Summary
Uma forma alternativa de isolar motoneurônios embrionárias de camundongos a partir da medula espinhal é descrito. O método leva em consideração o fato de que a lectina pode ligar para a afinidade baixo do nervo receptor do fator de crescimento p75NTR. Este preplating lectina baseado permite uma purificação semelhante ao que, com um anticorpo específico contra o p75NTR.
Abstract
Motoneurônios espinhais evoluir para estágios pós-mitóticos, através do desenvolvimento do sistema nervoso embrionário e, posteriormente, crescer para fora dendritos e axônios. Células neuroepiteliais do tubo neural que expressam Nkx6.1 são as células precursoras única para motoneurônios espinhais 1. Embora motoneurônios pós-mitóticos avançar para a sua posição final e se organizam em colunas ao longo do trato espinhal 2,3. Mais de 90% de todos estes motoneurônios diferenciado e posicionado expressar os fatores de transcrição Islet 02/01. Eles inervam os músculos dos membros, bem como aqueles do corpo e os órgãos internos. Entre outros, os motoneurônios normalmente expressa os receptores de alta afinidade para o fator neurotrófico derivado do cérebro (BDNF) e neurotrofina-3 (NT-3), a tropomiosina relacionados quinase B e C (TrkB, TrkC). Eles não expressam a quinase tropomiosina relacionadas A 4 (TRKA). Ao lado dos dois receptores de alta afinidade, motoneurônios expressam a baixa afinidade do receptor neurotrofina p75 NTR. A NTR p75 pode ligar todas as neurotrofinas com afinidade semelhante, mas inferior a todos os neurotrofinas que a receptores de alta afinidade seria vincular a neurotrofinas maduro. Dentro da medula espinhal de embriões, a NTR p75 é exclusivamente expressa pelo motoneurônios espinhais 5. Isso tem sido usado para desenvolver técnicas de isolamento motoneurônio para purificar as células da grande maioria das células vizinhas 6. Motoneurônios isolar com a ajuda de anticorpos específicos (panning) contra os domínios extracelulares de p75 NTR acabou por ser um método caro, como a quantidade de anticorpo utilizado para uma única experiência é alto devido ao tamanho da placa utilizada para panning. Uma alternativa muito mais econômica é o uso de lectina. Lectina tem sido demonstrado que especificamente se ligam a p75 NTR também 7. O método a seguir descreve uma técnica alternativa utilizando aglutinina de gérmen de trigo para um procedimento preplating em vez de o anticorpo p75 NTR. A lectina é uma alternativa extremamente barata para o anticorpo p75 NTR e os graus de purificação usando lectina são comparáveis aos do anticorpo p75 NTR. Motoneurônios da medula espinhal de embriões pode ser isolada por este método, sobreviver e crescer fora neurites.
Protocol
Para reagentes especiais: ver Tab. 1. Todos os outros reagentes estão listadas na célula de qualidade grau de cultura obtidos da Sigma Aldrich.
1. PORN-H/laminin revestimento de pratos / lamínulas
- Prepare solução de trabalho de 0,5 mg / ml Poly-DL-ornitina hydrobromide (PORNÔ-H) em 150 mM pH tampão borato 8,35.
- Uma solução estoque de 50 mg tampão borato PORNÔ / 1 ml pode ser preparado com antecedência e armazenado a -20 ° C.
- Esterilizar lamínulas de vidro por chamas em etanol 100% e deixe-os secar ao ar.
- Cubra a superfície com solução de H PORNÔ-suficiente durante a noite a 4 ° C.
- No dia seguinte lavar três vezes com água esterilizada e secar lamínulas.
- Prepare solução de trabalho de 2,5 mg / ml em HBSS laminina
- Alíquotas podem ser armazenadas a -20 ° C. Descongele a 4 ° C imediatamente antes da utilização.
- Cubra a superfície das lamínulas PORNÔ-H-revestido com a solução de laminina e deixá-los incubar por pelo menos 2 h em temperatura ambiente até o uso.
2. Lectina revestimento da placa de purificação
- Prepare uma solução de 10 mM Tris em água esterilizada, pH 9.5.
- Adicionar lectina (resolver a lectina (Sigma L9640) pó em HBSS) para uma concentração final de 10 mcg / ml.
- Revestimento de superfície de uma placa de cultura 10 centímetros celular com 8 ml da solução de lectina e deixe incubar por pelo menos 30 min em temperatura ambiente.
- Lave a placa três vezes com HBSS e armazenar em HBSS até o uso.
- Prepare um KCl 30mm, 0,8% (w / v) NaCl despolarização solução. Esterilizar por filtração e armazenamento em temperatura ambiente (RT).
3. Motoneurônio meio de cultura
- Cavalo descongelar soro durante a noite a 4 ° C e inativar a 55 ° C por 30 min, em alíquotas de 5 ml e armazenar a -20 ° C. Alíquota de descongelar antes de usar diretamente no RT.
- Loja B27 suplemento em uma aliqouts ml a -20 ° C. Descongelar no suplemento B27 RT imediatamente antes da utilização. Evitar ciclos de congelamento e descongelamento.
- Glutamax alíquota em 0,5 ml alíquotas e armazenar a -20 ° C e usá-lo em 1:100.
- Prepare uma solução estoque de 10 mg / ml CNTF em água esterilizada com BSA 0,1%. Armazenar a -20 ° C.
- Misture 46 ml de meio de neurobasal com 2,5 ml soro de cavalo, 1 ml suplemento B27 e 0,5 ml Glutamax directamente antes de usar.
- Adicionar CNTF a uma concentração final de 10 de médio ng / ml e pré-aquecido médio e 37 ° C.
4. Dissecção da medula espinhal
- Sacrifício de um rato E12.5 grávidas e remoção dos embriões com cuidado. Adicione o suficiente RT HBSS para cobrir completamente os embriões.
- Retire a cabeça ea cauda e colocar a parte de trás do embrião com membros montou.
- Corrigir o embrião com uma pinça e retire a pele exterior com a pinça outros.
- Remover a medula espinhal, perfurando o fórceps sob ele e levante-o com serra-como movimentos de ambos os lados da medula espinhal.
- Transferir a cabo isolado espinhal para um novo prato com HBSS e abrir o canal central da medula espinhal no lado dorsal.
- Remover os gânglios da raiz dorsal, removendo as meninges anexando da medula espinhal.
- Recolher as peças lombar da medula espinhal de até 6 embriões por placa lectina em um tubo de reação eppendorf cheia com 1 ml HBSS e armazenar no gelo até que a preparação está feito.
5. Enriquecimento de motoneurônios por lectina de purificação baseado em
Nota: Antes de iniciar os próximos passos, o mais recente aqui preparar e Pré-aquecer o meio (veja a etapa 3.)
- Prepare uma solução de tripsina através da resolução de 1 g Tripsina em 100 ml HBSS, armazenar a -20 ° C e descongelamento a 4 ° C.
- Mix 1g tripsina-inibidor com 98 HBSS ml e 2 ml de 1 M HEPES pH 7,4, 1 ml alíquotas devem ser armazenadas a 4 ° C.
- Transferir o tubo com a medula espinhal a uma capa de cultura celular e remova cuidadosamente 700 mL de HBSS.
- Adicionar 7,5 mL de solução de tripsina e misture com cuidado invertendo o tubo.
- Executar trypsination por 8 min a 37 ° C.
- Pare a reação adicionando 30 mL inibidor de tripsina e pipetar cima e para baixo (triturar) cuidadosamente 10-15 vezes com uma ponta de pipeta 1000 mL até agregados celulares não mais são visíveis. Repita a trituração com uma pipeta 20-200 mL ea ponta correspondente.
- Pipetar a solução de células na placa HBSS cheio de lectina e dispersar as células suavemente girando o prato.
- Mantenha o prato lectina por 60 min à temperatura ambiente em uma superfície livre de vibrações. Cubra-o para evitar a contaminação.
- Remover o HBSS muito suavemente e lavar a placa com cuidado 4 vezes com HBSS pré-aquecido para remover fragmentos de células e as células não ligado / unattached.
- Imediatamente após a etapa de lavagem passado, adicionar 500 mL de solução despolarização ao prato e deixe incubar por 1min.
- Facilitar o desprendimento das células lectina ligada por agitação etocar no prato.
- Encha o prato com 2 ml meio de cultura pré-aquecido e transferir para um tubo falcon 15 ml.
- Contar o número de células com uma câmara de contagem Neubauer.
- Placa a célula na lamínulas laminina revestidos ou placas em um número apropriado, dependendo da aplicação.
- Realizar uma troca de médio no dia 1 e, posteriormente, a cada segundo dia por substituição cuidadosa de 50% do meio de idade. Use sempre pré-aquecido, meio de cultura preparada nova.
6. Resultados representativos:
Motoneurônios embrionárias podem ser obtidas a partir de embriões de camundongos em E12 e E14. 2-3% da população total de células da medula lombar da coluna vertebral consiste de motoneurônios e como os neurônios da raiz dorsal ganglionar são p75 NTR-positivos, assim, é importante para se livrar dessas células antes de iniciar o procedimento preplating lectina-based ( Para visão geral veja a Figura 1 e Figura 2). Em segundo lugar, as meninges incluem células fortemente divisão que devem ser excluídos também, pois eles não podem ser adequadamente removida pelo procedimento preplating lectina-based (Figura 2 e Figura 3). Nos piores casos, essas células podem crescer demais a placas de cultura. As imagens representativas na Figura 3B e 3D também dar uma impressão sobre a menor densidade de células após a lavagem os procedimentos foram realizados (veja o passo 5.9 do protocolo). Culturas de motoneurônios embrionárias de camundongos são geralmente mantidos por até cinco ou sete dias. Durante este período as células estabelecer sua neurites até um comprimento máximo (Figura 4). Comprimentos neuritos dependem fortemente do substrato sobre a 8 pratos. O substrato típico é laminina que é revestido em pornô-H placas de cultura cobertas. Motoneurônios também pode crescer em outros substratos ou menos definida, como matrizes extracelulares gerados por lise da água 8. Em casos de suboptimal revestimento, comprimento e área de neurite cone de crescimento são reduzidos e morte celular geralmente aumenta. Suporte trófico desempenha um papel crucial para a sobrevivência de motoneurônios embrionárias de camundongos em cultura. Sobrevivência das células inicialmente semeadas em queda de sete dias a 10% a 20% sem o apoio tróficos 6. Fator neurotrófico derivado do cérebro (BDNF) eo fator neurotrófico ciliar (CNTF) são os fatores mais comumente usado, mas outros podem promover a sobrevivência, bem [fator inibidor da leucemia (LIF), cardiotrofina-1 (CT-1), fator de crescimento básico de fibroblastos (bFGF ), Insulin-like growth factor 1 (IGF-1) 9].
Figura esquema de Fluxo 1. Para a preparação de motoneurônios embrionárias de camundongos. O desenho esquemático ilustra as diferentes etapas de isolamento e cultura de motoneurônios embrionárias de camundongos. Abreviaturas: SC: medula espinhal; HBSS: Hanks solução salina balanceada; MN: motoneurônio.
Figura 2 isolamento da parte lombar da medula espinhal de rato E12.5 A:.. E12.5 embrião de rato. Para a próxima etapa, a cabeça ea cauda são removidos eo corpo é colocado em uma posição dorsal B-up: Embryo em posição dorsal-up. Fórceps à esquerda e à direita da medula espinhal são fixação do corpo do embrião na sua posição. Um dos fórceps é posteriormente usada para cortar a pele e cortar debaixo da medula espinhal a outra é usada para corrigir o embrião em sua posição C:. Medula espinhal Isolado E12.5 embrião de rato. As partes da medula espinhal (cervical, torácica, lombar) são indicados. A medula espinhal está rodeada pelas meninges e parte dos gânglios da raiz dorsal ainda anexar a eles D:. A medula espinhal é cortados longitudinalmente no lado dorsal para abri-lo para o canal central E:. As meninges no lado ventral são agora retirado da medula espinhal achatada. Nota: Apesar de retirado, a parte lombar é marcado por um pequeno corte. F: Apenas a parte lombar da medula espinhal é então levado para procedimentos posteriores.
Figura 3 Determinação e isolamento de ilhotas de células positivas da medula espinhal lombar de embriões de camundongos E12.5 A:.. As etiquetas Islet-1 anticorpo / 2 colunas motoneurônio na medula espinhal lombar embrionárias (vermelho, seta) e etiquetas de todos os Hoechst núcleos dentro da seção. Seção transversal de um cabo de Lumar E12.5 espinhal. E12.5 embriões de camundongos foram imersão-fixadas em paraformaldeído a 4% para 6 h, lavados 3 vezes com tampão fosfato e tratadas com sacarose acordo com os procedimentos padrão. Criosecções de 20 mM foram tomadas com um criostato e os cortes foram tratados para a coloração immunhistochemical de acordo com procedimentos padronizados 11. O software seções posteriormente rotulados com Hoechst para a localização do núcleo das células. Note-se queos neurônios da raiz dorsal ganglionar são Islet-1/2-positive bem e que o procedimento de preparação exclui essa peças de tecido do procedimento de isolamento B:. Islet-1 / 2 rotulados (vermelho, seta) dissociado lombar células da medula espinhal a partir de E12. 5 embriões, à esquerda - antes e direita - depois de lectina baseado preplating. As células foram contracorados com Hoechst para visualizar todos os núcleos das células C:. Quantificação de células Islet-1/2-positive antes e depois da lectina baseado preplating D:. Nkx6.1 motoneurônios marcados a partir E12.5 embriões depois de um dia em cultura. As células foram contracorados com a Hoechst cisualieze todos os núcleos. Note-se que 90% de todas as células são Nkx6.1 positivo. Abreviaturas: SC: medula espinhal; MN: motoneurônio; DRG: gânglio da raiz dorsal.
Figura 4 Caracterização da E12.5 motoneurônios do mouse A e B:.. Enriquecido isolado E12.5 rato lombar motoneurônios espinhais expressam p75 NTR em 0 dias in vitro (0div) e no dia 2 in vitro (2div). As células foram fixadas com paraformaldeído 4% e, posteriormente, coradas para p75 NTR acordo com os procedimentos padrão. As células foram contra usando Hoechst para visualizar todos os núcleos C:. Motoneurônios Enriquecido após 5 dias in vitro (5div) em pornô-H e laminina como substratos cultura e na presença de CNTF manchada para β-tubulina III. Note-se que as células têm crescido fora neurites tempo e exibir a morfologia típica, com um motoneurônio mais (ramificada) processo e um ou mais processos mais curtos (axônios e dendritos). Abreviaturas: MN: motoneurônio; div: dias in vitro.
| Após a dissociação sem Lectin baseado preplating | |||
| Número total de células / SC | Azul de tripano células positivas [%] | Células Islet-1/2- positivo [%] | |
| 1 | 995,0 | 13,1 | 9,5 |
| 2 | 889,4 | 8,0 | 10,0 |
| 3 | 1.180.0 | 11,0 | 10,8 |
| Média ± SD | 1.021.0 147,1 ± | 10,7 ± 2,6 | 10,1 ± 0,7 |
| Com lectina baseado preplating | |||
| Número de células após preplating / SC | Azul de tripano células positivas [%] | Células Islet-1/2- positivo [%] | |
| 1 | 189,6 | 9,9 | 70,5 |
| 2 | 168,8 | 3,7 | 76,1 |
| 3 | 125,0 | 0,0 | 72,5 |
| Média ± SD | 161,1 ± 33,0 | 4,5 ± 5,0 | 73,0 ± 2,8 |
Tabela 1. Resultados resumo dos procedimentos de isolamento representante para motoneurônios embrionárias de camundongos a partir da fase E12.5. Partir de três diferentes procedimentos de isolamento especialmente para esse fim são dados como números totais ou números percentuais ± SD. Sigla: SC: medula espinhal; SD: desvio padrão.
| Islet-1 / 2 células positivas com p75 panning [%] | Islet-1 / 2 células positivas com Lectina baseado panning [%] |
| 92,0 ± 3,5 1 | 73,0 ± 2,8 |
Tabela 2. Resultados comparação de lectina-based e p75 com base em um número de células panning motoneurônio. São dadas como números percentuais ± SD.
Discussion
A vantagem desta técnica preplating lectina-base é que é menos caro do que o p75 procedimento NTR baseado panning, e a lectina é mais estável do que os anticorpos. O enriquecimento listados na figura. 2 e Tab. 1 mostra que o procedimento permite a purificação de um número semelhante de células e que a maioria destas células expressam o marcador motoneurônio Islet-1 / 2. O passo mais crítico é o procedimento de isolamento para a medula espinhal lombar. Removendo as meninges e os DRGs (Fig. 2) é essencial para o processo de purificação seguir pela lectina baseado preplating. Se esta tem sido gerido correctamente, quase todas as células expressam o NTR p75 (por imagem representativa ver fig. 3a). A razão para a diferença entre a expressão de Islet-1 / 2 e p75 NTR é provavelmente porque motoneurônios lombar diferencialmente expressa níveis mais altos e mais baixos de Islet-1 / 2 10. Em caso de baixos níveis de expressão Islet-1 / 2 isso pode ter escapado a nossa atenção na coloração immuncytochemical e posterior contagem como fomos rigorosos no que diz respeito às células positivos versus negativos (Tab. 1). Além disso, a Tabela 1 mostra claramente que as células isoladas sobreviver ao procedimento em uma condição saudável, como existem poucos tripan azul células positivas que indicam que as células são irreversivelmente danificados. Este procedimento também permite alterative isolamento de motoneurônios de embriões individuais e, portanto, de ninhadas de ratos genótipo misto embrionárias. Em conclusão, esta alternativa ao procedimento panning com o anticorpo p75 NTR 6 tem capacidades semelhantes, se não idênticos em termos de faixas de possível aplicação e proporciona um método de purificação barato e eficiente alternativa para os motoneurônios embrionárias de camundongos.
Disclosures
Não há conflitos de interesse declarados.
Acknowledgments
Agradecemos a Sandra Bargen para excelente suporte técnico. Este trabalho foi financiado pelo departamento de pesquisa da proteína (PRD, TP A1.2 (RC e TS), ea RUB Research Fond, Rektoratsprogramme -. Wissenschaftlicher Nachwuchs (AK) Os anticorpos monoclonais 39.4D5 e F55A10 foram obtidos a partir de Estudos de Desenvolvimento Hibridoma Bank (DSHB, Iowa City, IA).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Poly-DL-ornithine hydrobromide | Sigma-Aldrich | P8638 | |
| Laminin | Invitrogen | 23017-015 | |
| HBSS | GIBCO, by Life Technologies | 14170 | |
| Glass coverslips | Thermo Fisher Scientific, Inc. | 10 or 14mm | |
| Lectin | Sigma-Aldrich | L5142 | |
| Cell culture dish | Nalge Nunc international | 150350 | Nunclon delta surface |
| Horse serum | Linaris | SHD3250ZK | Each batch has to be tested for MN culture |
| B27 Supplement | GIBCO, by Life Technologies | 17504-044 | |
| Glutamax | GIBCO, by Life Technologies | 35050-038 | |
| CNTF | Sigma-Aldrich | N0513 | |
| BSA | Applichem | A1391 | |
| Neurobasal | GIBCO, by Life Technologies | 21103-041 | |
| Forceps | Stainless steel, size 4 or 5 | ||
| Trypsin | Worthington Biochemical | LS003707 | |
| Trypsin-Inhibitor | Sigma-Aldrich | T6522 | |
| Anti-Islet-1 | DSHB | 39.4D5 | Cell culture supernatant |
| Anti-Nkx6.1 | DSHB | F55A10 | Cell culture supernatant |
| Anti-p75NTR | Abcam | Ab8874 | |
| Table 3. Table of specific reagents and equipment. | |||
References
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