Summary
Omurilik fare embriyonik motor nöronlar izole alternatif bir yol tarif edilir. Bu yöntem, lektin düşük afinite sinir büyüme faktörü reseptör p75NTR bağlamak için aslında dikkate alır. Bu lektin tabanlı preplating p75NTR karşı spesifik antikor ile benzer bir arınma sağlar.
Abstract
Spinal motor nöronlar, erken embriyonik sinir sisteminin geliştirilmesi yoluyla postmitotic aşamalarında doğru gelişir ve daha sonra dendrit ve aksonlar büyümeye. Ifade Nkx6.1 spinal motor nöronlar 1 için benzersiz öncü hücreler olduğunu nöral tüp nöroepitelyal hücrelerin. Postmitotic motor nöronlar nihai konumuna doğru hareket ve sütunlar halinde 2,3 spinal kanal boyunca kendilerini organize rağmen. Tüm bu farklılaşmış ve konumlandırılmış motor nöronlar% 90'dan fazlası transkripsiyon faktörleri Islet 1 / 2 ifade eder. Onlar, uzuvların kasları yanı sıra beden ve iç organlar innerve. Diğerlerinin arasında, motor nöronlar genellikle yüksek reseptörler beyin türevli nörotrofik faktör (BDNF) ve nörotrofin-3 (NT-3), tropomiyozin ilgili kinaz B ve C (TrkB, TrkC) ifade eder. Tropomiyozin ilgili kinaz A (TrkA) 4 verilmemektedir. Iki yüksek reseptörler yanı sıra, motor nöronlar düşük afinite nörotrofin reseptör P75 NTR ifade. P75 NTR olgun nörotrofinler bağlamak yüksek reseptörler daha tüm nörotrofinler benzer ancak daha düşük afinite ile tüm nörotrofinler bağlayabilirsiniz. Embriyonik omurilik içinde, P75 NTR sadece spinal motor nöronlar 5 ile ifade edilir. Bu büyük çoğunluğunun hücreleri çevreleyen hücreler 6 arındırmak için motonöron izolasyon teknikleri geliştirmek için kullanılır olmuştur. P75 NTR ekstrasellüler etki karşı özel antikorlar (kaydırma) yardımı ile Yalıtımlı motor nöronlar tek bir deney için kullanılan antikor miktarı yüksek kaydırma için kullanılan plaka boyutu nedeniyle pahalı bir yöntem olduğu ortaya çıktı. Çok daha ekonomik bir alternatif lektin kullanımı. Lektin özellikle P75 NTR yanı sıra 7 bağlamak için gösterilmiştir. Aşağıdaki yöntem yerine P75 NTR antikor preplating prosedürü için buğday tohumu agglutinin kullanarak alternatif bir teknik anlatılmaktadır. Lektin NTR P75 antikor karşılaştırılabilir lektin P75 NTR antikor ve saflaştırma dereceleri son derece ucuz bir alternatif. Embriyonik omurilik motor nöronlar bu yöntemle izole edilebilir, hayatta kalmak ve neurites dışarı büyümek.
Protocol
Özel reaktifler için: Sekme bakın. 1. Listelenen tüm diğer reaktifler Sigma Aldrich alınan hücre kültürü kalitesinde.
1. Tabaklar / lamelleri PORN-H/laminin kaplama
- 150 mM borat tamponu pH 8.35, 0.5 mg / ml Poly-DL-ornitin hidrobromid (PORNO-H) çalışma çözeltisi hazırlayın.
- 50 mg PORNO / 1 ml borat tamponu bir stok solüsyonu, önceden hazırlanmış ve -20 ° C'de saklanabilir
- % 100 etanol içinde yanan cam lamelleri sterilize edin ve onları hava kurumaya bırakın.
- Kapak 4 geceleme yeterli PORNO-H çözümü ile yüzey ° C
- Ertesi gün, sterilize edilmiş su ve hava-kuru lamelleri ile üç kez yıkayın.
- HBSS 2.5 mikrogram / ml laminin çalışma çözüm hazırlayın
- Alikot -20 ° C'de saklanabilir. 4 ° C, kullanımdan hemen önce çözülmesini sağlayın.
- Laminin çözüm PORNO-H-kaplı lamelleri yüzeyini kaplayan ve onları kullanana kadar oda sıcaklığında en az 2 saat süreyle inkübe edin.
2. Lektin arıtma plaka kaplama
- Steril su, pH 9,5 10 mM Tris bir çözüm hazırlayın.
- Lektin (HBSS lektin (Sigma L9640) toz çözmek), son konsantrasyonu 10 mcg / ml ekleyin.
- Kat 8 ml lektin çözüm ile 10 cm hücre kültürü çanak yüzey ve oda sıcaklığında en az 30 dakika boyunca inkübe izin.
- Kadar HBSS HBSS ve mağaza ile plaka üç kez yıkayın.
- 30mm KCl,% 0.8 (w / v) NaCl depolarizasyon çözüm hazırlayın. Oda sıcaklığında (RT) filtrasyon ve mağaza tarafından sterilize edin.
3. Motonöron kültür ortamı
- Çözülme at serum geceleme 4 ° C ve 55 inaktive ° C 30 dakika, 5 ml ve depoya Temsili miktar -20 ° C. Çözülme kısım doğrudan RT kullanmadan önce.
- Mağaza -20 ° C'de 1 ml aliqouts B27 ilavesi Kullanmadan hemen önce RT B27 takviyesi çözülme. Donma ve çözülme döngüleri kaçının.
- Kısım -20 ° C'de 0.5 ml alikotları ve mağaza içine glutamax ve 1:100 kullanın.
- 10 mg / ml% 0,1 BSA ile sterilize su CNTF bir stok solüsyonu hazırlayın. -20 ° C'de muhafaza
- , 2.5 ml at serumu, 1 ml B27-ek ve doğrudan kullanmadan önce 0.5 ml glutamax ile 46 ml neurobasal orta karıştırın.
- 37 ° C'ye kadar nihai konsantrasyonu 10 ng / ml orta ve ön-sıcak orta CNTF ekle
4. Omurilik diseksiyonu
- E12.5 hamile bir fare Kurban ve embriyoların dikkatle çıkarın. Embriyoların tamamen karşılamak için yeterli RT HBSS ekleyin.
- Baş ve kuyruk çıkarın ve ata biner gibi uzuvları ile embriyo arka tarafında bir yer.
- Bir forseps ile embriyo saptamak ve diğer forseps ile dış deri kaldırmak.
- Forseps altında delerek omurilik çıkarın ve omurilik her iki tarafta testere gibi hareketleri ile yukarı kaldırın.
- HBSS ile yeni bir çanak izole spinal kord transferi ve dorsal tarafında omuriliğin merkezi kanal açmak.
- Dorsal kök gangliyon omurilik içine meninksler kaldırarak çıkarın.
- Buz üzerinde 1 ml HBSS ve mağaza ile dolu bir Eppendorf reaksiyon tüpünde lektin plaka başına 6 embriyolar kadar hazırlık yapılır kadar omurilik bel parçaları toplayın.
5. Lektin tabanlı arıtma tarafından motor nöronlar zenginleştirilmesi
Not: sonraki adımlara başlamadan önce, burada son (adım 3) orta hazırlamak ve prewarm
- 4 100 ml HBSS, -20 ° C'de saklamak ve çözülme 1 g tripsin çözme ° C tripsin bir çözüm hazırlayın.
- Mix 1g tripsin inhibitörü, 98 ml HBSS ve 2 ml, 1 M Hepes pH 7.4, 1 ml alikotları 4 ° C'de muhafaza edilmelidir
- Bir hücre kültürü kaputu omurilik tüp transferi ve HBSS 700 ul dikkatli bir şekilde kaldırın.
- 7.5 ul tripsin çözümü ve dikkatle tersini tüp ile karışımı ekleyin.
- 37 8 dk boyunca gerçekleştirin trypsination ° C.
- 30 ul tripsin inhibitörü ekleyerek reaksiyon durdurun ve 1000 ul pipet ucu ile dikkatli bir şekilde 10-15 kat daha fazla hücre agrega görünür olana kadar kadar pipet ve aşağı (çiğnemek). 20-200 ul pipet ve ilgili bir ipucu ile öğütme işlemi tekrarlayın.
- HBSS dolu lektin plakasına hücre çözümü Pipet ve yavaşça plaka döndürerek hücrelere dağıtmak.
- Lektin plaka titreşimsiz bir yüzey üzerinde RT 60 dakika tutun. Kontaminasyonu önlemek için üzerini kapatın.
- HBSS çok hafifçe kaldırın ve plaka hücre parçaları ve bağlı / unattached hücreleri çıkarmak için önceden ısıtılmış HBSS dikkatle 4 kez yıkayın.
- Hemen son yıkama adımdan sonra, plaka 500 ul depolarizasyon çözüm ekleyin ve 1dk için kuluçkaya yatmaktadır izin.
- Lektin bağlı hücrelerin sallayarak dekolmanı kolaylaştırılması veplaka dokunarak.
- Önceden ısıtılmış 2 ml kültür ortamı ve 15 ml şahin tüp transfer plaka doldurun.
- Neubauer sayma odasına hücre sayısını sayın.
- Plaka uygulamaya bağlı olarak uygun sayıda laminin kaplı lamelleri veya plakaları hücre.
- 1. gün ve daha sonra her iki günde bir, eski orta% 50 dikkatli yedek bir orta alışverişi yapın. Önceden ısıtılmış, taze hazırlanmış yeni bir kültür ortamı her zaman kullanın.
6. Temsilcisi sonuçları:
Embriyonik motor nöronlar E12 E14 için fare embriyoları elde edilebilir. Lomber spinal kord toplam hücre popülasyonunun% 2-3 motor nöronlar oluşur ve dorsal kök ganglion nöronlar de NTR pozitif P75 olarak, (lektin tabanlı preplating işlemine başlamadan önce bu hücrelerin kurtulmak için önemlidir. genel bakış için bkz: Şekil 1 ve Şekil 2). İkincisi, meninksler lektin tabanlı preplating prosedürü (Şekil 2 ve Şekil 3) düzgün bir şekilde çıkarılmalıdır gibi, aynı zamanda güçlü ekarte edilmelidir bölünen hücreleri içerir. Kötü durumlarda, bu hücrelerin kültür plakaları büyümek. Şekil 3B ve 3D temsili resimleri yapılmıştır prosedürleri yıkadıktan sonra (protokol adım 5.9) düşük hücre yoğunluğu hakkında bir izlenim verir. Kültürler embriyonik fare motor nöronlar genellikle beş ya da yedi gün kadar tutulur. Bu süre boyunca hücrelere maksimum uzunluğu (Şekil 4) neurites oluşturabilirsiniz. Neurite uzunlukları 8 plakaları üzerinde substrat kuvvetle bağlıdır. PORNO-H kapalı kültür yemekleri kaplı tipik substrat laminin. Motor nöronlar, su lizis 8 tarafından üretilen ekstraselüler matrisler gibi, aynı zamanda başka bir ya da daha az tanımlanmış yüzeylerde büyüyebilir . Suboptimal kaplama, neurite uzunluğu ve büyüme konisinin alanı vakalarında azalma ve hücre ölümü genellikle artar. Trofik destek kültür embriyonik fare motor nöronlar hayatta kalmak için çok önemli bir rol oynar. Trofik 6 desteği olmadan% 10 ila% 20 günde yedi damla başlangıçta kaplama hücreleri Survival. Beyin kaynaklı nörotrofik faktör (BDNF) ve Silier nörotrofik faktör (CNTF) en sık kullanılan faktörlerdir ancak diğerleri kadar [Lösemi inhibitör faktör (LIF), Cardiotrophin-1 (CT-1), temel fibroblast büyüme faktörü (bFGF olarak hayatta kalma teşvik edebilir ), İnsülin-benzeri büyüme faktörü 1 (IGF-1) 9].
Şekil 1 embriyonik fare motor nöronlar hazırlanması için akış şeması. Şematik çizim fare embriyonik motor nöronlar izolasyonu ve kültürü için farklı adımları gösteriyor. Kısaltmalar: SC: omurilik; HBSS: Hanks dengeli tuz çözeltisi; MN: motonöron.
Şekil 2 E12.5 fare omurilik bel kısmının izolasyonu: E12.5 fare embriyo. Bir sonraki adım için, baş ve kuyruk kaldırılır ve vücudun dorsal yukarı konumda B: sırt-yukarı konumda embriyo yerleştirilir. Omuriliğin sol ve sağ Forseps konumunu embriyo gövdesi tespit. Bir daha sonra forseps, deri kesme ve diğer embriyo konumunu düzeltmek için kullanılır omurilik altında kesmek için kullanılan C: E12.5 fare embriyo izole spinal kord. Spinal kord (bel, göğüs, rahim ağzı) parçalar gösterilir. Omurilik, meninksler çevrili ve dorsal kök gangliyon kısmı hala onlara eklemek D: omurilik boyuna doğru merkez kanal açmak için sırt tarafında kesilir E: ventral tarafta meninksler basık omurilik çıkarılır. Not: çıkartılır iken, bel kısmı küçük bir kesim tarafından işaretlenmiş F: omurilik Yalnızca bel kısmı daha sonra başka prosedürler için alınır .
Şekil 3 E12.5 fare embriyoları lomber spinal kord Islet-pozitif hücrelerin belirlenmesi ve izolasyonu:. Islet-1 / 2 antikor embriyonik lomber spinal kord içinde etiket motonöron sütun (kırmızı ok) ve Hoechst etiketleri tüm bölüm içindeki çekirdekleri. Bir E12.5 lumar omurilik bölümünde Çapraz. E12.5 fare embriyoları, standart prosedürlere göre, 6 saat için% 4 paraformaldehid daldırma sabit fosfat tamponlu salin solüsyonu ile 3 kez yıkanır ve sakkaroz ile tedavi edildi. 20 mikron Cryosections Kriyostat ile alınmış ve bölümlerde standart prosedürlere 11 göre immunhistochemical boyama ele alındı. Bölümlerde eşya, daha sonra hücre çekirdeğinin lokalizasyonu için Hoechst ile etiketlenir. Notdorsal kök ganglion nöronlar yanı ve Islet-1/2-positive hazırlık prosedürü izolasyon prosedürü bu doku parçaları hariç B: E12 gelen etiketli Islet-1 / 2 (kırmızı ok) ayrışmış lomber spinal kord hücreleri. 5 embriyolar, sol ve sağ öncesi lektin tabanlı preplating sonra. Hücreleri tüm hücre çekirdekleri görselleştirmek için Hoechst ile zıt C: lektin tabanlı preplating önce ve sonra Islet-1/2-positive hücrelerin Niceleme: D bir gün sonra kültür E12.5 embriyolar Nkx6.1 etiketli motor nöronlar. Hücreler tüm çekirdeklerin cisualieze Hoechst ile zıt. Tüm hücrelerin% 90 Nkx6.1 olumlu olduğunu unutmayın. Kısaltmalar: SC: omurilik; MN: motonöron; DRG: dorsal kök ganglion.
Şekil 4 A ve B E12.5 fare motor nöronlar Karakterizasyonu. Zenginleştirilmiş lomber spinal motor nöronlar 0 gün (0div) in vitro ve in vitro (2div) 2 gün P75 NTR ifade E12.5 fare izole edilmiştir. Hücreler,% 4 paraformaldehid ile sabit ve daha sonra standart prosedürlere göre P75 NTR boyandı. Hücreler tüm çekirdeklerin görselleştirmek için Hoechst kullanarak zıt C: Zenginleştirilmiş motor nöronlar PORNO-H ve laminin kültür substrat olarak in vitro (5div) 5 gün sonra ve β-III-tubulin CNTF boyanmış varlığı. Not hücreleri uzun neurites büyüdü ve uzun (dallanmış) süreci ve bir veya daha kısa süreçler (akson ve dendritler) ile tipik motonöron morfolojisi gösterilecek. Kısaltmalar: MN: motonöron; div in vitro gün.
| Lektin tabanlı preplating olmadan disosiasyon sonra | |||
| Toplam sayıda hücre / SC | Tripan mavi-pozitif hücrelerin [%] | Islet-1/2- pozitif hücrelerin [%] | |
| 1 | 995,0 | 13,1 | 9,5 |
| 2 | 889,4 | 8,0 | 10,0 |
| 3 | 1.180.0 | 11,0 | 10,8 |
| Ortalama ± SD | 1.021.0 ± 147,1 | 10,7 ± 2,6 | 10,1 ± 0,7 |
| Lektin-tabanlı preplating | |||
| Sonra hücrelerin sayısı preplating / SC | Tripan mavi-pozitif hücrelerin [%] | Islet-1/2- pozitif hücrelerin [%] | |
| 1 | 189,6 | 9,9 | 70,5 |
| 2 | 168,8 | 3,7 | 76,1 |
| 3 | 125,0 | 0,0 | 72,5 |
| Ortalama ± SD | 161.1 ± 33.0 | 4,5 ± 5,0 | 73,0 ± 2,8 |
Tablo 1. Özellikle bu amaç için 3 farklı izolasyon prosedürleri sahne E12.5 fare embriyonik motor nöronlar için temsili izolasyon prosedürleri özeti. Sonuçları sayıların toplamı, ya da yüzde numaraları ± SD olarak verilmiştir. Kısaltma: SC: omurilik, SD: standart sapma.
| Islet-1 / 2 pozitif hücrelerin P75 kaydırma [%] | Lektin tabanlı [%] kaydırma Islet-1 / 2 pozitif hücrelerin |
| 92,0 ± 3,5 1 | 73,0 ± 2,8 |
Tablo 2. Lektin tabanlı ve P75 tabanlı 1 kaydırma motonöron hücre sayıları karşılaştırılması. Yüzdesi numaraları ± SD olarak verilmiştir.
Discussion
Bu lektin tabanlı preplating tekniğin avantajı NTR P75 tabanlı kaydırma işlemi daha az pahalı olduğunu ve lektin antikorlar daha kararlı. Şekil zenginleştirme listelenmiştir. 2 ve Tab. 1 yordam, benzer sayıda hücre arıtma sağlar ve bu hücrelerin bir kısmı olduğunu gösterir motonöron işaretleyici Islet-1 / 2 ifade eder. En kritik adım lomber spinal kord izolasyon prosedürü. Lektin tabanlı preplating tarafından aşağıdaki arıtma prosedürü için zarları ve DRG'ler (Şekil 2) kaldırılması esastır. Bu doğru yönetilen varsa, hemen hemen tüm hücrelerin (temsili resim için bkz: Şekil 3a) P75 NTR ifade . Islet-1 / 2 ve P75 NTR büyük olasılıkla ifade arasındaki farkı nedeni lomber motor nöronlar farklı Islet-1 / 2 10 daha yüksek ve düşük seviyelerde ifade çünkü. Pozitif veya negatif hücreler (Çizelge 1) ile sıkı olduğu gibi düşük seviyelerde Islet-1 / 2 ifadesi bu durumda immuncytochemical boyama ve sonraki sayım dikkat kaçmış olabilir. Ayrıca, Tablo 1'de açıkça hücrelerin geri dönüşümsüz hasar olduğunu gösteren sadece birkaç tripan mavi pozitif hücrelerin olduğu gibi, izole hücrelerin sağlıklı bir durum prosedürü hayatta olduğunu gösterir. Bu değiştirici prosedürü de embriyonik farelerden alınan karışık genotip litre tek embriyo ve bu nedenle motor nöronlar izolasyonu sağlar. Sonuç olarak, P75 NTR antikor 6 kaydırma işlemi için bu alternatif benzer olmasa bile olası uygulama aralıkları açısından aynı kapasiteleri ve fare embriyonik motor nöronlar için ucuz ve verimli bir alternatif bir arıtma yöntemi sağlar .
Disclosures
Çıkar çatışması ilan etti.
Acknowledgments
Sandra Bargen Biz mükemmel teknik destek için teşekkür ederim. Bu çalışma Protein araştırma departmanı (PRD, TP A1.2 (RC ve TS) ve RUB Araştırma Fonu, Rektoratsprogramme tarafından desteklenmiştir. Wissenschaftlicher Nachwuchs (AK) monoklonal antikorlar 39.4D5 ve F55A10 Gelişim Çalışmaları Hibridoma elde edildi Bankası (DSHB, Iowa City, IA).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Poly-DL-ornithine hydrobromide | Sigma-Aldrich | P8638 | |
| Laminin | Invitrogen | 23017-015 | |
| HBSS | GIBCO, by Life Technologies | 14170 | |
| Glass coverslips | Thermo Fisher Scientific, Inc. | 10 or 14mm | |
| Lectin | Sigma-Aldrich | L5142 | |
| Cell culture dish | Nalge Nunc international | 150350 | Nunclon delta surface |
| Horse serum | Linaris | SHD3250ZK | Each batch has to be tested for MN culture |
| B27 Supplement | GIBCO, by Life Technologies | 17504-044 | |
| Glutamax | GIBCO, by Life Technologies | 35050-038 | |
| CNTF | Sigma-Aldrich | N0513 | |
| BSA | Applichem | A1391 | |
| Neurobasal | GIBCO, by Life Technologies | 21103-041 | |
| Forceps | Stainless steel, size 4 or 5 | ||
| Trypsin | Worthington Biochemical | LS003707 | |
| Trypsin-Inhibitor | Sigma-Aldrich | T6522 | |
| Anti-Islet-1 | DSHB | 39.4D5 | Cell culture supernatant |
| Anti-Nkx6.1 | DSHB | F55A10 | Cell culture supernatant |
| Anti-p75NTR | Abcam | Ab8874 | |
| Table 3. Table of specific reagents and equipment. | |||
References
- Vallstedt, A. Different levels of repressor activity assign redundant and specific roles to Nkx6 genes in motor neuron and interneuron specification. Neuron. 31, 743-755 (2001).
- Tsuchida, T. Topographic organization of embryonic motor neurons defined by expression of LIM homeobox genes. Cell. 79, 957-970 (1994).
- Lin, J. H. Functionally related motor neuron pool and muscle sensory afferent subtypes defined by coordinate ETS gene expression. Cell. 95, 393-407 (1998).
- Wiese, S., Beck, M., Karch, C., Sendtner, M. Signalling mechanisms for survival of lesioned motoneurons. Acta Neurochir. , 21-35 (2004).
- Gavins, F. N., Chatterjee, B. E. Intravital microscopy for the study of mouse microcirculation in anti-inflammatory drug research: focus on the mesentery and cremaster preparations. J. Pharmacol. Toxicol. Methods. 49, 1-14 (2004).
- Bullen, A. Microscopic imaging techniques for drug discovery. Nat. Rev. Drug Discov. 7, 54-67 (2008).
- Hazelwood, K. L. Entering the Portal: Understanding the Digital Image Recorded Through a Microscope. Imaging Cellular and Molecular Biological Functions. , 3-43 (2007).
- Hickey, M. J. L-selectin facilitates emigration and extravascular locomotion of leukocytes during acute inflammatory responses in vivo. J. Immunol. 165, 7164-7170 (2000).
- Cara, D. C., Kubes, P. Intravital microscopy as a tool for studying recruitment and chemotaxis. Methods Mol. Biol. 239, 123-132 (2004).
- Liu, L. LSP1 is an endothelial gatekeeper of leukocyte transendothelial migration. J. Exp. Med. 201, 409-418 (2005).
- Heit, B. PI3K accelerates, but is not required for, neutrophil chemotaxis to fMLP. J. Cell Sci. 121, 205-214 (2008).
