Summary
Een alternatieve manier van isoleren van muis embryonale motorneuronen van het ruggenmerg wordt beschreven. De methode houdt rekening met het feit dat de lectine kan binden aan de lage affiniteit zenuw groeifactor receptor p75NTR. Deze lectine-based preplating kan een zuivering vergelijkbaar met die met een specifiek antilichaam tegen de p75NTR.
Abstract
Spinal motoneuronen ontwikkelen in de richting postmitotische stadia vroege embryonale ontwikkeling van het zenuwstelsel en vervolgens uitgroeien dendrieten en axonen. Neuro-epitheliale cellen van de neurale buis die uitdrukken Nkx6.1 zijn de unieke voorloper cellen voor spinale motoneuronen 1. Hoewel postmitotische motoneuronen de richting van hun definitieve standpunt en zichzelf te organiseren in kolommen langs de spinale kanaal 2,3. Meer dan 90% van al deze gedifferentieerde en gepositioneerd motoneuronen uiten de transcriptiefactoren Islet 1 / 2. Ze innerveren de spieren van de ledematen als die van het lichaam en de inwendige organen. Onder andere motorneuronen meestal uiten de hoge affiniteit receptoren voor de hersenen afgeleide neurotrofe factor (BDNF) en neurotrofine-3 (NT-3), de tropomyosine-gerelateerde kinase B en C (TrkB, TrkC). Ze drukken niet de tropomyosine-gerelateerde kinase A (TrkA) 4. Naast de twee hoge affiniteit receptoren, doe motoneuronen drukken de lage affiniteit neurotrofine p75 NTR. De p75 NTR kunnen binden alle neurotrofinen met soortgelijke maar een lagere affiniteit voor alle neurotrofinen dan de hoge affiniteit receptoren zou binden de volwassen neurotrofinen. Binnen de embryonale ruggenmerg, is de p75 NTR uitsluitend uitgedrukt door de wervelkolom motoneuronen 5. Deze is gebruikt om motoneuron isolatie technieken te ontwikkelen om de cellen van de overgrote meerderheid van de omringende cellen 6 te zuiveren. Isoleren van motorneuronen met de hulp van specifieke antilichamen (panning) tegen de extracellulaire domeinen van de p75 NTR heeft bleek een dure methode als de hoeveelheid van de antistof gebruikt voor een enkel experiment is hoog vanwege de grootte van de plaat wordt gebruikt voor panning worden. Een veel goedkoper alternatief is het gebruik van lectine. Lectine is aangetoond dat specifiek te binden aan p75 NTR ook 7. De volgende werkwijze beschrijft een alternatieve techniek met behulp van tarwekiemen agglutinine voor een preplating procedure in plaats van de p75 NTR antilichaam. De lectine is een zeer goedkoop alternatief voor de p75 NTR antilichaam en de zuivering met behulp van cijfers lectine zijn vergelijkbaar met die van de p75 NTR antilichaam. Motoneuronen van de embryonale ruggenmerg kunnen worden geïsoleerd door deze methode, te overleven en te groeien uit neurieten.
Protocol
Voor speciale reagentia: zie Tab. 1. Alle vermelde andere reagentia worden in celkweek grade kwaliteit verkregen van Sigma Aldrich.
1. PORN-H/laminin coating van gerechten / dekglaasjes
- Bereid te werken oplossing van 0,5 mg / ml Poly-DL-ornithine hydrobromide (PORN-H) in 150 mM boraatbuffer pH 8,35.
- Een voorraad oplossing van 50 mg PORNO / 1 ml boraatbuffer kan worden voorbereid en opgeslagen bij -20 ° C.
- Steriliseer dekglaasjes door de vlammen in 100% ethanol en laat ze drogen aan de lucht.
- Bedek de ondergrond met voldoende PORNO-H-oplossing overnacht bij 4 ° C.
- Op de volgende dagen Was driemaal uit met gesteriliseerd water en lucht-drogen dekglaasjes.
- Bereid te werken oplossing van 2,5 ug / ml laminine in HBSS
- Porties kan worden opgeslagen bij -20 ° C. Dooi bij 4 ° C onmiddellijk voor gebruik.
- Bedek het oppervlak van de porno-H-gecoate dekglaasjes met de laminine-oplossing en laat ze minstens 2 uur incuberen bij kamertemperatuur tot gebruik.
2. Lectine coating van de zuivering plaat
- Bereid een oplossing van 10 mM Tris in gesteriliseerd water, pH 9,5.
- Voeg lectine (het oplossen van de lectine (Sigma L9640) poeder in HBSS), tot een uiteindelijke concentratie van 10 ug / ml.
- Smeer het oppervlak van een 10 cm celkweek schotel met 8 ml van de lectine-oplossing en laat het incubeer gedurende tenminste 30 minuten bij kamertemperatuur.
- Was de plaat drie keer met HBSS en op te slaan in HBSS tot gebruik.
- Bereid een 30mm KCl, 0,8% (w / v) NaCl depolarisatie-oplossing. Steriliseer door filtratie en bewaar bij kamertemperatuur (RT).
3. Motoneuron kweekmedium
- Dooi paard serum overnacht bij 4 ° C en inactiveren bij 55 ° C gedurende 30 min, Aliquot in 5 ml en bewaar bij -20 ° C. Ontdooien aliquot direct voor gebruik bij RT.
- Store B27-supplement in 1 ml aliqouts bij -20 ° C. Dooi B27 supplement bij RT onmiddellijk voor gebruik. Vermijd bevriezen en ontdooien cycli.
- Aliquot Glutamax in 0,5 ml porties en bewaar bij -20 ° C en gebruik het bij 1:100.
- Bereid een voorraad oplossing van 10 ug / ml CNTF in gesteriliseerd water met 0,1% BSA. Bewaren bij -20 ° C.
- Meng 46 ml neurobasal medium met 2,5 ml paard serum, 1 ml B27-supplement en 0,5 ml Glutamax direct voor gebruik.
- Voeg CNTF tot een uiteindelijke concentratie van 10 ng / ml medium en pre-warm medium tot 37 ° C.
4. Ruggenmerg dissectie
- Offer een E12.5 zwangere muis en verwijder voorzichtig de embryo's. Voeg genoeg RT HBSS volledig dekking van de embryo's.
- Verwijder de kop en staart en zet het embryo achterkant met gespreide ledematen.
- Bevestig het embryo met een pincet en verwijder de buitenste huid met de andere tang.
- Verwijder het ruggenmerg door het doorboren van de pincet eronder en til het op met zaag-achtige bewegingen aan beide zijden van het ruggenmerg.
- Breng de geïsoleerde ruggenmerg naar een nieuwe schotel met HBSS en open de centrale kanaal van het ruggenmerg aan de rugzijde.
- Verwijder de achterwortelganglia door het verwijderen van de omsluiten hersenvliezen van het ruggenmerg.
- Verzamel de lumbale delen van het ruggenmerg van maximaal zes embryo's per lectine plaat in een eppendorf reactie buis gevuld met 1 ml HBSS en op te slaan op ijs totdat de bereiding klaar is.
5. Verrijking van motoneuronen van lectine-based zuivering
Let op: Voordat u begint met de volgende stappen, de nieuwste hier voor te bereiden en voorverwarmen op de middellange (zie stap 3).
- Bereid een trypsine-oplossing door het oplossen van 1 g Trypsine in 100 ml HBSS, bewaren bij -20 ° C en dooi bij 4 ° C.
- Mix 1g trypsine-remmer met 98 ml HBSS en 2 ml van 1 M HEPES pH 7,4, moet 1 ml monsters worden bewaard bij 4 ° C.
- Breng de buis met het ruggenmerg naar een cel cultuur kap en verwijder voorzichtig 700 ul van de HBSS.
- Voeg 7,5 ul trypsine-oplossing en meng door zorgvuldig het omkeren van de buis.
- Voer trypsination gedurende 8 minuten bij 37 ° C.
- Stop de reactie door het toevoegen van 30 ul trypsine-remmer en de pipet op en neer (vermaal) zorgvuldig 10-15 keer met een 1000 ui pipettip tot er geen meer mobiele aggregaten zichtbaar zijn. Herhaal de tritureren met een 20-200 ul pipet en de bijbehorende tip.
- Pipetteer de cel oplossing in de HBSS gevulde lectine plaat en verspreiden de cellen door zachtjes het draaien van de plaat.
- Houd de lectine plaat voor 60 min bij RT op een trillingsvrij oppervlak. Bedek het om vervuiling te voorkomen.
- Verwijder de HBSS heel voorzichtig en was de plaat voorzichtig vier keer met voorverwarmd HBSS naar cel fragmenten en het niet is aangesloten / losse cellen te verwijderen.
- Direct na de laatste wasstap, voeg 500 ul depolarisatie oplossing voor de plaat en laat het incubeer gedurende 1 minuut.
- Vergemakkelijken het losmaken van de lectine gebonden cellen door schudden entikken op de plaat.
- Vul de plaat met 2 ml voorverwarmd kweekmedium en over te dragen aan een 15 ml falcon buis.
- Tel aantal cellen met een Neubauer telkamer.
- Het bord van de cel op de laminine beklede dekglaasjes of platen in een voldoende aantal afhankelijk van de toepassing.
- Voer een medium uit te wisselen over dag 1 en vervolgens elke tweede dag door een zorgvuldige vervanging van 50% van het oude medium. Gebruik altijd voorverwarmde, vers bereide nieuwe cultuur medium.
6. Representatieve resultaten:
Embryonale motoneuronen kan worden verkregen bij de muis embryo's op E12 naar E14. 2-3% van de totale celpopulatie van het lumbale ruggenmerg bestaat uit motoneuronen en als de dorsale wortel ganglion neuronen zijn p75 NTR-positief ook, is het belangrijk om zich te ontdoen van deze cellen te krijgen vóór het begin van het lectine-based preplating procedure ( voor overzicht zie figuur 1 en figuur 2). Ten tweede, de hersenvliezen ook sterk delende cellen die moet ook worden uitgesloten, omdat ze niet goed kan worden verwijderd door de lectine-based preplating procedure (figuur 2 en figuur 3). In erge gevallen kunnen deze cellen overwoekeren de cultuur platen. De vertegenwoordiger foto's in Figuur 3B en 3D geven ook een indruk over de lagere celdichtheid na het wassen van de procedures zijn uitgevoerd (zie stap 5.9 van het protocol). Culturen van embryonale muis motoneuronen worden meestal gedurende maximaal vijf of zeven dagen. Gedurende deze periode de cellen brengen hun neurieten tot een maximale lengte (figuur 4). Neurieten lengtes zijn sterk afhankelijk van de ondergrond op de borden 8. De typische ondergrond is laminine, die wordt aangebracht op PORNO-H bedekt cultuur gerechten. Motoneuronen kan ook groeien op andere of meer gedefinieerd ondergronden, zoals extracellulaire matrices gegenereerd door water lysis 8. In geval van suboptimale coating, neurieten lengte en de groei conus gebied zijn afgenomen en celdood meestal toeneemt. Trofische ondersteuning speelt een cruciale rol voor de overleving van de embryonale muis motoneuronen in cultuur. Overleving van in eerste instantie plated cellen op dag zeven dalen tot 10% tot 20% zonder trofische steun 6. Brain afgeleide neurotrofe factor (BDNF) en ciliaire neurotrofe factor (CNTF) zijn de meest gebruikte factoren, maar anderen kunnen overleven bevorderen en [Leukemie remmende factor (LIF), Cardiotrophin-1 (CT-1), basic fibroblast groeifactor (bFGF ), insulin-like growth factor 1 (IGF-1) 9].
Figuur 1. Flow schema voor de bereiding van embryonale muis motoneuronen. De schematische tekening illustreert de verschillende stappen voor het kweken van muis embryonale motoneuronen. Afkortingen: SC: het ruggenmerg; HBSS: Hanks gebalanceerde zoutoplossing, MN: motoneuron.
Figuur 2 Isolatie van het lumbale deel van het ruggenmerg van E12.5 muis A:.. E12.5 muis embryo. Voor de volgende stap worden de kop en de staart verwijderd en het lichaam is geplaatst in een dorsale-up positie B: Embryo in een dorsale-up positie. Pincet aan de linker-en rechterkant van het ruggenmerg zijn tot vaststelling van de embryo lichaam in zijn positie. Een van de forceps wordt vervolgens gebruikt om de huid snijden en te snijden onder het ruggenmerg van de andere wordt gebruikt om het embryo vast te stellen in zijn positie C:. Geïsoleerde ruggenmerg van E12.5 muis embryo. De onderdelen van het ruggenmerg (cervicaal, thoracaal, lumbaal) zijn aangegeven. Het ruggenmerg is omgeven door de hersenvliezen en een deel van de achterwortelganglia nog steeds hechten aan hun D:. Het ruggenmerg is overlangs gesneden op de rugzijde om het te openen naar de centrale kanaal E:. De hersenvliezen aan de ventrale zijde zijn nu genomen af van de platte ruggenmerg. Opmerking: Tijdens het gehaald, het lumbale deel wordt gekenmerkt door een klein sneetje F:. Alleen het lumbale deel van het ruggenmerg wordt dan genomen voor verdere procedures.
Figuur 3 Bepaling en isolatie van Islet-positieve cellen van de lumbale ruggenmerg van E12.5 muis embryo's A:.. De Islet-1 / 2 antilichaam labelt motoneuron kolommen in de embryonale lumbale ruggenmerg (rood, pijl) en Hoechst labels alle kernen binnen de sectie. Doorsnede van een E12.5 Lumar ruggenmerg. E12.5 muis embryo's werden onderdompeling-gefixeerd in 4% paraformaldehyde gedurende 6 uur, drie keer gewassen met fosfaat-gebufferde zoutoplossing en behandeld met sucrose volgens standaard procedures. Vriescoupes van 20 urn werden genomen met een cryostaat en de secties werden behandeld voor immunhistochemical kleuren volgens standaardprocedures 11. De secties software vervolgens gelabeld met Hoechst voor het lokaliseren van de celkernen. Merk op datde dorsale wortel ganglion neuronen zijn Islet-1/2-positive zo goed en dat de voorbereiding procedure sluit dit weefsel onderdelen uit het isolement procedure B:. Islet-1 label / 2 (rood, pijl) los lumbale ruggenmerg cellen van E12. 5 embryo's, links - voor en rechts - na lectine-based preplating. De cellen werden tegengekleurd met Hoechst om alle celkernen te visualiseren C:. Kwantificering van Islet-1/2-positive cellen voor en na het lectine-based preplating D:. Nkx6.1 label motoneuronen van E12.5 embryo's na een dag in de cultuur. De cellen werden tegengekleurd met Hoechst aan alle kernen cisualieze. Merk op dat 90% van alle cellen Nkx6.1 positief. Afkortingen: SC: het ruggenmerg, MN: motoneuron; DRG: dorsale wortel ganglion.
Figuur 4 Karakterisering van E12.5 muis motoneuronen A en B:.. Verrijkt geïsoleerd E12.5 muis lumbale spinale motorneuronen p75 NTR uitspreken over 0 dagen in vitro (0div) en op dag 2 in vitro (2div). Cellen werden gefixeerd met 4% paraformaldehyde en vervolgens gekleurd voor p75 NTR volgens standaard procedures. Cellen werden tegengekleurd met behulp van Hoechst om alle kernen te visualiseren C:. Verrijkt motoneuronen na 5 dagen in vitro (5div) op PORN-H en laminine als cultuur substraten en in aanwezigheid van CNTF gekleurd voor β-III-tubuline. Merk op dat de cellen zijn uitgegroeid lange neurieten en weer de typische motoneuron morfologie met een langere (vertakte) proces en een of meer kortere processen (axonen en dendrieten). Afkortingen: MN: motoneuron; div: dag in vitro.
| Na dissociatie zonder Lectin-based preplating | |||
| Totaal aantal cellen / SC | Trypan blauw-positieve cellen [%] | Islet-1/2- positieve cellen [%] | |
| 1 | 995,0 | 13,1 | 9,5 |
| 2 | 889,4 | 8,0 | 10,0 |
| 3 | 1.180.0 | 11,0 | 10,8 |
| Gemiddelde ± SD | 1.021.0 ± 147.1 | 10,7 ± 2,6 | 10,1 ± 0,7 |
| Met lectine-based preplating | |||
| Aantal cellen na preplating / SC | Trypan blauw-positieve cellen [%] | Islet-1/2- positieve cellen [%] | |
| 1 | 189,6 | 9,9 | 70,5 |
| 2 | 168,8 | 3,7 | 76,1 |
| 3 | 125,0 | 0,0 | 72,5 |
| Gemiddelde ± SD | 161,1 ± 33,0 | 4,5 ± 5,0 | 73,0 ± 2,8 |
Tabel 1. Samenvatting van de representatieve isolatie procedures voor de muis embryonale motoneuronen van het podium E12.5. Resultaten van drie verschillende isolatie procedures speciaal voor dit doel worden gegeven als het totaal aantal of percentage nummers ± SD. Afkorting: SC: het ruggenmerg; SD: standaard deviatie.
| Eilandje-1 / 2 positieve cellen met een p75-panning [%] | Eilandje-1 / 2 positieve cellen met lectine-gebaseerde panning [%] |
| 92,0 ± 3,5 1 | 73,0 ± 2,8 |
Tabel 2. Vergelijking van de lectine-gebaseerde en p75-op basis van een panning motoneuron cel aantallen. Resultaten worden gegeven als percentage getallen ± SD.
Discussion
Het voordeel van deze lectine-based preplating techniek is dat het minder duur dan de p75 NTR-based panning procedure, en de lectine is stabieler dan antilichamen. De verrijking die in Fig. 2 en Tab. 1 laat zien dat de procedure maakt het mogelijk om de zuivering van vergelijkbare aantallen cellen en dat een meerderheid van deze cellen drukken de motoneuron marker Islet-1 / 2. De meest kritische stap is de isolatie procedure voor de lumbale ruggenmerg. Het verwijderen van de hersenvliezen en de DRG's (afb. 2) is essentieel voor de volgende zuivering procedure door lectine-based preplating. Als dit correct is geslaagd, bijna alle cellen drukken de p75 NTR (voor representatief beeld zie Fig. 3a). De reden voor het verschil tussen expressie van Islet-1 / 2 en p75 NTR is waarschijnlijk omdat lumbale motoneuronen verschillend uiten hogere en lagere niveaus van Islet-1 / 2 10. In het geval van lage niveaus van Islet-1 / 2 expressie dit zou kunnen zijn ontsnapt onze aandacht in de immuncytochemical vlekken en de daaropvolgende tellen als wij waren streng met betrekking tot de positieve versus negatieve cellen (tabel 1). Bovendien, Tabel 1 toont duidelijk aan dat de geïsoleerde cellen de procedure te overleven in een gezonde toestand, want er zijn slechts weinig trypan-blauw positieve cellen die aangeven dat de cellen onherstelbaar beschadigd zijn. Deze alteratief procedure maakt het ook mogelijk isolatie van motoneuronen van single embryo's en dus ook van gemengde genotype nesten van embryonale muizen. Kortom, dit alternatief voor de panning procedure met de p75 NTR antilichaam 6 is vergelijkbaar met of zelfs identiek zijn capaciteiten op het gebied van de mogelijke toepassingen bereiken en biedt een goedkoop en efficiënt alternatief zuiveringsmethode voor de muis embryonale motoneuronen.
Disclosures
Geen belangenconflicten verklaard.
Acknowledgments
Wij danken Sandra Bargen voor een uitstekende technische ondersteuning. Dit werk werd ondersteund door de research afdeling Protein (PRD, TP A1.2 (RC en TS), en de RUB Research Fond, Rektoratsprogramme -. Wissenschaftlicher Nachwuchs (AK) De monoklonale antilichamen 39.4D5 en F55A10 werden verkregen van de Developmental Studies Hybridoma Bank (DSHB, Iowa City, IA).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Poly-DL-ornithine hydrobromide | Sigma-Aldrich | P8638 | |
| Laminin | Invitrogen | 23017-015 | |
| HBSS | GIBCO, by Life Technologies | 14170 | |
| Glass coverslips | Thermo Fisher Scientific, Inc. | 10 or 14mm | |
| Lectin | Sigma-Aldrich | L5142 | |
| Cell culture dish | Nalge Nunc international | 150350 | Nunclon delta surface |
| Horse serum | Linaris | SHD3250ZK | Each batch has to be tested for MN culture |
| B27 Supplement | GIBCO, by Life Technologies | 17504-044 | |
| Glutamax | GIBCO, by Life Technologies | 35050-038 | |
| CNTF | Sigma-Aldrich | N0513 | |
| BSA | Applichem | A1391 | |
| Neurobasal | GIBCO, by Life Technologies | 21103-041 | |
| Forceps | Stainless steel, size 4 or 5 | ||
| Trypsin | Worthington Biochemical | LS003707 | |
| Trypsin-Inhibitor | Sigma-Aldrich | T6522 | |
| Anti-Islet-1 | DSHB | 39.4D5 | Cell culture supernatant |
| Anti-Nkx6.1 | DSHB | F55A10 | Cell culture supernatant |
| Anti-p75NTR | Abcam | Ab8874 | |
| Table 3. Table of specific reagents and equipment. | |||
References
- Vallstedt, A. Different levels of repressor activity assign redundant and specific roles to Nkx6 genes in motor neuron and interneuron specification. Neuron. 31, 743-755 (2001).
- Tsuchida, T. Topographic organization of embryonic motor neurons defined by expression of LIM homeobox genes. Cell. 79, 957-970 (1994).
- Lin, J. H. Functionally related motor neuron pool and muscle sensory afferent subtypes defined by coordinate ETS gene expression. Cell. 95, 393-407 (1998).
- Wiese, S., Beck, M., Karch, C., Sendtner, M. Signalling mechanisms for survival of lesioned motoneurons. Acta Neurochir. , 21-35 (2004).
- Gavins, F. N., Chatterjee, B. E. Intravital microscopy for the study of mouse microcirculation in anti-inflammatory drug research: focus on the mesentery and cremaster preparations. J. Pharmacol. Toxicol. Methods. 49, 1-14 (2004).
- Bullen, A. Microscopic imaging techniques for drug discovery. Nat. Rev. Drug Discov. 7, 54-67 (2008).
- Hazelwood, K. L. Entering the Portal: Understanding the Digital Image Recorded Through a Microscope. Imaging Cellular and Molecular Biological Functions. , 3-43 (2007).
- Hickey, M. J. L-selectin facilitates emigration and extravascular locomotion of leukocytes during acute inflammatory responses in vivo. J. Immunol. 165, 7164-7170 (2000).
- Cara, D. C., Kubes, P. Intravital microscopy as a tool for studying recruitment and chemotaxis. Methods Mol. Biol. 239, 123-132 (2004).
- Liu, L. LSP1 is an endothelial gatekeeper of leukocyte transendothelial migration. J. Exp. Med. 201, 409-418 (2005).
- Heit, B. PI3K accelerates, but is not required for, neutrophil chemotaxis to fMLP. J. Cell Sci. 121, 205-214 (2008).
