Summary
癌相关成纤维细胞（CAFS）在肌纤维母细胞肿瘤间质内的丰富，推动肿瘤进展发挥了重要作用。从人类乳腺成纤维细胞的实验产生CAFS我们开发了一个coimplantation肿瘤xengraft模型。协议描述了如何建立非洲足联的肌纤维母细胞的获取能力，以促进tumourigenesis。
Abstract
癌肿瘤细胞和非癌变的车厢称为“基质”组成的复杂的组织。基质由细胞外基质（ECM）和各种间质细胞，包括成纤维细胞，肌纤维母细胞，内皮细胞，周细胞和白细胞1-3。
肿瘤相关基质是邻近的肿瘤细胞释放大量的旁分泌信号作出反应。在疾病的过程中，基质往往成为人口，包括大量的肌纤维母细胞癌相关成纤维细胞（CAFS）。这些细胞先前已提取他们在体外培养来自许多不同类型的人类癌的。一个亚群水产科学研究院是通过上调α-平滑肌肌动蛋白（α- SMA）的表达4,5区别。这些细胞是一种“激活成纤维细胞”的标志，与肌纤维母细胞彗星类似物业ommonly观察受伤和纤维化组织6。这种肌纤维母细胞非洲足联子集的存在是高度相关，高品位的恶性肿瘤，并与患者的不良预后相关。
许多实验室，包括我们自己，已经表明，咖啡馆，当肿瘤细胞注射到免疫缺陷小鼠，能够大大促进tumourigenesis 7-10。然而，从癌患者准备的咖啡馆，经常接受各地正在进行的实验使用的广泛性，传播文化的限制期间衰老。为了克服这个困难，我们开发了一种新技术，对实验产生永生非洲足联的人类乳腺细胞株人乳腺成纤维细胞（EXP - CAFS），使用coimplantation乳腺肿瘤异种移植模型。
为了生成EXP -水产科学研究院，父母的人乳腺成纤维细胞，减少隆乳组织获得，分别为第一immortaliSED与端粒酶，端粒酶全酶的催化亚基，并表达GFP和嘌呤霉素抗性基因工程。 coimplanted与MCF - 7人乳腺癌表达小鼠异种移植成一个激活的ras癌基因（MCF - 7 - ras基因细胞）的细胞，这些细胞。最初注射的人乳腺成纤维细胞体内孵化期后，分别提取其嘌呤霉素抗性11的基础上，在肿瘤异种移植。
我们观察到，居民人乳腺成纤维细胞分化，采用肌纤维母细胞表型和后天在肿瘤进展过程中促进肿瘤的性质。重要的是，这些细胞，定义EXP - CAFS，密切模仿从乳腺癌患者解剖隔离CAFS的肿瘤促进肌纤维母细胞表型。因此，我们的肿瘤异种移植派生EXP - CAFS提供一个有效的模型来研究人类breas的生物学水产科学研究院吨癌。所描述的协议也可以用于生成和表征各种非洲足联衍生出其他类型的人类癌的人群扩展。
Protocol
1。原代培养人正常乳腺成纤维细胞的分离
隔离原代培养人正常乳腺成纤维细胞的实验程序概述图。 1A。
- 准备的细胞分解缓冲区，作为描述以前12：10％胎儿小牛血清（FCS），青霉素，链霉素（200单位/毫升），胶原酶型我（1毫克/毫升）和透明质酸（贝科的修改鹰的中等（DMEM） 125单位/ ml）。
- 多次在磷酸盐缓冲液（PBS）从减少隆乳（〜0.5克）洗净乳房组织解剖。切碎成小的片段，用无菌刀片（<1.5毫米3）组织。
- 转移到15 ml锥形管含有适量的上述细胞解离缓冲液（10毫升每0.5克组织）和最高速度为1分钟的旋涡中的组织碎片。
- 在细胞分解缓冲f消化的组织碎片或12-18 h，在37 ° C的缓慢搅拌。*注仍然会有许多未消化的组织碎片留在管件。
- 没有搅拌，在室温下5分钟孵育管。产生的基质细胞丰富上清转移到一个新的锥形管，使用5毫升的血清学吸管。
- 离心5分钟，在250 X克的基质部分，并在PBS重悬细胞沉淀。再次离心5分钟，在250 X克，并在DMEM培养液重悬细胞沉淀，辅以10％FCS。文化的DMEM含10％FCS的一个15厘米的培养皿中，在37 ° C和5％的二氧化碳的细胞。
- 宣传，直到融合细胞。它通常需要8-10天。商店细胞在-80 ° C使用冻结的介质（10％二甲基亚砜和20％FCS的DMEM）。准备作为原始股票的5个冷冻瓶。解冻一小瓶和扩大二级股票含有成纤维细胞的细胞准备5瓶5人口内传倍增（PDS）的后续实验。这些程序最小化克隆选择和文化压力，可能会发生在延长的组织文化。*注意，P1.1 - 7也可以用于隔离乳腺癌乳房切除术 12获得CAFS 。
2。 GFP标记，嘌呤霉素抗性，永生化人正常乳腺成纤维细胞的生成
- immortalise在P1.7的主人体正常乳腺孤立的成纤维细胞），介绍一个12逆转录病毒pMIG（MSCV - IRES - GFP）载体，表达hTERT和GFP。培养细胞为4-5天，然后进行排序GFP阳性细胞用流式细胞仪。
- 介绍了一种逆转录病毒pBabe PURO构建嘌呤霉素抗性基因编码成一个GFP标记的不朽的成纤维细胞。文化嘌呤存在5-7天（终浓度为：1微克/毫升）的细胞分离GFP阳性（GFP +），嘌呤霉素抗性（PURO ř
- 下一步，研究这些成纤维细胞是否会产生积极的病毒，从而导致编码GFP和嘌呤霉素抗性基因的水平转移，增长2.5 × 10 5 GFP + PURO ř永生人乳腺成纤维细胞在6厘米2天的Petri菜。
- 过滤介质的空调这些使用注射器过滤器（孔径：0.45微米），成纤维细胞，并添加到10T1 / 2鼠标为12H的成纤维细胞中存在的硫酸鱼精蛋白（5微克/毫升），增加病毒感染的效率。然后介质是额外的2天改为10％FCS - DMEM。
- 由荧光显微镜检查细胞。 10T1 / 2细胞GFP的病毒感染，将成为GFP阳性。治疗5-7天细胞嘌呤（1微克/毫升），如果任何PURO ř 10T1 / 2细胞嘌呤霉素治疗后目前形成菌落，观察板。
- 请注意，基因转录水平sfer由父母GFP + PURO ř人乳腺成纤维细胞所产生的积极的病毒可能使周围的鼠细胞和/或在肿瘤异种移植癌的细胞绿色荧光蛋白+ PURO ř。这可能会妨碍最初注入的GFP + PURO ř人类肿瘤异种移植乳腺成纤维细胞的分离过程。
3A。与乳腺癌细胞的人类乳腺成纤维细胞共注射到免疫缺陷小鼠
实验程序生成EXP - CAFS图所示。 1BA。
- 混合1 × 10 6 MCF - 7 - ras基因人类乳腺癌细胞和3x10 6 GFP + PURO ř，永生化人在P2.2产生的乳腺成纤维细胞） 。每次注射基质胶50％（V / V），准备在400μL培养基的细胞。
- 免疫缺陷的裸鼠皮下注入细胞的混合物。当咖啡馆是从不同的独立提取肿瘤，植入到每个几个小鼠左，右两翼混合物。
3B。人类乳腺成纤维细胞注射到免疫缺陷小鼠
- 要生成控制对EXP - CAFS成纤维细胞，准备3x10 6 GFP + PURO ř人在P2.2与50％（V / V）（图1BB）基质胶每次注射400μL培养基产生的乳腺成纤维细胞。不要混合成纤维细胞与癌细胞。
- 植入到裸鼠皮下网站P3b.1准备的成纤维细胞。
*注意，接种成纤维细胞形成皮肤的成纤维细胞组织，但不是肿瘤。
4A。肿瘤异种移植的剖析
- 人道毁灭鼠标窝藏皮下人乳腺癌异种移植后植入（图1BA）42天。*注意，当其他肿瘤细胞和/或成纤维细胞是coimplanted，成纤维细胞可能需要培养在肿瘤异种移植的时间超过42天，以启动他们的肌纤维母细胞表型。
- 收获从侧翼鼠标使用镊子和剪刀钝清扫肿瘤异种移植。沉浸在PBS的肿瘤组织。
4B。成纤维细胞异种移植的剖析
- 窝藏的成纤维细胞异种移植物植入后42天（图1BB）人道毁灭的鼠标。
- 使用镊子和剪刀，解剖皮下成纤维细胞异种移植。 *请注意，成纤维细胞异种移植，作为一个微小的透明组织出现，可能是很难找到的皮肤下。放入PBS成纤维细胞组织。
5。从移植瘤的原代培养细胞的制备
- 使用无菌的生物安全柜，解剖的肿瘤（〜0.5克），或成纤维细胞组织（〜0.1克）。切除的组织转移到15厘米的文化ð顶部ISH与1毫升的PBS。切碎成小组织的片段，用无菌刀片（<1.5毫米3）组织。 *请注意，如果成纤维细胞移植瘤的重量小于0.1克，收集了一些额外的成纤维细胞移植瘤和混合在一起，增加细胞隔离的数量。
- 转移到15 ml锥形细胞解离最高速度为1分钟的缓冲液（10毫升每0.5克组织）和涡管的组织碎片。
- 3小时的细胞悬液，在37 ° C的持续缓慢搅拌。
6。文化嘌呤霉素抗性细胞的分离
- 的细胞悬液，离心分离，无论是从5分钟，在250 X克的肿瘤或纤维母细胞异种移植，并在PBS悬浮细胞沉淀。再次离心5分钟，在250 × G.造成细胞沉淀重悬在10％FCS - DMEM。文化中存在的嘌呤（1微克/毫升）在一个15厘米的培养皿中的细胞在37 ° C二氧化碳和5％，以消除任何污染的肿瘤细胞和/或小鼠基质细胞。传播，直到细胞融合（2-4周）。商店细胞在-80 ° C使用冻结的介质。 *请注意，由此产生的PURO R细胞，指定42日龄EXP - CAF1（图1BA）或控制成纤维细胞（图1BB），是不朽的GFP阳性。这是建议，以检查是否这些细胞产生活跃的病毒，使用10T1 / 2细胞，在P2.3 - 6所述。
7A。文化EXP氟化钙细胞的分离
为了进一步提高水产科学研究院激活肌纤维母细胞表型，混合，与MCF - 7 - ras基因的细胞42日龄EXP - CAF1细胞，并再次注入他们到一个额外的周期为200天的裸鼠皮下。解剖和游离肿瘤异种移植成单细胞悬液培养的细胞，并在15厘米的培养皿10％FCS - DMEM菜嘌呤（1微克/毫升）的存在，正如在P60.1。传播，直到细胞融合（8-10天）。商店细胞在-80 ° C使用冻结的介质。由此产生的PURO R细胞被命名为242日龄的EXP -氟化钙细胞（图1BA ）。
7B。控制成纤维细胞培养提取
要生成控制对EXP -氟化钙细胞成纤维细胞，仅42日龄控制成纤维细胞注入无癌细胞裸鼠皮下另外，为200天。剖析和分解成单细胞悬液，并在15厘米的培养皿菜嘌呤（1微克/毫升）P6.1表示存在10％FCS - DMEM培养细胞的成纤维细胞组织。传播，直到细胞融合（3-4周）。商店细胞在-80 ° C使用冻结的介质。由此产生的PURO R细胞被命名为控制成纤维细胞（图1BB） 。
8。代表性的成果：
控制成纤维细胞- 2和EXP -氟化钙CELls，它已经从乳腺肿瘤异种移植中提取，染色强阳性，表明人类间质的标志物，包括人类特有的波形，脯氨酰- 4 -羟化酶1A，胶原蛋白，纤维连接蛋白，S100A4基因，和成纤维细胞表面蛋白 （图2A）11这些细胞间质的起源和性质。与此相反，细胞角蛋白，上皮细胞的标志物，不染，在这些绿色荧光蛋白+成纤维细胞（图2B）。因此，这些研究结果表明，提取的EXP - CaF2和控制成纤维细胞- 2细胞起源从最初引入到小鼠移植瘤的父母的人乳腺成纤维细胞。
重要的是，EXP -氟化钙细胞的比例较高染色阳性，α- SMA和细胞外基质糖蛋白腱糖蛋白 - C 5，这两个标记的肌纤维母细胞相比，42日龄EXP CAF1和控制2成纤维细胞（图2C，D）11。这些数据表明，居民的人类乳腺fibr州逐步演变成非洲足联肌纤维母细胞在肿瘤异种移植。
图1人乳腺成纤维细胞的分离示意图。 一）减少隆乳组织肉末用无菌刀片（P1.2），转移到15 ml锥形管（P1.3）。消化在细胞内分解缓冲区（P1.4）的小组织片段，在体外（P1.5 - 7）和文化准备。为了immortalise孤立的主人乳腺成纤维细胞，逆转录病毒pMIG（MSCV - IRES - GFP）载体，表达hTERT和GFP，介绍，导致GFP阳性细胞用流式细胞仪（P2.1）进行排序。 pBabe普罗逆转录病毒载体，嘌呤霉素抗性基因编码，然后引入这些细胞。嘌呤霉素治疗后，GFP标记（GFP +）嘌呤霉素抗性（普罗R），immortaliSED人类乳腺成纤维细胞中分离（P2.2）。
BA）要生成EXP - CAFS，绿色荧光蛋白+ PURO ř永生的人类乳腺成纤维细胞与MCF - 7 - ras基因的乳腺癌肿瘤细胞皮下免疫缺陷的裸鼠（P3A）共注射。切除肿瘤异种移植在植入后42天（P4A），分离成单细胞悬液（P5）的。这些细胞，然后以消除任何污染的肿瘤细胞和鼠标（六）基质细胞在体外培养中存在的嘌呤。由此产生的嘌呤霉素抗性细胞被称为实验产生CAF1（EXP - CAF1）细胞。这些细胞，手术植入后42天，再次与MCF - 7 - ras基因细胞混合前（P7a）皮下植入主机鼠标。导致肿瘤增长为200天的额外时期，然后解剖，分离，培养和嘌呤存在。孤立嘌呤霉素抗性细胞被称为EXP -氟化钙细胞（242日龄）。
BB）要隔离控制对进出口水产科学研究院细胞，GFP + PURO ř永生人乳腺成纤维细胞作为纯文化注入裸鼠皮下没有MCF - 7 - ras基因的细胞（ P3B）。成纤维细胞组织，解剖（P4B）植入后42天，被分离，分离成单细胞悬液（P5）和嘌呤霉素抗性细胞命名为控制成纤维细胞，如前面所述，（六）。这些成纤维细胞再次，植入到裸鼠皮下没有的MCF - 7 - ras基因细胞此外为200天（P7B）。成纤维细胞组织解剖，分离，培养和嘌呤存在。隔离嘌呤霉素抗性细胞被称为控制成纤维细胞（242日龄）。
图2
（三）免疫氟化钙EXP -细胞和抗体对α- SMA（红色）或腱糖蛋白C（TN - C），（红色），控制成纤维细胞（控制F.） 。细胞核用DAPI染色（蓝色）。比例尺，50微米（四）48％的氟化钙EXP -细胞为α- SMA染色阳性，而142日龄EXP - CAF1 4％和2.5％的控制成纤维细胞- 2细胞群为α- SMA阳性。 （简称小岛等al.11）
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Discussion
非洲足联特定的标记和异质性水平缺乏观察，其中包括水产科学研究院提供的这种类型的细胞的特性本身就是一个挑战。 在体外研究水产科学研究院也已阻碍了新的复杂情况，这些细胞衰老停止增殖，长期培养。我们以前尝试直接immortalise使用端粒酶逆转录病毒基因构造的主要水产科学研究院是不成功的。因此，要进一步研究肿瘤促进这些细胞的特性，我们开发了一种方法来生成使用coimplantation肿瘤异种移植模型的人乳腺成纤维细胞的永生CAFS。小学人类乳腺成纤维细胞，减少隆乳组织中提取的，之前被注射到小鼠乳腺癌细胞永生。人成纤维细胞，然后分离出的肿瘤异种移植（见图细节1BA）。更重要的是，人类乳腺成纤维细胞越来越Ëvolved到肿瘤促进肌纤维母细胞在肿瘤进展过程中CAFS。我们确实观察到242天，老地契氟化钙细胞大得多的肿瘤促进肌纤维母细胞的能力相比，42 -或70天岁EXP - CAF1细胞和控制成纤维细胞11。这种肿瘤促进EXP氟化钙细胞，这也是在乳腺癌患者准备CAFS中观察到肌纤维母细胞的能力，取决于建立分泌信号由TGF -β和SDF - 1的细胞因子11介导的循环。无论是基因转移或细胞融合肝癌细胞和成纤维细胞，介导水产科学研究院在异种移植模型 11中生成的表型之间。两者合计，这些意见建议，异种衍生EXP -水产科学研究院作为研究水产科学研究院目前在人类乳腺癌的一个有用的工具。描述的实验方案，也可用于隔离来自其他类型的人类癌的各种水产科学研究院的扩展。
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Disclosures
没有利益冲突的声明。
Acknowledgments
我们感谢慷慨支持和监督这项工作，并为这篇稿子的关键编辑基兰Mellody先生（英国曼彻斯特大学，曼彻斯特）罗伯特A ·温伯格博士（怀特黑德生物医学研究，剑桥研究所）。这个项目得到了英国研究（CR英国）授予数量C147/A6058（AO）
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM | Invitrogen | 61965-026 | |
| Fetal calf serum | GIBCO, by Life Technologies | 10270 | |
| Penicillin-streptomycin | Invitrogen | 15140-122 | |
| Collagenase type I | Sigma-Aldrich | C0130-1G | |
| hyaluronidase | Sigma-Aldrich | H4272 | |
| Vimentin (V9) antibody | Novocastra Laboratories | NCL-L- VIM-V9 |
|
| Tenascin C (BC-8) antibody | a gift from |
||
| α-SMA-Cy3 (1A4) antibody | Sigma-Aldrich | C6198 | |
Prolyl-4-hydroxylase |
Dako | M0877 | |
| (5B5) antibody | |||
| Collagen type1 1A antibody | Sigma-Aldrich | HPA011795 | |
| Pan-cytokeratin antibody | Sigma-Aldrich | C5992 | |
| Fibronectin antibody | BD Biosciences | 610077 | |
S100A4/FSP-1 (fibroblast- specific protein-1) antibody |
Dako | A5114 | |
Fibroblast surface protein (clone 1B10) antibody |
Abcam | ab11333 | |
| MSCV-IRES-GFP construct | Request to the the authors | ||
| pBabe-puro construct | Purchase from Addgene |
||
| Puromycin | Sigma-Aldrich | P8833 | |
| DAPI | Sigma-Aldrich | D9564 | |
| 15 ml conical tube | Corning | 430766 | |
| Nude mouse | Taconic | NCRNU-F | Female NCr nude |
| C3H/10T1/2 cells | ATCC | CCL-226 |
References
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