Summary
脊髄から、マウス胚性運動ニューロンを分離する別の方法が説明されています。方法は、考慮にレクチンが低親和性神経成長因子受容体p75NTRにバインドすることができるという事実を取ります。このレクチンベースpreplatingはp75NTRに対する特異的抗体を持つと同様の精製が可能になります。
Abstract
脊髄運動ニューロンは、初期胚神経系の発達を通じて分裂の段階に向けて開発し、続いて樹状突起と軸索を成長する。エクスプレスNkx6.1は脊髄運動ニューロン1のユニークな前駆細胞であることを神経管の神経上皮細胞。分裂の運動ニューロンは、その最終的な位置に向かって移動し、脊髄路2,3に沿って列に自分自身を整理するのに。すべてのこれらの差別化と位置付け運動ニューロンの90％以上は、転写因子の膵島1 / 2を表現する。彼らは、手足の筋肉だけでなく、体のそれらと内部器官を刺激する。なかでも、運動ニューロンは通常、脳由来神経栄養因子（BDNF）とニューロトロフィン-3（NT - 3）、トロポミオシン関連キナーゼBとC（TrkBは、TrkC）に対する高い親和性受容体を発現。彼らは、トロポミオシン関連キナーゼ（であるTrkA）4を発現しない。二つの高親和性受容体の横に、運動ニューロンは低親和性神経栄養因子受容体p75のNTRを表現してください。 P75 NTRは、成熟した神経栄養因子を結合する高親和性受容体よりもすべてのニューロトロフィンに似ていますが、低い親和性ですべての神経栄養因子を結合することができる。胚の脊髄内で、p75をNTRはもっぱら脊髄運動ニューロン5で表される。これは、周囲のセル6の大部分から細胞を浄化する運動ニューロンの単離技術を開発するために使用されています。 NTRが単一の実験に使用される抗体の量として高価な方法であることが判明しているp75の細胞外ドメインに対する特異的抗体（パン）の助けを借りて運動ニューロンを単離することにより、パンのために使用されるプレートの大きさに高いです。はるかに経済的な代替は、レクチンの使用です。レクチンは、特に同様に7 P75 NTRに結合することが示されている。次のメソッドは、代わりにp75のNTRの抗体のpreplating手順については、小麦胚芽凝集素を使って別の方法を説明します。レクチンは、p75 NTR抗体に非常に安価な代替品であり、レクチンを用いた精製グレードは、p75 NTR抗体のそれに匹敵する。胚の脊髄からの運動ニューロンは、この方法で単離し生き残ると神経突起を成長することができます。
Protocol
特殊な試薬の場合：タブを参照してください。 1。記載されているその他すべての試薬はシグマアルドリッチから得られた細胞培養グレードの品質にあります。
1。料理/カバースリップのPORN-H/lamininコーティング
- 150mMのホウ酸緩衝液pH 8.35で0.5 mg / mlのポリ- DL -オルニチン臭化水素酸塩（PORN - H）のワーキング溶液を調製します。
- 50mgのポルノ/ 1mlのホウ酸緩衝液の原液は事前に準備し、-20℃で保存することができます
- 100％エタノールで炎でガラスカバースリップを滅菌し、空気乾燥してみましょう。
- 一晩4十分なPORN - Hソリューション℃の表面を覆う
- 翌日に滅菌水と空気乾燥カバーグラスで3回洗浄する。
- HBSSで2.5μg/ mlのラミニンのワーキング溶液を調製
- アリコートを-20℃で保存することができます° C使用直前に4で解凍。
- ラミニン溶液によるPORN - H -コーティングされたカバースリップの表面をカバーし、それらを使用するまで室温で少なくとも2時間インキュベートすることができます。
2。精製プレートのレクチンコーティング
- 滅菌水に10 mMトリス、pH 9.5の溶液を調製します。
- 10μg/ mlの終濃度にレクチンを（HBSSでレクチン（シグマL9640）粉を解決する）を追加します。
- コートは、レクチン溶液8mlを持つ10cmの細胞培養皿の表面と、それが室温で少なくとも30分間インキュベートてみましょう。
- HBSS、使用するまでHBSS中の店でプレートを3回洗浄する。
- 30mMのKClを、0.8％（w / v）の塩化ナトリウムを脱分極-溶液を調製します。室温（RT）でろ過し、店舗によって滅菌する。
3。運動ニューロン培養培地
- 融解のウマ血清一晩4℃、55℃で失活℃で30分間、-20 5ml及び店舗に分注し℃に室温で使用する前に直接アリコートを解凍。
- ストア-20℃で1ミリリットルaliqoutsでB27 -サプリメント使用直前に室温でB27のサプリメントを解凍。凍結と融解を避けてください。
- アリコート-20℃で0.5 mlのアリコートとストアへのグルタミンとは1:100で、それを使用してください。
- 0.1％BSAと滅菌水で10μg/ mlのCNTFのストック溶液を調製。 -20℃で保存
- 2.5ミリリットルウマ血清1mlのB27 -サプリメントとは直接使用前に0.5ミリリットルグルタミンと46ミリリットルneurobasalメディアを混在させること。
- 37℃に10 ng / mlの培地とプレ暖かい培地の最終濃度にCNTF追加
4。脊髄の解剖
- E12.5妊娠マウスを犠牲にし、慎重に胚を削除します。完全に胚をカバーするのに十分なRT HBSSを追加。
- 頭部と尾部を取り外し、またがって手足と胚の背側を上に置きます。
- one鉗子で胚を固定し、他の鉗子と外側の皮を取り除く。
- その下に鉗子を刺すことによって脊髄を取り出して、脊髄の両側にのこぎりのような動きでそれを持ち上げます。
- HBSSで新しい皿に分離された脊髄を転送し、背側の脊髄の中心的なチャネルを開きます。
- 脊髄を囲む髄膜を除去することによって、後根神経節を削除します。
- 準備が完了するまで氷上で1 mlのHBSSとストアでいっぱいエッペンドルフ反応管のレクチンプレート当たり6胚までの脊髄の腰の部分を集める。
5。レクチンベースの精製により、運動ニューロンの濃縮
注：ここに最新の、次の手順を開始する前に培地を調製し、prewarm（ステップ3を参照。）
- 4℃-20℃と融解℃で保存、100mlのHBSSで1グラムトリプシンを解くことによってトリプシン溶液を調製します
- ミックス1グラム98ミリリットルのHBSSと1 M HEPES pH7.4の液2mlとトリプシンインヒビターは、1mlのアリコートを4℃で保存してください。
- 細胞培養フードに脊髄にチューブを移し、慎重にHBSS 700μlを削除します。
- 7.5μlのトリプシン溶液と慎重にチューブを転倒混和する。
- 37℃で8分間trypsinationを実行℃に
- 30μlのトリプシンインヒビターを加えることによって反応を停止し、それ以上の細胞の集合体が見えるようになるまで1000μlのピペットの先端で慎重に10から15回までピペッティングし、ダウン（粉薬）。 20〜200μlをピペットと対応するチップで粉砕を繰り返します。
- HBSSで満たされたレクチンプレートに細胞溶液をピペットでゆっくりと板を回転させることによって細胞を分散させる。
- 振動のない表面上に室温で60分間レクチンプレートを保管してください。汚染を避けるために、それをカバーしています。
- 非常に穏やかにHBSSを削除し、細胞断片および接続/未接続のないセルを削除するには、予め温めておいたHBSSでプレートを慎重に4回洗浄する。
- すぐに最後の洗浄ステップの後、プレートに500μlの脱分極のソリューションを追加し、それが1分インキュベートてみましょう。
- 振って、レクチン結合細胞の剥離を促進し、プレートをタッピング。
- 2ミリリットル予め温めておいた培地及び15 mlファルコンチューブに移すとプレートを埋める。
- ノイバウアー計数チャンバーで細胞の数を数えます。
- プレートアプリケーションに応じて、適切な数のラミニンコートしたカバースリップまたはプレート上に細胞。
- 1日目と、古い培地の50％を慎重に交換してその後隔日で培地交換を行います。予め温めておいた、作りたての新しい培養液を常に使用します。
6。代表的な結果：
胚の運動ニューロンはE12にE14でのマウスの胚から得ることができる。腰部脊髄の総細胞集団の2-3％は、運動ニューロンで構成され、後根神経節の神経細胞が同様にNTR陽性P75であるとして、それは（レクチンベースpreplatingの手順を開始する前に、これらの細胞を取り除くことが重要です。概要については図1と図2を参照）。第二に、髄膜は、それらが適切にレクチンベースpreplatingの手順（図2および図3）で除去することはできないとして、同様に除外されるべき強く分裂細胞が含まれています。さらに悪いケースでは、これらの細胞は培養プレートを生い茂るできます。図3B及び3Dの代表的な写真も（プロトコールのステップ5.9を参照）が実行されている手順を洗浄後に低細胞密度についての印象を与える。胎児マウスの運動ニューロンの培養は、通常最大5または7日間維持されています。この期間中に細胞が最大長（図4）に彼らの神経突起を確立する。神経突起の長さが強くプレート8上の基板に依存する。典型的な基質は、ポルノ- H覆われた培養皿上に被覆されたラミニンです。運動ニューロンは、また、水の溶解8で生成される細胞外マトリックスのように、他の以下の定義された基板上に出成長することができます。次善のコーティングのケースでは、神経突起の長さと成長円錐の面積が減少し、細胞死は通常、増加している。栄養サポートは、培養中のマウス胎児の運動ニューロンの生存に重要な役割を果たしている。栄養サポート6なしの10％から20％へ7日目ドロップで最初に播種した細胞の生存。脳由来神経栄養因子（BDNF）と毛様体神経栄養因子（CNTF）は、最も一般的に使用される要因ですが、他はよく[白血病阻害因子（LIF）、Cardiotrophin - 1（CT - 1）、塩基性線維芽細胞成長因子は、（bFGFのように生存を促進することができる）、インスリン様成長因子1（IGF - 1）9]。
胎児マウスの運動ニューロンの準備のための図1。フロースキーム。回路図の描画は、マウス胚の運動ニューロンの単離および培養のためのさまざまな手順を示しています。略語：SC：脊髄、HBSS：ハンクス平衡塩溶液、MN：運動ニューロン。
図2 E12.5マウスから脊髄の腰部分の分離：。。E12.5マウス胚。次のステップのために、頭部と尾部を除去し、本体は背アップ位置Bに配置されます：背アップの位置に胚。脊髄の左右にあるピンセットは、その位置での胚の体を固定している。鉗子の一つは、その後、その位置に胚を固定するために使用されるスキンをカットすると、脊髄の下に他をカットするために使用されるC：。E12.5マウス胚から隔離された脊髄は。脊髄（腰椎、胸椎、頚椎）の部分が示されている。脊髄は、髄膜および後根神経節の一部はまだそれらにアタッチするに囲まれているDが：。脊髄は、長手方向に中心管に向かってそれを開くために背側にカットされ、E：。腹側の髄膜が今では平坦化された脊髄から分離してください。注：オフ撮影中に、腰の部分が小さなカットによってマークされているFが：。脊髄の腰の部分だけを、さらに手続きのために取られる。
図3決定及びE12.5マウス胚の腰部脊髄からの膵島陽性細胞の分離：。。膵島- 1 / 2抗体の胚の腰部脊髄内のラベル運動ニューロンの列（赤、矢印）およびヘキスト社のラベルのすべてセクション内の核。 E12.5 lumar脊髄の断面。 E12.5マウス胚では、標準的な手順によれば、6時間の4％パラホルムアルデヒド中で浸固定リン酸緩衝生理食塩水で3回洗浄し、ショ糖で処理した。 20μmの凍結切片をクリオスタットで採取し、切片は標準的な手順11に従ってimmunhistochemical染色のために処理されていました。その後、細胞核の局在化のためにヘキストで標識されたセクションのウェア。なお、後根神経節ニューロンだけでなく、準備の手順は、単離手順からこの組織の部分が除外されるというIslet-1/2-positiveですB：。膵島- 1 / 2とラベル付けされたが（赤、矢印）E12から解離した腰部脊髄細胞。 5胚、左 - 前と右 - レクチンベースpreplating後。細胞はすべての細胞核を可視化するヘキストで対比染色したC：。レクチンベースpreplating前後Islet-1/2-positive細胞の定量D：E12.5胚からNkx6.1ラベル付け運動ニューロン培養で1日後。細胞はすべての核をcisualiezeにヘキストで対比染色した。すべての細胞の90％はNkx6.1陽性であることに注意してください。略語：SC：脊髄、MN：運動ニューロン、DRG：後根神経節。
図4 E12.5マウスの運動ニューロンの特徴づけとB：。。エンリッチは腰部脊髄運動ニューロンが in vitro で 0日（0div）にし 、in vitro（2div） の 2日目のP75 NTRを表現E12.5マウスを単離した。細胞を4％パラホルムアルデヒドで固定し、続いて標準的な手順にしたがってp75のNTRのために染色した。細胞はすべての核を可視化するヘキストを用いて対比染色したCが：。エンリッチの運動ニューロンをPORN - Hとラミニン上でin vitroで 5日間（5div）後の培養基質として、β- III -チューブリンのためのCNTFのステンドグラスの存在下で行われる。細胞は長い神経突起を成長していることに注意してくださいと長い方（分岐）プロセスと1つ以上の短いプロセス（軸索と樹状突起）で典型的な運動ニューロンの形態が表示されます。略語：MN：運動ニューロン、DIV：in vitroでの日。
| レクチンベースpreplatingなし解離後 | |||
| 細胞/ SCの合計数 | トリパンブルー陽性細胞[％] | Islet-1/2-陽性細胞[％] | |
| 1 | 995.0 | 13,1 | 9,5 |
| 2 | 889.4 | 8,0 | 10,0 |
| 3 | 1.180.0 | 11,0 | 10,8 |
| 平均 ± SDを | 1.021.0 ± 147.1 | 10,7 ± 2,6 | 10,1 ± 0,7 |
| レクチンベースpreplating付き | |||
| preplating / SC後の細胞の数 | トリパンブルー陽性細胞[％] | Islet-1/2-陽性細胞[％] | |
| 1 | 189.6 | 9,9 | 70,5 |
| 2 | 168.8 | 3,7 | 76,1 |
| 3 | 125.0 | 0,0 | 72,5 |
| 平均 ± SDを | 161.1 ± 33.0 | 4,5 ± 5,0 | 73,0 ± 2,8 |
表1。特にこの目的のために3種類の分離法から段階E12.5から、マウス胚の運動ニューロンの代表的な分離手順の要約。結果は、合計数値またはパーセンテージの数値± SDとして与えられる。略称：SC：脊髄、SD：標準偏差。
| p75のパン[％]と膵島- 1 / 2陽性細胞 | レクチンベースのパン[％]と膵島- 1 / 2陽性細胞 |
| 92,0 ± 3,5 1 | 73,0 ± 2,8 |
表2。レクチンベースおよびp75 - 1から始まるパン運動ニューロンの細胞数の比較。結果はパーセンテージの数値± SDとして与えられる。
Discussion
このレクチンベースpreplating手法の利点は、P75 NTRベースのパンの手順よりも安価であることである、とレクチンは抗体よりも安定しています。図に示されている濃縮。 2とタブ。手順は、細胞のこれらの細胞の大部分が運動ニューロンのマーカー膵島- 1 / 2を発現していることを同じような数字の精製を可能にすることが図1に示す。最も重要なステップは、腰部脊髄の分離手順です。髄膜とDRGS（図2）を削除すると、レクチンベースpreplatingによって、次の精製工程のために不可欠です。これが正しく管理されている場合は、ほとんどすべての細胞は、p75 NTRを （代表的な画像のための図3aを参照）を発現。腰椎運動ニューロンは、差動膵島- 1 / 2 10の上位と下位のレベルを表現するため膵島- 1 / 2の発現およびp75 NTRとの間の違いの理由はおそらくです。我々は正対負のセル（表1）に対して厳しいあったとして膵島- 1 / 2の発現の低レベルの場合、これはimmuncytochemical染色し、その後のカウントで我々の注意を脱出したかもしれない。さらに、表1から明らかな細胞が不可逆的に損傷していることを示すほんのトリパンブルーの陽性細胞が存在するとして、分離した細胞が正常な状態で手順を生き残ることを示しています。この変化をもたらすの手順では、また、マウス胎児からの混合遺伝子型の同腹仔の単胚とそれゆえの運動ニューロンの分離が可能になります。結論として、P75 NTR抗体を用いたパンニング手順には、この代替手段6は、可能なアプリケーションの範囲の点で類似していない場合は同一の能力を有しており、マウス胚の運動ニューロンのための安価で効率的な代替精製法を提供する。
Disclosures
利害の衝突は宣言されません。
Acknowledgments
私たちは、優れた技術サポートのためにサンドラBargenに感謝。この作品は、タンパク質の研究部門（PRD、TP A1.2（RCおよびTS）、およびRUB研究フォンド、Rektoratsprogrammeによってサポートされていました - 。wissenschaftlicher Nachwuchs（AK）モノクローナル抗体は39.4D5とF55A10発達研究ハイブリドーマから得られた銀行（DSHB、アイオワシティ、アイオワ州）。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Poly-DL-ornithine hydrobromide | Sigma-Aldrich | P8638 | |
| Laminin | Invitrogen | 23017-015 | |
| HBSS | GIBCO, by Life Technologies | 14170 | |
| Glass coverslips | Thermo Fisher Scientific, Inc. | 10 or 14mm | |
| Lectin | Sigma-Aldrich | L5142 | |
| Cell culture dish | Nalge Nunc international | 150350 | Nunclon delta surface |
| Horse serum | Linaris | SHD3250ZK | Each batch has to be tested for MN culture |
| B27 Supplement | GIBCO, by Life Technologies | 17504-044 | |
| Glutamax | GIBCO, by Life Technologies | 35050-038 | |
| CNTF | Sigma-Aldrich | N0513 | |
| BSA | Applichem | A1391 | |
| Neurobasal | GIBCO, by Life Technologies | 21103-041 | |
| Forceps | Stainless steel, size 4 or 5 | ||
| Trypsin | Worthington Biochemical | LS003707 | |
| Trypsin-Inhibitor | Sigma-Aldrich | T6522 | |
| Anti-Islet-1 | DSHB | 39.4D5 | Cell culture supernatant |
| Anti-Nkx6.1 | DSHB | F55A10 | Cell culture supernatant |
| Anti-p75NTR | Abcam | Ab8874 | |
| Table 3. Table of specific reagents and equipment. | |||
References
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