 6 ومتشابهة إن لم تكن متطابقة من حيث القدرات النطاقات الممكنة التطبيق ويوفر طريقة فعالة ورخيصة بديلة لتنقية العصبونات الحركية الفأر الجنينية.
Disclosures
الإعلان عن أي تضارب في المصالح.
Acknowledgments
نشكر ساندرا Bargen حصول على الدعم الفني الممتاز. وأيد هذا العمل من قبل إدارة البحوث البروتين (PRD ، TP A1.2 (RC وTS) ، ومولعا RUB البحوث وRektoratsprogramme -- wissenschaftlicher Nachwuchs (AK) وتم الحصول على الاجسام المضادة و39.4D5 F55A10 من ورم هجين دراسات الإنمائية بنك (DSHB ، مدينة أيوا ، IA).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Poly-DL-ornithine hydrobromide | Sigma-Aldrich | P8638 | |
| Laminin | Invitrogen | 23017-015 | |
| HBSS | GIBCO, by Life Technologies | 14170 | |
| Glass coverslips | Thermo Fisher Scientific, Inc. | 10 or 14mm | |
| Lectin | Sigma-Aldrich | L5142 | |
| Cell culture dish | Nalge Nunc international | 150350 | Nunclon delta surface |
| Horse serum | Linaris | SHD3250ZK | Each batch has to be tested for MN culture |
| B27 Supplement | GIBCO, by Life Technologies | 17504-044 | |
| Glutamax | GIBCO, by Life Technologies | 35050-038 | |
| CNTF | Sigma-Aldrich | N0513 | |
| BSA | Applichem | A1391 | |
| Neurobasal | GIBCO, by Life Technologies | 21103-041 | |
| Forceps | Stainless steel, size 4 or 5 | ||
| Trypsin | Worthington Biochemical | LS003707 | |
| Trypsin-Inhibitor | Sigma-Aldrich | T6522 | |
| Anti-Islet-1 | DSHB | 39.4D5 | Cell culture supernatant |
| Anti-Nkx6.1 | DSHB | F55A10 | Cell culture supernatant |
| Anti-p75NTR | Abcam | Ab8874 | |
| Table 3. Table of specific reagents and equipment. | |||
References
- Vallstedt, A. Different levels of repressor activity assign redundant and specific roles to Nkx6 genes in motor neuron and interneuron specification. Neuron. 31, 743-755 (2001).
- Tsuchida, T. Topographic organization of embryonic motor neurons defined by expression of LIM homeobox genes. Cell. 79, 957-970 (1994).
- Lin, J. H. Functionally related motor neuron pool and muscle sensory afferent subtypes defined by coordinate ETS gene expression. Cell. 95, 393-407 (1998).
- Wiese, S., Beck, M., Karch, C., Sendtner, M. Signalling mechanisms for survival of lesioned motoneurons. Acta Neurochir. , 21-35 (2004).
- Gavins, F. N., Chatterjee, B. E. Intravital microscopy for the study of mouse microcirculation in anti-inflammatory drug research: focus on the mesentery and cremaster preparations. J. Pharmacol. Toxicol. Methods. 49, 1-14 (2004).
- Bullen, A. Microscopic imaging techniques for drug discovery. Nat. Rev. Drug Discov. 7, 54-67 (2008).
- Hazelwood, K. L. Entering the Portal: Understanding the Digital Image Recorded Through a Microscope. Imaging Cellular and Molecular Biological Functions. , 3-43 (2007).
- Hickey, M. J. L-selectin facilitates emigration and extravascular locomotion of leukocytes during acute inflammatory responses in vivo. J. Immunol. 165, 7164-7170 (2000).
- Cara, D. C., Kubes, P. Intravital microscopy as a tool for studying recruitment and chemotaxis. Methods Mol. Biol. 239, 123-132 (2004).
- Liu, L. LSP1 is an endothelial gatekeeper of leukocyte transendothelial migration. J. Exp. Med. 201, 409-418 (2005).
- Heit, B. PI3K accelerates, but is not required for, neutrophil chemotaxis to fMLP. J. Cell Sci. 121, 205-214 (2008).
