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Neuroscience

Lectine à base d'isolement et de la culture des motoneurones embryonnaires de la souris

doi: 10.3791/3200 Published: September 15, 2011

Summary

Une autre façon d'isoler les motoneurones embryonnaires de souris à partir de la moelle épinière est décrite. La méthode prend en compte le fait que la lectine peuvent se lier au nerf affinité p75NTR bas du récepteur du facteur de croissance. Cette lectine preplating basé permet une purification similaire à celle d'un anticorps spécifique contre le p75NTR.

Abstract

Motoneurones spinaux évoluer vers les stades postmitotiques travers le développement précoce du système nerveux embryonnaire, et ensuite pousser les dendrites et les axones. Cellules neuroépithéliales du tube neural qui expriment Nkx6.1 sont les cellules précurseurs des motoneurones spinaux uniques 1. Bien motoneurones postmitotiques déplacer vers leur position finale et s'organiser en colonnes le long du tractus épinière 2,3. Plus de 90% de l'ensemble de ces motoneurones différenciées et positionné exprimer les facteurs de transcription Islet 1 / 2. Ils innervent les muscles des membres ainsi que ceux du corps et les organes internes. Entre autres, les motoneurones généralement expriment les récepteurs de haute affinité pour le facteur neurotrophique dérivé du cerveau (BDNF) et la neurotrophine-3 (NT-3), la tropomyosine liés kinase B et C (TrkB, TrkC). Ils n'expriment pas la kinase tropomyosine liés A 4 (TrkA). Outre les deux récepteurs de haute affinité, les motoneurones expriment la faible affinité pour le récepteur neurotrophine p75 NTR. Le RNT p75 peut lier tous les neurotrophines avec une affinité similaire mais inférieur à toutes les neurotrophines que les récepteurs de haute affinité lierait les neurotrophines matures. Au sein de la moelle épinière embryonnaire, la RNT p75 est exclusivement exprimé par les motoneurones spinaux 5. Cela a été utilisé pour développer des techniques d'isolement des motoneurones de purifier les cellules de la grande majorité des cellules environnantes 6. Motoneurones Isoler avec l'aide d'anticorps spécifiques (panning) contre les domaines extracellulaires de p75 NTR s'est avéré être une méthode coûteuse que la quantité d'anticorps utilisés pour une expérience unique est élevé en raison de la taille de la plaque utilisée pour le panoramique. Une alternative beaucoup plus économique est l'utilisation de la lectine. Lectine a été démontré se lier spécifiquement à p75 NTR ainsi 7. La méthode suivante décrit une technique alternative utilisant agglutinine de germe de blé pour une procédure preplating au lieu de l'anticorps p75 NTR. La lectine est une alternative très bon marché à l'anticorps p75 NTR et les qualités de purification utilisant la lectine sont comparables à celle de l'anticorps p75 NTR. Motoneurones de la moelle épinière embryonnaire peut être isolé par cette méthode, survivre et se développer hors des neurites.

Protocol

Pour les réactifs spéciaux: voir Tab. 1. Tous les autres réactifs sont mentionnés dans la qualité de grade culture cellulaire obtenue chez Sigma Aldrich.

1. Revêtement PORN-H/laminin des plats / lamelles

  1. Préparer la solution de travail de 0,5 mg / ml de poly-DL-ornithine bromhydrate (PORN-H) dans 150 mM de tampon borate de pH 8,35.
    1. Une solution stock de 50 mg PORN / 1 ml de tampon borate peut être préparé à l'avance et stocké à -20 ° C.
  2. Stériliser lamelles de verre à la flamme dans l'éthanol 100% et laissez-les sécher à l'air.
  3. Couvrir la surface avec suffisamment de porn-H solution de nuit à 4 ° C.
  4. Le lendemain laver trois fois avec de l'eau stérilisée et sécher à l'air des lamelles.
  5. Préparer la solution de travail de 2,5 pg / ml de laminine dans HBSS
    1. Aliquotes peuvent être stockés à -20 ° C. Décongeler à 4 ° C immédiatement avant l'utilisation.
  6. Couvrir la surface du couvre-PORNO-H-revêtu de la solution la laminine et les laisser incuber pendant au moins 2 h à température ambiante jusqu'à utilisation.

2. Revêtement de lectine de la plaque d'épuration

  1. Préparer une solution de Tris 10 mM dans de l'eau stérilisée, pH 9,5.
  2. Ajouter lectine (résoudre la lectine (Sigma L9640) de poudre dans HBSS) à une concentration finale de 10 pg / ml.
  3. Enduire la surface d'un plat de 10 cm de culture cellulaire avec 8 ml de la solution de lectine et laisser incuber pendant au moins 30 min à température ambiante.
  4. Laver la plaque trois fois avec HBSS et stocker dans HBSS jusqu'à utilisation.
  5. Préparer un 30 mM KCl, 0,8% (p / v) de NaCl dépolarisation-solution. Stériliser par filtration et stocker à température ambiante (RT).

3. Milieu de culture des motoneurones

  1. Cheval de dégeler le sérum nuit à 4 ° C et inactiver à 55 ° C pendant 30 min, Aliquoter en 5 ml et conserver à -20 ° C. Aliquote de dégel directement avant de l'utiliser à température ambiante.
  2. Boutique B27-supplément dans une aliqouts ml à -20 ° C. Dégel B27 complément à la température ambiante immédiatement avant utilisation. Éviter les cycles de gel et de dégel.
  3. Glutamax Aliquoter en aliquots de 0,5 ml et conserver à -20 ° C et l'utiliser à 1:100.
  4. Préparer une solution stock de 10 ug / ml dans le CNTF eau stérilisée avec la BSA à 0,1%. Conserver à -20 ° C.
  5. Mélangez 46 ml de milieu neurobasal avec 2,5 ml de sérum de chevaux, 1 ml B27-complément et 0,5 ml glutamax directement avant l'utilisation.
  6. Ajouter CNTF à une concentration finale de 10 ng / ml de milieu et préchauffer à moyen et à 37 ° C.

4. Dissection de la moelle épinière

  1. Sacrifice d'une souris E12.5 enceintes et enlever les embryons soigneusement. Ajouter suffisamment RT HBSS pour couvrir complètement les embryons.
  2. Retirez la tête et la queue et le lieu de la face arrière d'embryon avec des membres enfourché.
  3. Fixer l'embryon avec une pince et retirer la peau externe avec la pince d'autres.
  4. Retirer la moelle épinière en perçant la pince sous lui et il lève avec les mouvements de scie des deux côtés de la moelle épinière.
  5. Transférer la moelle épinière isolée d'un nouveau plat avec HBSS et ouvrir le canal central de la moelle épinière sur la face dorsale.
  6. Retirez les ganglions rachidiens en supprimant les méninges entourant la moelle épinière.
  7. Ramassez les pièces lombaire de la moelle épinière de jusqu'à 6 embryons par plaque lectine dans un tube de réaction Eppendorf remplis avec HBSS 1 ml et stocker sur la glace jusqu'à ce que la préparation est faite.

5. Enrichissement des motoneurones par la lectine à base de purification

Remarque: Avant de commencer les prochaines étapes, la dernière ici, préparer et préchauffer le support (voir l'étape 3.)

  1. Préparer une solution de trypsine par la résolution 1 g de trypsine dans du HBSS de 100 ml, conserver à -20 ° C et laisser décongeler à 4 ° C.
  2. Mélanger 1g trypsine-inhibiteur avec 98 ml de HBSS et 2 ml d'une M pH 7,4 HEPES, aliquotes de 1 ml doivent être conservés à 4 ° C.
  3. Transférer le tube avec la moelle épinière d'une hotte de culture cellulaire et retirez soigneusement 700 pl de la HBSS.
  4. Ajouter 7,5 ul solution de trypsine et mélanger en inversant le tube soigneusement.
  5. Effectuer trypsination pendant 8 min à 37 ° C.
  6. Arrêter la réaction par addition de 30 ul inhibiteur de la trypsine et la pipette de haut en bas (triturer) attentivement 10-15 fois avec une pointe de pipette 1000 ul jusqu'au agrégats cellulaires sont plus visibles. Répétez la trituration avec une pipette de 20 à 200 ul et la pointe correspondante.
  7. Pipeter la solution de cellules dans la plaque HBSS rempli de lectine et de disperser les cellules en faisant tourner la plaque.
  8. Conservez la plaque lectine pendant 60 min à température ambiante sur une surface exempte de vibrations. Couvrir pour éviter toute contamination.
  9. Retirez le HBSS très doucement et laver soigneusement la plaque 4 fois avec préchauffé HBSS pour éliminer les fragments de cellules et les cellules non attachées / seules.
  10. Immédiatement après la dernière étape de lavage, ajouter 500 ul solution de dépolarisation de la plaque et laisser incuber pendant 1min.
  11. Faciliter le détachement des cellules lectine liée par des tremblements etfrappant la plaque.
  12. Remplir la plaque avec 2 ml milieu de culture pré-chauffé et le transfert d'un tube Falcon de 15 ml.
  13. Comptez le nombre de cellules avec une chambre de comptage Neubauer.
  14. Assiette de la cellule sur les lamelles de la laminine enduits ou plaques dans un nombre approprié selon l'application.
  15. Effectuer un échange de support le jour 1 et ensuite tous les deux jours par remplacement minutieuse de 50% de l'ancien milieu. Toujours utiliser des pré-chauffée, un milieu fraîchement préparé une nouvelle culture.

6. Les résultats représentatifs:

Motoneurones embryonnaires peuvent être obtenues à partir d'embryons de souris à E12 à E14. 2-3% de la population totale des cellules de la moelle épinière lombaire se compose des motoneurones et les neurones ganglionnaires de la racine dorsale sont p75 NTR-positifs ainsi, il est important de se débarrasser de ces cellules avant de commencer la procédure preplating lectine base ( Pour un aperçu voir Figure 1 et Figure 2). Deuxièmement, les méninges notamment des cellules fortement divisant qui devraient être exclus aussi, comme ils ne peuvent pas être correctement supprimés par la procédure preplating lectine base (Figure 2 et Figure 3). Dans le pire des cas, ces cellules peuvent proliférer les plaques de culture. Les images représentant la figure 3B et 3D aussi donner une impression sur la plus faible densité cellulaire après le lavage des procédures ont été effectuées (voir l'étape 5.9 du protocole). Les cultures de motoneurones embryonnaires de souris sont généralement maintenues jusqu'à cinq ou sept jours. Durant cette période, les cellules établissent leurs neurites jusqu'à une longueur maximale (figure 4). Longueurs neurites dépendent fortement du substrat sur ​​les 8 assiettes. Le substrat typique est la laminine qui est couché sur porn-H boîtes de culture couverte. Motoneurones peuvent également se développer sur d'autres substrats ou moins définis, comme les matrices extracellulaires générés par 8 lyse de l'eau. En cas de revêtement, la longueur des neurites et la zone sous-optimale du cône de croissance sont réduites et la mort cellulaire augmente habituellement. Support trophique joue un rôle crucial pour la survie des motoneurones embryonnaires de souris en culture. La survie des cellules initialement plaqué sur sept jours chuter à 10% à 20% sans appui 6 trophiques. Facteur neurotrophique dérivé du cerveau (BDNF) et le facteur neurotrophique ciliaire (CNTF) sont les facteurs les plus couramment utilisés mais d'autres peuvent favoriser la survie aussi bien [facteur inhibiteur de leucémie (LIF), Cardiotrophin-1 (CT-1), facteur de croissance basique des fibroblastes (bFGF ), Insulin-like growth factor 1 (IGF-1) 9].

Figure 1
Schéma de la figure 1. Pour la préparation des motoneurones embryonnaires de souris. Le schéma illustre les différentes étapes pour l'isolement et la culture des motoneurones embryonnaires de souris. Abréviations: SC: la moelle épinière; HBSS: solution saline équilibrée de Hanks, MN: motoneurone.

Figure 2
Figure 2: Isolement de la partie lombaire de la moelle épinière de souris E12.5 A:.. E12.5 embryon de souris. Pour l'étape suivante, la tête et la queue sont supprimés et le corps est placé dans une position dorsale B-up: l'embryon dans une position dorsale-up. Pince à gauche et à droite de la moelle épinière sont la fixation du corps de l'embryon dans sa position. Un des forceps est ensuite utilisé pour couper la peau et à réduire au-dessous de la moelle épinière que l'autre est utilisée pour fixer l'embryon dans sa position C:. Isolé de la moelle épinière à partir d'embryons de souris E12.5. Les parties de la moelle épinière (cervicale, thoracique, lombaire) sont indiqués. La moelle épinière est entourée par les méninges et une partie du ganglion de la racine dorsale encore y attacher D:. La moelle épinière est coupé longitudinalement sur ​​la face dorsale de l'ouvrir vers le canal central E:. Les méninges sur la face ventrale sont maintenant prises hors de la moelle épinière aplati. Note: Bien pris son envol, la partie lombaire est marquée par une petite coupure F:. Seule la partie lombaire de la moelle épinière est alors pris pour d'autres procédures.

Figure 3
Figure 3: Détermination et l'isolement des îlots de cellules positives de la moelle épinière lombaire des embryons de souris E12.5 A:.. Les étiquettes Islet-1 / 2 d'anticorps colonnes motoneurone dans la moelle épinière lombaire embryonnaire (rouge, flèche) et des étiquettes Hoechst tous les noyaux au sein de la section. Coupe transversale d'un cordon Lumar E12.5 épinière. E12.5 embryons de souris ont été fixés dans l'immersion-paraformaldéhyde à 4% pendant 6 h, lavée 3 fois avec du tampon phosphate salin et traitée avec du saccharose selon des procédures standard. Cryocoupes de 20 um ont été prises avec un cryostat et les sections ont été traitées pour la coloration immunohistochimique selon les procédures habituelles 11. Les sections Ware suite étiqueté avec Hoechst pour la localisation des noyaux cellulaires. Notez queles neurones ganglionnaires de la racine dorsale sont Islet-1/2-positive ainsi et que la procédure de préparation des pièces exclut ce tissu de la procédure d'isolement B:. Islet-1 / 2 étiquetés (rouge, flèche) dissocié lombaires cellules de la moelle épinière du E12. 5 embryons, gauche - avant et à droite - après lectine basé preplating. Les cellules ont été contre-colorées avec Hoechst pour visualiser tous les noyaux des cellules C:. Quantification des cellules Islet-1/2-positive avant et après la lectine à base preplating D:. Nkx6.1 motoneurones marqué à partir de E12.5 embryons après une journée dans la culture. Les cellules ont été contre-colorées avec Hoechst pour cisualieze tous les noyaux. Notez que 90% de toutes les cellules sont Nkx6.1 positif. Abréviations: SC: la moelle épinière; MN: motoneurone; DRG: ganglion de la racine dorsale.

Figure 4
Figure 4 Caractérisation des motoneurones de souris E12.5 A et B:.. Enrichi isolées de souris E12.5 motoneurones spinaux lombaires exprimer p75 NTR à 0 jours in vitro (0div) et le jour 2 in vitro (2div). Les cellules ont été fixées avec du paraformaldéhyde 4% et ensuite colorées pour p75 NTR conformément aux procédures standard. Les cellules ont été contre l'aide de Hoechst pour visualiser tous les noyaux C:. Motoneurones Enrichi après 5 jours in vitro (5div) sur porn-H et la laminine comme substrats de culture et en présence de vitraux pour la CNTF β-III-tubuline. Notez que les cellules se sont développées hors neurites longs et afficher la morphologie du motoneurone typique avec un plus long (ramifié) processus et un ou plusieurs processus plus courts (axones et dendrites). Abréviations: MN: motoneurone; div: jours in vitro.

Après la dissociation sans lectine basé preplating
Le nombre total de cellules / SC Bleu Trypan de cellules positives [%] Cellules positives Islet-1/2- [%]
1 995,0 13,1 9,5
2 889,4 8,0 10,0
3 1.180.0 11,0 10,8
Moyenne ± SD 1.021.0 147,1 ± 10,7 ± 2,6 10,1 ± 0,7
Avec lectine basé preplating
Nombre de cellules après preplating / SC Bleu Trypan de cellules positives [%] Cellules positives Islet-1/2- [%]
1 189,6 9,9 70,5
2 168,8 3,7 76,1
3 125,0 0,0 72,5
Moyenne ± SD 161,1 ± 33,0 4,5 ± 5,0 73,0 ± 2,8

Tableau 1. Sommaire des résultats des procédures d'isolement représentant de motoneurones embryonnaires de souris du stade E12.5. À partir de 3 différentes procédures d'isolement spécialement à cet effet sont donnés comme le nombre total ou les numéros de pourcentage ± SD. Abréviation: LC: la moelle épinière; SD: déviation standard.

Islet-1 / 2 cellules positives avec p75 panoramique [%] Islet-1 / 2 cellules positives avec la lectine basée panoramique [%]
92,0 ± 3,5 1 73,0 ± 2,8

Tableau 2. Résultats de comparaison de lectine à base et p75-1 à base de panoramiques nombre de cellules des motoneurones. Numéros sont donnés à titre pourcentage ± SD.

Discussion

L'avantage de cette technique basée sur preplating lectine, c'est qu'il est moins cher que le p75 NTR procédure basée sur le panoramique, et la lectine est plus stable que les anticorps. L'enrichissement énumérés dans la Fig. 2 et Tab. 1 montre que la procédure permet à la purification des nombres similaires de cellules et que la majorité de ces cellules expriment le marqueur motoneurone Islet-1 / 2. L'étape la plus critique est la procédure d'isolement de la moelle épinière lombaire. Suppression des méninges et de la DRG (Fig. 2) est indispensable pour la procédure de purification par la suite lectine basé preplating. Si cela a été géré correctement, presque toutes les cellules expriment la p75 NTR (pour l'image représentant voir Fig. 3a). La raison de la différence entre l'expression de l'Islet-1 / 2 et p75 NTR est très probablement parce que motoneurones lombaires différentielle expriment des niveaux supérieurs et inférieurs de l'Islet-1 / 2 10. En cas de faibles niveaux de l'Islet-1 / 2 d'expression que cela pourrait avoir échappé à notre attention dans la coloration et le comptage immuncytochemical ultérieures que nous avons été sévères à l'égard de cellules positives contre un solde négatif (Tab. 1). De plus, le tableau 1 montre clairement que les cellules isolées survivent à la procédure dans un état sain, car il ya seulement quelques trypan bleu cellules positives qui indiquent que les cellules sont endommagées de façon irréversible. Cette procédure permet également l'isolement altératives des motoneurones à partir d'embryons unique et donc des portées génotype mixte de souris embryonnaires. En conclusion, cette alternative à la procédure panoramique avec l'anticorps p75 NTR 6 a même s'ils ne sont pas des capacités identiques en termes de domaines d'application possibles et fournit une méthode de purification efficace et bon marché alternatif pour motoneurones embryonnaires de souris.

Disclosures

Aucun conflit d'intérêt déclaré.

Acknowledgments

Nous tenons à remercier Sandra Bargen pour le soutien technique excellente. Ce travail a été soutenu par le département de recherche sur les protéines (PRD, TP A1.2 (RC et TS), et la recherche RUB Fond, Rektoratsprogramme -. Wissenschaftlicher Nachwuchs (AK) Les anticorps monoclonaux et les 39.4D5 F55A10 ont été obtenus à partir de l'hybridome études développementales Bank (DSHB, Iowa City, IA).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Poly-DL-ornithine hydrobromide Sigma-Aldrich P8638
Laminin Invitrogen 23017-015
HBSS GIBCO, by Life Technologies 14170
Glass coverslips Thermo Fisher Scientific, Inc. 10 or 14mm
Lectin Sigma-Aldrich L5142
Cell culture dish Nalge Nunc international 150350 Nunclon delta surface
Horse serum Linaris SHD3250ZK Each batch has to be tested for MN culture
B27 Supplement GIBCO, by Life Technologies 17504-044
Glutamax GIBCO, by Life Technologies 35050-038
CNTF Sigma-Aldrich N0513
BSA Applichem A1391
Neurobasal GIBCO, by Life Technologies 21103-041
Forceps Stainless steel, size 4 or 5
Trypsin Worthington Biochemical LS003707
Trypsin-Inhibitor Sigma-Aldrich T6522
Anti-Islet-1 DSHB 39.4D5 Cell culture supernatant
Anti-Nkx6.1 DSHB F55A10 Cell culture supernatant
Anti-p75NTR Abcam Ab8874
Table 3. Table of specific reagents and equipment.

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References

  1. Vallstedt, A. Different levels of repressor activity assign redundant and specific roles to Nkx6 genes in motor neuron and interneuron specification. Neuron. 31, 743-755 (2001).
  2. Tsuchida, T. Topographic organization of embryonic motor neurons defined by expression of LIM homeobox genes. Cell. 79, 957-970 (1994).
  3. Lin, J. H. Functionally related motor neuron pool and muscle sensory afferent subtypes defined by coordinate ETS gene expression. Cell. 95, 393-407 (1998).
  4. Wiese, S., Beck, M., Karch, C., Sendtner, M. Signalling mechanisms for survival of lesioned motoneurons. Acta Neurochir. 21-35 (2004).
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  10. Liu, L. LSP1 is an endothelial gatekeeper of leukocyte transendothelial migration. J. Exp. Med. 201, 409-418 (2005).
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Conrad, R., Jablonka, S., Sczepan, T., Sendtner, M., Wiese, S., Klausmeyer, A. Lectin-based Isolation and Culture of Mouse Embryonic Motoneurons. J. Vis. Exp. (55), e3200, doi:10.3791/3200 (2011).More

Conrad, R., Jablonka, S., Sczepan, T., Sendtner, M., Wiese, S., Klausmeyer, A. Lectin-based Isolation and Culture of Mouse Embryonic Motoneurons. J. Vis. Exp. (55), e3200, doi:10.3791/3200 (2011).

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