Summary
Ein alternativer Weg zur Isolierung von embryonalen Maus-Motoneurone aus dem Rückenmark beschrieben. Die Methode berücksichtigt die Tatsache, dass Lektin kann die geringe Affinität nerve growth factor receptor p75NTR binden. Das Lektin-basierte preplating ermöglicht eine Reinigung ähnlich wie mit einem spezifischen Antikörper gegen das p75NTR.
Abstract
Spinal Motoneuronen zu entwickeln in Richtung postmitotischen Etappen durch die frühe embryonale Entwicklung des Nervensystems und in der Folge wachsen Dendriten und Axone. Neuroepithelzellen des Neuralrohrs, dass ausdrückliche Nkx6.1 die einzigartige Vorläuferzellen für spinale Motoneurone 1 sind. Obwohl postmitotischen Motoneuronen auf ihre endgültige Position bewegen und organisieren sich in Spalten entlang der tractus 2,3. Mehr als 90% aller dieser differenzierten und positioniert Motoneuronen drücken die Transkriptionsfaktoren Islet 1 / 2. Sie innervieren die Muskeln der Extremitäten sowie die des Körpers und die inneren Organe. Unter anderem Motoneuronen in der Regel drücken die Rezeptoren mit hoher Affinität für Gehirn neurotrophen Faktor (BDNF) und Neurotrophin-3 (NT-3), der Tropomyosin-verwandte Kinase B und C (TrkB, TrkC). Sie drücken nicht die Tropomyosin-verwandte Kinase A (TrkA) 4. Neben den beiden Rezeptoren mit hoher Affinität, tun Motoneuronen Ausdruck der geringen Affinität Neurotrophin-Rezeptor p75 NTR. Die p75 NTR können alle Neurotrophine mit ähnlichen, aber niedriger Affinität binden alle Neurotrophine als die Rezeptoren mit hoher Affinität würde die reifen Neurotrophine binden. Innerhalb der embryonalen Rückenmark, ist die p75 NTR ausschließlich durch die spinale Motoneuronen 5 ausgedrückt. Dies wurde genutzt, um Motoneuron Isolierung Techniken zu entwickeln, um die Zellen von der überwiegenden Mehrheit der umliegenden Zellen 6 zu reinigen. Isolating Motoneuronen mit Hilfe von spezifischen Antikörpern (Panning) gegen die extrazellulären Domänen von p75 NTR hat sich ein teures Verfahren, wie die Menge des Antikörpers für ein einzelnes Experiment verwendeten hoch ist aufgrund der Größe der Platte für das Panning verwendet werden eingeschaltet. Eine viel günstigere Alternative ist die Verwendung von Lektin. Lectin hat sich gezeigt, dass sie spezifisch an p75 NTR sowie 7 zu binden. Die folgende Methode beschreibt eine alternative Technik mit Weizenkeimagglutinin für eine preplating Verfahren anstelle der p75 NTR-Antikörper. Das Lektin ist eine äußerst kostengünstige Alternative zu den p75 NTR-Antikörper und die Reinigung Sorten mit Lektin sind vergleichbar mit der des p75 NTR-Antikörper. Motoneurone aus dem embryonalen Rückenmark mit dieser Methode isoliert werden können, zu überleben und wachsen aus Neuriten.
Protocol
Für spezielle Reagenzien: siehe Tab.. 1. Alle anderen Reagenzien aufgeführt sind in der Zellkultur-Grade-Qualität von der Firma Sigma Aldrich erhalten.
1. PORN-H/laminin Beschichtung von Geschirr / Deckgläser
- Bereiten Sie arbeiten Lösung von 0,5 mg / ml Poly-DL-Ornithin Hydrobromid (PORN-H) in 150 mM Boratpuffer pH 8,35.
- Eine Stammlösung von 50 mg PORN / 1 ml Boratpuffer kann im Voraus zubereitet werden und bei -20 ° C.
- Sterilisieren Deckgläschen durch Abflammen in 100% Ethanol und lassen Sie sie an der Luft trocknen.
- Bedecken Sie die Oberfläche mit ausreichender PORN-H-Lösung über Nacht bei 4 ° C.
- Am nächsten Tag dreimal mit sterilem Wasser und Luft trocknen Deckgläser.
- Bereiten Sie arbeiten Lösung von 2,5 g / ml Laminin in HBSS
- Aliquots bei -20 ° C gelagert werden Tauwetter bei 4 ° C unmittelbar vor dem Gebrauch.
- Bedecken Sie die Oberfläche des PORN-H-beschichtete Deckgläser mit dem Laminin-Lösung und lassen Sie sie für mindestens 2 h bei Raumtemperatur inkubieren bis zur Verwendung.
2. Lectin Beschichtung der Reinigung Platte
- Bereiten Sie eine Lösung aus 10 mM Tris in sterilem Wasser, pH 9,5.
- Add-Lektin (lösen das Lektin (Sigma L9640)-Pulver in HBSS) auf eine Endkonzentration von 10 ug / ml.
- Bestreichen Sie die Oberfläche eines 10 cm Zellkulturschale mit 8 ml der Lektin-Lösung und lassen Sie es für mindestens 30 min bei Raumtemperatur inkubieren.
- Waschen Sie die Platte dreimal mit HBSS und speichern in HBSS bis zur Verwendung.
- Bereiten Sie eine 30 mm KCl, 0,8% (w / v) NaCl-Lösung Depolarisation. Sterilisieren durch Filtration und bei Raumtemperatur lagern (RT).
3. Motoneuron Kulturmedium
- Thaw Pferdeserum über Nacht bei 4 ° C und bei 55 ° C inaktivieren für 30 min, Aliquot in 5 ml und bei -20 ° C. Thaw Aliquot direkt vor bei RT verwenden.
- Shop B27-Ergänzung in 1 ml aliqouts bei -20 ° C. Thaw B27 Ergänzung bei RT unmittelbar vor dem Gebrauch. Vermeiden Sie frieren und Auftauen.
- Aliquot Glutamax in 0,5 ml Aliquots und bei -20 ° C und verwenden Sie es bei 1:100.
- Bereiten Sie eine Stammlösung von 10 pg / ml CNTF in sterilem Wasser mit 0,1% BSA. Lagerung bei -20 ° C.
- Mix 46 ml Neurobasalmedium mit 2,5 ml Pferdeserum, 1 ml B27-Ergänzung und 0,5 ml Glutamax direkt vor dem Gebrauch.
- Add CNTF zu einer Endkonzentration von 10 ng / ml Medium und pre-warmen mittel-bis 37 ° C.
4. Rückenmark Dissektion
- Opfere ein E12.5 schwangere Maus und entfernen Sie die Embryonen vorsichtig. Fügen Sie genug RT HBSS zur kompletten Abdeckung des Embryos.
- Entfernen Sie den Kopf und Schwanz und Ort des Embryos zurück nach oben mit gespreizten Gliedmaßen.
- Fix der Embryo mit einer Pinzette und entfernen Sie die äußere Haut mit den anderen Pinzette.
- Entfernen des Rückenmarks durch Einstechen in die Zange unter ihm und heben Sie sie mit Säge-Bewegungen auf beiden Seiten des Rückenmarks.
- Übertragen Sie die isolierten Rückenmark ein neues Gericht mit HBSS und öffnen Sie den zentralen Kanal des Rückenmarks auf der Rückenseite.
- Entfernen Sie die Spinalganglien durch das Entfernen der umgebenden Hirnhäuten des Rückenmarks.
- Sammeln Sie die Lendenwirbelsäule Teile des Rückenmarks von bis zu 6 Embryonen pro Lektin Platte in ein Eppendorf-Reaktionsgefäß mit 1 ml HBSS und speichern auf Eis gefüllt, bis die Zubereitung erfolgt.
5. Anreicherung von Motoneuronen durch Lektin-basierte Reinigung
Hinweis: Bevor Sie die nächsten Schritte vorbereiten spätestens hier und vorwärmen das Medium (siehe Schritt 3).
- Bereiten Sie eine Trypsin-Lösung durch das Lösen von 1 g Trypsin in 100 ml HBSS, Lagerung bei -20 ° C und Auftauen bei 4 ° C.
- Mix 1g Trypsin-Inhibitor mit 98 ml HBSS und 2 ml 1 M HEPES pH 7,4, sollte 1 ml Aliquots bei 4 ° C gelagert werden
- Übertragen Sie die Röhre mit dem Rückenmark zu einer Zellkultur Motorhaube und entfernen Sie vorsichtig 700 ul der HBSS.
- Add 7,5 ul Trypsin-Lösung und mischen durch vorsichtiges Umdrehen des Röhrchens.
- Führen Trypsinierung für 8 min bei 37 ° C.
- Stoppen der Reaktion durch Zugabe von 30 ul Trypsin-Inhibitor und Pipette nach oben und unten (verreiben) vorsichtig 10-15 Mal mit einem 1000 ul Pipettenspitze bis keine Zellaggregate sichtbar sind. Wiederholen Sie die Verreibung mit einem 20-200 ul Pipette und den entsprechenden Tipp.
- Pipette die Zelle Lösung in die HBSS gefüllt Lektin Teller und verteilen die Zellen durch vorsichtiges Drehen der Platte.
- Halten Sie das Lektin Platte für 60 min bei RT auf einem vibrationsfreien Oberfläche. Decken Sie sie, um Kontaminationen zu vermeiden.
- Entfernen Sie die HBSS sehr sanft und waschen Sie die Platte vorsichtig 4 mal mit vorgewärmten HBSS um Zellfragmente und die nicht angeschlossen / ungebunden Zellen zu entfernen.
- Unmittelbar nach dem letzten Waschschritt, 500 ul Depolarisation Lösung auf den Teller und lassen Sie es für 1min inkubieren.
- Erleichterung der Ablösung der Lektin gebundenen Zellen durch Schütteln undAntippen der Platte.
- Füllen Sie die Platte mit 2 ml vorgewärmten Kulturmedium und Transfer in ein 15 ml Falcon-Röhrchen.
- Graf Zellzahl mit einer Neubauer-Zählkammer.
- Platte der Zelle auf der Laminin beschichtete Deckgläser oder Platten in eine entsprechende Anzahl abhängig von der Anwendung.
- Führen Sie ein Medium Austausch am Tag 1 und danach jeden zweiten Tag durch eine sorgfältige Ersatz von 50% des alten Mediums. Verwenden Sie stets vorgewärmte, frisch zubereitete neue Kulturmedium.
6. Repräsentative Ergebnisse:
Embryonale Motoneurone aus Maus-Embryonen bei E12 bis E14 erhältlich. 2-3% der gesamten Zellpopulation der Lenden-Wirbelsäule besteht aus Motoneuronen und die Spinalganglien ganglionären Neuronen p75 sind NTR-positive als auch, ist es wichtig, um loszuwerden, diese Zellen vor dem Start des Lektin-basierte preplating Verfahren ( Zur Übersicht siehe Abbildung 1 und Abbildung 2). Zweitens sind die Hirnhäute stark teilenden Zellen, die ebenfalls ausgeschlossen werden sollte, da sie sich nicht richtig von der Lektin-basierte preplating Verfahren (Abbildung 2 und Abbildung 3) entfernt werden. In schlimmeren Fällen können diese Zellen überwuchern die Kultur-Platten. Die repräsentative Bilder in Abbildung 3B und 3D auch einen Eindruck über die geringere Zelldichte nach dem Waschen Verfahren durchgeführt worden sind (siehe Schritt 5.9 des Protokolls). Kulturen von embryonalen Maus-Motoneuronen sind in der Regel für bis zu fünf oder sieben Tage aufrechterhalten. Während dieser Zeit die Zellen zu etablieren ihre Neuriten bis zu einer maximalen Länge (Abbildung 4). Neuritenlängen stark abhängig von dem Substrat, auf die Platten 8. Das typische Substrat Laminin, die auf PORN-H abgedeckt Kulturschalen beschichtet ist. Motoneuronen können auch wachsen auf anderen oder weniger definierten Substraten, wie extrazelluläre Matrix durch Wasser Lyse 8 erzeugt. In Fällen von suboptimal Beschichtung, Neuritenlänge und Wachstum Membranfläche verringert und Zelltod in der Regel erhöht. Trophische Unterstützung spielt eine entscheidende Rolle für das Überleben von embryonalen Maus-Motoneurone in Kultur. Survival of zunächst vernickelt Zellen am siebten Tag fallen auf 10% bis 20% ohne trophische Träger 6. Gehirn abgeleiteten neurotrophen Faktor (BDNF) und Ciliary neurotrophen Faktors (CNTF) sind die am häufigsten verwendeten Faktoren, aber andere können das Überleben als auch [Leukämie inhibierenden Faktor (LIF), Cardiotrophin-1 (CT-1), basischen Fibroblasten-Wachstumsfaktor (bFGF fördern ), Insulin-like growth factor 1 (IGF-1) 9].
Abbildung 1. Fließschema für die Herstellung von embryonalen Maus-Motoneuronen. Die schematische Zeichnung zeigt die verschiedenen Schritte zur Isolierung und Kultivierung von embryonalen Maus-Motoneuronen. Abkürzungen: SC: Rückenmark; HBSS: Hanks balanced salt solution, MN: Motoneuron.
Abbildung 2: Isolierung der Lendenwirbelsäule Teil des Rückenmarks von E12.5 Maus A:.. E12.5 Maus-Embryo. Für den nächsten Schritt werden die Kopf und Schwanz entfernt und der Körper wird in eine dorsale-up-Position B gestellt: Embryo in eine dorsale-up-Position. Zange an der linken und rechten Seite des Rückenmarks sind Festsetzung des Embryos Körper in seiner Position. Einer der Pinzette wird anschließend verwendet, um die Haut zu schneiden und unter dem Rückenmark der anderen verwendet werden, um den Embryo in seiner Position zu fixieren geschnitten wird C:. Isolated Rückenmark von E12.5 Maus-Embryo. Die Teile des Rückenmarks (Hals-, Brust-, Lenden-) angegeben. Das Rückenmark wird durch den Hirnhäuten umgeben und ein Teil der Spinalganglien noch mit ihnen verbundenen D:. Das Rückenmark ist in Längsrichtung auf der Rückenseite geschnitten, um es in Richtung des zentralen Kanals geöffnet E:. Die Meningen an der Bauchseite sind jetzt aus dem abgeflachten Rückenmark entnommen. Hinweis: Während abgenommen, die Lendenwirbelsäule wird durch einen kleinen Schnitt markiert F:. Nur der Lendenwirbelsäule Teil des Rückenmarks wird dann für das weitere Vorgehen getroffen.
Abbildung 3: Bestimmung und Isolierung von Islet-positive Zellen aus der Lenden-Wirbelsäule von E12.5 Mausembryonen A:.. Die Islet-2.1-Antikörper Etiketten Motoneuron Spalten innerhalb der embryonalen Lumbalmark (rot, Pfeil) und Hoechst Etiketten alle Kerne innerhalb der Sektion. Querschnitt eines E12.5 Lumar Rückenmark. E12.5 Maus Embryonen wurden in 4% Paraformaldehyd für 6 h Immersion-fixiert, gewaschen 3-mal mit Phosphat-gepufferter Kochsalzlösung und mit Saccharose nach Standardverfahren. Kryoschnitte von 20 &mgr; m wurden mit einem Kryostaten genommen und die Schnitte wurden immunhistochemische Färbung nach Standardverfahren 11 behandelt. Die Abschnitte ware anschließend mit Hoechst zur Lokalisation der Zellkerne gekennzeichnet. Beachten Sie, dassder Spinalganglien ganglionären Neuronen Islet-1/2-positive so gut und dass die Vorbereitung Verfahren schließt diese Gewebeteile aus der Isolation Verfahren B:. Islet-2.1 gekennzeichnet (rot, Pfeil) dissoziiert Lumbalmark Zellen von E12. 5 Embryonen, links - vor und rechts - nach Lektin-basierte preplating. Die Zellen wurden mit Hoechst gegengefärbt, um alle Zellkerne sichtbar zu C:. Quantifizierung der Islet-1/2-positive Zellen vor und nach Lektin-basierte preplating D:. Nkx6.1 gekennzeichnet Motoneuronen von E12.5 Embryonen nach einem Tag in Kultur. Die Zellen wurden mit Hoechst gegengefärbt, um alle Kerne cisualieze. Beachten Sie, dass 90% aller Zellen Nkx6.1 positiv sind. Abkürzungen: SC: Rückenmark, MN: Motoneuron; DRG: Spinalganglien.
Abbildung 4 Charakterisierung von E12.5 Maus Motoneuronen A und B:.. Angereichert isoliert E12.5 Maus Lendenwirbelsäule Motoneuronen ausdrückliche p75 NTR auf 0 Tage in vitro (0div) und am Tag 2 in vitro (2div). Die Zellen wurden mit 4% Paraformaldehyd fixiert und anschließend für p75 NTR nach üblichen Verfahren gefärbt. Die Zellen wurden gegengefärbt mit Hoechst zu allen Kernen visualisieren C:. Enriched Motoneuronen nach 5 Tagen in vitro (5cm) auf PORN-H und Laminin als Kultur Substraten und in Gegenwart von CNTF gefärbt β-III-Tubulin. Beachten Sie, dass die Zellen haben lange Neuriten gewachsen und zeigt die typische Morphologie Motoneuron mit einer längeren (verzweigte)-Prozess und einem oder mehreren kürzeren Prozessen (Axone und Dendriten). Abkürzungen: MN: Motoneuron; div: Tage in vitro.
| Nach Dissoziation ohne Lektin-basierte preplating | |||
| Anzahl der Zellen / SC | Trypanblau-positiven Zellen [%] | Islet-1/2- positiven Zellen [%] | |
| 1 | 995,0 | 13,1 | 9,5 |
| 2 | 889,4 | 8,0 | 10,0 |
| 3 | 1.180.0 | 11,0 | 10,8 |
| Mittelwert ± SD | 1.021.0 ± 147,1 | 10,7 ± 2,6 | 10,1 ± 0,7 |
| Mit Lektin-basierte preplating | |||
| Anzahl der Zellen nach preplating / SC | Trypanblau-positiven Zellen [%] | Islet-1/2- positiven Zellen [%] | |
| 1 | 189,6 | 9,9 | 70,5 |
| 2 | 168,8 | 3,7 | 76,1 |
| 3 | 125,0 | 0,0 | 72,5 |
| Mittelwert ± SD | 161,1 ± 33,0 | 4,5 ± 5,0 | 73,0 ± 2,8 |
Tabelle 1. Zusammenfassung von repräsentativen Verfahren zur Isolierung von Maus embryonalen Motoneuronen von Stufe E12.5. Die Ergebnisse aus 3 verschiedenen Verfahren zur Isolierung von speziell für diesen Zweck als Gesamtzahl oder Prozentzahlen ± SD angegeben. Abkürzung: SC: Rückenmark, SD: Standardabweichung.
| Islet-2.1-positiven Zellen mit p75 Panning [%] | Islet-2.1-positiven Zellen mit Lectin-based Panning [%] |
| 92,0 ± 3,5 1 | 73,0 ± 2,8 |
Tabelle 2. Vergleich von Lektin-basierte und p75-basierte 1 Panning Motoneuron Zellzahlen. Die Ergebnisse werden als Prozentsatz Zahlen ± SD angegeben.
Discussion
Der Vorteil dieses Lektin-basierte preplating Technik ist, dass es weniger teuer als die p75 NTR-based Panning Prozedur ist, und das Lektin ist stabiler als Antikörper. Die Anreicherung in Abb. aufgeführt. 2 und Tab. 1 zeigt, dass das Verfahren erlaubt es, die Reinigung von ähnlichen Zahlen aus Zellen und dass ein Großteil dieser Zellen exprimieren das Motoneuron Marker Islet-02.01. Der wichtigste Schritt ist die Isolierung Verfahren für die Lenden-Wirbelsäule. Das Entfernen der Hirnhäute und der DRGs (Abb. 2) wird für die folgenden Reinigungsverfahren von Lektin-basierte preplating unerlässlich. Wenn dies richtig verwaltet worden, Express nahezu allen Zellen des p75 NTR (für repräsentatives Bild siehe Abb.. 3a). Der Grund für den Unterschied zwischen Ausdruck Islet-2.1-und p75 NTR ist wahrscheinlich, weil lumbalen Motoneuronen differentiell höheren und niedrigeren Ebenen des Islet-1 / 2 10 zum Ausdruck bringen. Im Falle einer niedrigen Islet-2.1 Expression könnte dies unsere Aufmerksamkeit in der immuncytochemical Färbung und anschließende Zählung entgangen sein, wie wir strengen Bezug auf positive gegen negative Zellen (Tab. 1) waren. Zusätzlich Tabelle 1 zeigt deutlich, dass die isolierten Zellen die Prozedur überleben in einem gesunden Zustand, denn es gibt nur wenige Trypan-Blau-positive Zellen, dass die Zellen irreversibel geschädigt anzuzeigen. Diese alternativen Verfahren ermöglicht auch Isolierung von Motoneuronen aus einzelnen Embryonen und daher mit gemischten Genotyp Würfe aus embryonalen Mäuse. Im Ergebnis hat diese Alternative zu den Panning Prozedur mit dem p75 NTR Antikörper 6 ähnliche, wenn nicht identisch Kapazitäten im Hinblick auf mögliche Anwendungsbereiche und bietet eine preiswerte und effiziente Alternative Reinigungsverfahren für embryonalen Motoneuronen.
Disclosures
Keine Interessenskonflikte erklärt.
Acknowledgments
Wir danken Sandra Bargen für einen ausgezeichneten technischen Support. Diese Arbeit wurde durch das Protein Research Department (PRD, TP A1.2 (RC und TS) und der RUB Research Fond, Rektoratsprogramme unterstützt -. Wissenschaftlicher Nachwuchs (AK) Der monoklonale Antikörper 39.4D5 und F55A10 aus dem Developmental Studies Hybridoma wurden erhalten Bank (DSHB, Iowa City, IA).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Poly-DL-ornithine hydrobromide | Sigma-Aldrich | P8638 | |
| Laminin | Invitrogen | 23017-015 | |
| HBSS | GIBCO, by Life Technologies | 14170 | |
| Glass coverslips | Thermo Fisher Scientific, Inc. | 10 or 14mm | |
| Lectin | Sigma-Aldrich | L5142 | |
| Cell culture dish | Nalge Nunc international | 150350 | Nunclon delta surface |
| Horse serum | Linaris | SHD3250ZK | Each batch has to be tested for MN culture |
| B27 Supplement | GIBCO, by Life Technologies | 17504-044 | |
| Glutamax | GIBCO, by Life Technologies | 35050-038 | |
| CNTF | Sigma-Aldrich | N0513 | |
| BSA | Applichem | A1391 | |
| Neurobasal | GIBCO, by Life Technologies | 21103-041 | |
| Forceps | Stainless steel, size 4 or 5 | ||
| Trypsin | Worthington Biochemical | LS003707 | |
| Trypsin-Inhibitor | Sigma-Aldrich | T6522 | |
| Anti-Islet-1 | DSHB | 39.4D5 | Cell culture supernatant |
| Anti-Nkx6.1 | DSHB | F55A10 | Cell culture supernatant |
| Anti-p75NTR | Abcam | Ab8874 | |
| Table 3. Table of specific reagents and equipment. | |||
References
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