Experimentell generationens Cancer Associated-fibroblasts (CAFS) från Human bröst fibroblasts

Summary

Cancer-associerade fibroblaster (CAFS) med rik myofibroblaster vistas i tumören glatta spela en viktig roll i att driva tumörtillväxt. Vi utvecklade en coimplantation modell tumör xengraft för experimentellt generera CAFS från mänsklig bröst fibroblaster. Protokollet beskriver hur man kan upprätta CAF myofibroblaster att förvärva en förmåga att främja tumourigenesis.

Abstract

Carcinom är komplexa vävnader består av neoplastiska celler och en icke-cancerogena fack kallad "stroma. Den glatta består av extracellulärt matrix (ECM) och en mängd mesenkymala celler, bland andra fibroblaster, myofibroblaster, endotelceller, pericyter och leukocyter ^1-3.

Den tumörförknippade stroma är lyhörd för omfattande parakrina signaler släpptes av angränsande cancer celler. Under sjukdomsprocessen, ofta stroma blir befolkad av cancer-associerade fibroblaster (CAFS) inklusive ett stort antal myofibroblaster. Dessa celler har tidigare hämtats från många olika typer av mänskligt karcinom för in vitro-kultur. En subpopulation av CAFS kan särskiljas genom deras uppreglering av α-glatt muskulatur aktin (α-SMA) uttryck ^4,5. Dessa celler är ett kännetecken för "aktiverade fibroblaster" som har liknande egenskaper med myofibroblaster Commonly observerats i skadade och fibrotiska vävnader ^6. Förekomsten av denna myofibroblastic CAF delmängd är starkt relaterad till höggradig maligniteter och förenat med dålig prognos hos patienter.

Många laboratorier, inklusive vår egen, har visat att CAFS när injiceras med cancer celler till nedsatt immunförsvar möss, kan avsevärt främja tumourigenesis ^7-10. CAFS beretts av cancer patienter kan dock ofta genomgå åldrande vid utbredning i kulturen begränsar i omfattningen av deras användning inom pågående experiment. För att övervinna denna svårighet har vi utvecklat en ny teknik att experimentellt generera förevigade mänskliga bröst CAF cellinjer (exp-CAFS) från människans bröst fibroblaster, med hjälp av en coimplantation bröst modell tumören xenograft.

För att generera exp-CAFS, överordnad mänskliga bröst fibroblaster, framställda av minskningen mammoplasty vävnaden, var först immortalised med hTERT, den katalytiska subenheten av telomeras holoenzyme, och konstruerade för att uttrycka GFP och en puromycin motstånd gen. Dessa celler coimplanted med MCF-7 mänskliga celler bröstcancer som uttrycker en aktiverad Ras onkogen (MCF-7-ras celler) till en mus xenograft. Efter en tid av inkubation in vivo var initialt injicerade mänskliga bröst fibroblaster ur tumörxenografter på grundval av deras puromycin motstånd ^11.

Vi konstaterade att den bofasta människans bröst fibroblaster har differentierat, att anta ett myofibroblastic fenotyp och förvärvad tumör-främjande egenskaper under tumörprogression. Viktigt är dessa celler, som definieras som exp-CAFS, nära efterliknar tumör-främjande myofibroblastic fenotyp CAFS isolerade från bröst carcinom dissekeras från patienter. Vår tumör xenograft-derived exp-CAFS ger därför en effektiv modell för att studera biologi CAFS i mänskliga Breast karcinom. Den beskrivna protokollet kan också utvidgas för att skapa och karakterisera olika CAF befolkningen härstammar från andra typer av mänskligt karcinom.

Protocol

1. Isolering av primära odlade humana normala bröst fibroblaster

Experimentella förfaranden för att isolera primär odlade humana normala bröst fibroblaster beskrivs i figur. 1A.

1. Förbered cellen dissociation buffert, som beskrivits tidigare ^12: Dulbecco ändrade Eagles Medium (DMEM) med 10% fetalt kalv serum (FCS), penicillin-streptomycin (200 enheter / ml), kollagenas typ I (1 mg / ml) och hyaluronidas ( 125 enheter / ml).
2. Tvätta bröstvävnad skäras ut från en minskning mammoplasty (~ 0,5 gram) flera gånger i fosfatbuffrad saltlösning (PBS). Finhacka vävnaden i små fragment (<1,5 mm ³⁾ med sterilt rakblad.
3. Överför vävnaden fragmenten till en 15 ml koniska rör som innehåller en lämplig mängd av ovanstående cellen dissociation buffert (10 ml per 0,5 gram vävnad) och skaka i 1 minut vid maximal hastighet.
4. Digest vävnaden fragment i cellen dissociation bufferten feller 12-18 timmar vid 37 ° C med långsam omrörning. ^* Observera att det blir fortfarande många bitar av osmält vävnad fragment kvar i röret.
5. Inkubera röret i 5 minuter i rumstemperatur utan agitation. Överför den resulterande stromaceller cell-berikade supernatanten i ett nytt koniska rör med hjälp av en 5 ml serologisk pipett.
6. Centrifugera stromala fraktionen i 5 minuter vid 250 X g och resuspendera cellpelleten i PBS. Centrifugera igen i 5 min vid 250 X g och resuspendera cellpelleten i DMEM kompletterad med 10% FCS. Kultur cellerna i DMEM som innehåller 10% FCS i en 15 cm petriskål vid 37 ° C och 5% koldioxid.
7. Propagera celler tills konfluenta. Det tar vanligtvis 8-10 dagar. Förvara cellerna vid -80 ° C med frysning mellanstora (10% dimetylsulfoxid och 20% FCS i DMEM). Förbered 5 frysta flaskor som ett original lager. Tina en flaska och expandera cellerna att förbereda sig 5 flaskor för den sekundära beståndet innehåller fibroblaster passerats inom 5 befolkningendubbleringar (PDS) för följande experiment. Dessa förfaranden minimera klonurvalet och kultur stressen som kan inträffa under längre vävnadskultur. ^* Observera att P1.1-7 kan också användas för att isolera CAFS från bröst carcinom erhålls genom en mastektomi ^12.

2. Generering av GFP-märkta, puromycin-resistenta, förevigad humant normalt bröst fibroblaster

1. För att föreviga den primära mänskliga normala bröst fibroblaster isolerade i P1.7), införa ett retrovirus pMIG (MSCV-IRES-GFP) vektor ^12, som uttrycker både hTERT och GFP. Kultur cellerna i 4-5 dagar och sedan sortera GFP-positiva celler med flödescytometri.
2. Introducera ett retrovirus pBabe-Puro konstruera kodning en gen puromycin motstånd i GFP-märkta förevigade fibroblaster. Kultur cellerna i 5-7 dagar i närvaro av puromycin (slutlig koncentration: 1 mikrogram / ​​ml) isolera GFP-positiva (GFP +), puromycin-resistenta (Puro ^R
3. Nästa, att undersöka om dessa fibroblaster framkalla aktiv virus, vilket kan leda till den horisontella överföringen av gener som kodar GFP och puromycin motståndet växer 2.5x10 ⁵ GFP + Puro ^R förevigat mänskliga mammary fibroblaster i en 6 cm petriskål i 2 dagar.
4. Filtermaterial beroende av dessa fibroblaster hjälp av en spruta filter (porstorlek: 0,45 mikrometer) och lägg den på 10T1 / 2 mus fibroblastic celler för 12h i närvaro av protaminsulfat (5 mikrogram / ml) som ökar effektiviteten i virusinfektion. Mediet är då ändras till 10% FCS-DMEM för ytterligare 2 dagar.
5. Undersök cellerna genom en fluorescensmikroskopi. 10T1 / 2 celler infekterade av GFP viruset blir GFP-positiva. Behandla även cellerna med puromycin (1 mikrogram / ​​ml) i 5-7 dagar och observera plattan om någon Puro ^R 10T1 / 2 celler är närvarande och bildar kolonier efter puromycin behandlingen.
6. Observera att de horisontella genen TRANsfer av aktiva virus som produceras av föräldrarnas GFP + Puro ^R mänskliga bröst fibroblaster kan göra den omgivande murina celler och / eller celler cancer GFP + Puro ^R inom tumörxenografter. Detta kan hindra processer isolera initialt injicerade GFP + Puro ^R mänskliga bröst fibroblaster från tumörxenografter.

3a. Coinjection mänskliga bröst fibroblaster med celler bröstcancer i ett nedsatt immunförsvar mus

Experimentella förfaranden för att generera exp-CAFS illustreras i figur. 1Ba.

1. Blanda 1x10 ⁶ MCF-7-ras mänskliga bröstcancer celler och 3x10 ⁶ GFP ⁺ Puro ^R, förevigat mänskliga bröst fibroblaster genereras i P2.2). Förbered cellerna i 400 l odlingsmedium med 50% (v / v) Matrigel per injektion.
2. Injicera cellen blandningen subkutant i ett nedsatt immunförsvar nakna mus. När CAFS utvinns oberoende av olikatumörer, implantat varje blandning in i höger och vänster flanken av flera möss.

3b. Injektion av humant bröst fibroblaster i ett nedsatt immunförsvar mus

1. För att generera kontroll fibroblaster mot exp-CAFS, förbereda 3x10 ⁶ GFP ⁺ Puro ^R förevigat mänskliga mammary fibroblaster genereras i P2.2 i 400 l odlingsmedium med 50% (v / v) Matrigel per injektion (bild 1BB). Blanda inte fibroblaster med cancer celler.
2. Implantera fibroblaster upprättats i P3b.1 i subkutan platser i nakna möss.

^* Observera att inokulerade fibroblaster kommer att utgöra fibroblastic vävnaden, men inte tumören under huden.

4a. Dissekering av tumör xenograft

1. Euthanise musen hyser en subkutan mänskliga xenograft bröstcancer 42 dagar efter implantation (Fig. 1Ba). ^* Observera att när andra cancer celler och / eller fibroblaster är coimplantedKan fibroblaster behöva inkuberas längre än 42 dagar inom tumören xenograft att inleda sina myofibroblastic fenotyp.
2. Harvest tumören xenograft från flanken av musen genom dissektion med pincett och sax. Sänk ned tumörvävnad i PBS.

4b. Dissekering av fibroblast xenograft

1. Euthanise musen hysa den fibroblast xenograft 42 dagar efter implantation (Fig. 1BB).
2. Dissekera den subkutana fibroblast xenograft med pincett och sax. Placera fibroblastic vävnaden i PBS. ^* Observera att en fibroblast xenograft, som visas som en liten genomskinlig vävnad, kan vara svårt att hitta under huden.

5. Beredning av primär odlade celler från implanterad

1. Använd en steril biosäkerhet skåp att dissekera tumören (~ 0,5 gram) eller fibroblastic vävnad (~ 0,1 gram). Överför exciderad vävnaderna på toppen av en 15 cm kultur dish med 1 ml PBS. Finhacka vävnaderna i små vävnad fragment (<1,5 mm ³⁾ med sterilt rakblad. * Observera att om fibroblast xenograft väger mindre än 0,1 gram, samla in ytterligare några fibroblast implanterad och blanda dem tillsammans för att öka antalet celler för isolering.
2. Överför vävnaden fragmenten till en 15 ml koniska röret med cellen dissociation buffert (10 ml per 0,5 gram vävnad) och skaka i 1 minut vid maximal hastighet.
3. Inkubera cellsuspension i 3 h vid 37 ° C under ständig långsam omrörning.

6. Isolering av puromycin-resistenta celler i kulturen

1. Centrifugera cellsuspensionen dissocierade antingen från tumör eller fibroblast xenograft i 5 min vid 250 X g och resuspendera cellpelleten i PBS. Centrifugera igen i 5 min vid 250 x g. Resuspendera resulterar cellpelleten i 10% FCS-DMEM. Kultur cellerna i en 15 cm petriskål i närvaro av puromycin (1 mikrogram / ml) vid 37 ° Coch 5% koldioxid i syfte att undanröja eventuella kontaminerande cancer celler och / eller murina stromaceller. Propagera celler tills konfluenta (2-4 veckor). Förvara cellerna vid -80 ° C med frysning medium. * Observera att den resulterande Puro ^R celler, utsedda 42-dagar gamla exp-CAF1 (Fig. 1Ba) eller kontroll fibroblast-1 celler (bild 1BB), är odödliga och positiva för GFP. Det rekommenderas att kontrollera om dessa celler producerar aktiva virus med hjälp 10T1 / 2 celler, som beskrivs i P2.3-6.

7a. Isolering av exp-CaF2 celler i kulturen

För att ytterligare öka aktiveras myofibroblastic fenotyp CAFS, blanda 42-dagar gamla exp-CAF1 celler med MCF-7-ras celler och injicerar dem igen subkutant i en naken mus för ytterligare perioder om 200 dagar. Dissekera och skilja tumören xenograft i en encelliga fjädring och kultur cellerna i en 15 cm petriskål med 10% FCS-DMEM i närvaro av puromycin (1 mikrogram / ml), vilket anges i P60,1. Propagera celler tills konfluenta (8-10 dagar). Förvara cellerna vid -80 ° C med frysning medium. Den resulterande Puro ^R celler heter 242-dagar gamla exp-CaF2 celler (bild 1Ba).

7b. Utvinning av kontroll fibroblast-2-celler i kultur

För att generera kontroll fibroblaster mot exp-CaF2 celler, injicera 42-dagar gamla kontroll fibroblast-1 celler ensam utan cancer celler subkutant i en naken mus dessutom för 200 dagar. Dissekera och skilja fibroblastic vävnaden till en enda cell fjädring och kultur cellerna i en 15 cm petriskål med 10% FCS-DMEM i närvaro av puromycin (1 mikrogram / ml) som anges i P6.1. Propagera celler tills konfluenta (3-4 veckor). Förvara cellerna vid -80 ° C med frysning medium. Den resulterande Puro ^R celler heter kontroll fibroblast-2-celler (bild 1BB).

8. Representativa resultat:

Kontroll fibroblast-2 och exp-CaF2 celLS, som har hämtats från xenografter brösttumör, betsad starkt positiv för mesenkymala markörer, inklusive mänskliga specifika vimentin, prolyl-4-hydroxylas, kollagen 1A, fibronektin, S100A4 och fibroblast ytprotein (Fig. 2A) ^11, vilket indikerar mänskliga ursprung och mesenkymala arten av dessa celler. Däremot var Cytokeratin, en markör för epitelceller, inte färgas i dessa GFP ⁺ fibroblaster (Fig. 2B). Dessa rön föreslår därför att de extraherade exp-CaF2 och kontroll fibroblast-2-celler har sitt ursprung från föräldrarnas mänskliga bröst fibroblaster ursprungligen infördes i musen implanterad.

Viktigt är betsad en högre andel exp-CaF2 celler positiva för α-SMA-och extracellulära matrix glykoprotein tenascin-C ^5, som båda är markörer för myofibroblaster jämfört med 42 dagar gamla exp-CAF1 och kontroll fibroblast-2-celler (Fig . 2C, D) ^11. Dessa data visar att bosatt mänskliga bröst fibroblaster utvecklas stegvis till CAF myofibroblaster inom tumörxenografter.

Figur 1 Schematisk bild av isolering av mänskliga bröst fibroblaster. A) Minskningen mammoplasty vävnad var malet med steril rakblad (P1.2) och överföras till ett 15 ml koniskt rör (P1.3). Den lilla vävnaden fragment smälta i cellen dissociation buffert (P1.4) och förberett för kultur in vitro (P1.5-7). För att föreviga den isolerade primära mänskliga bröst fibroblaster, ett retrovirus pMIG (MSCV-IRES-GFP) vektor, som uttrycker både hTERT och GFP, infördes och den resulterande GFP-positiva celler var sorteras med flödescytometri (P2.1). Ett retrovirus pBabe-Puro vektor kodning en gen puromycin motstånd introducerades därefter in i dessa celler. Efter puromycin behandling, GFP-märkta (GFP ⁺⁾ puromycin-resistenta (Puro ^R), immortalised mänskliga bröst fibroblaster var isolerade (P2.2).

Ba) för att generera exp-CAFS, GFP ⁺ Puro ^R förevigat människors bröst fibroblaster var coinjected med MCF-7-ras bröstcancer celler subkutant i ett nedsatt immunförsvar naken mus (P3A). Tumören xenograft var opererande på 42 dagar efter implantation (P4a) och dissocierade i en encelliga fjädring (P5). Dessa celler har sedan odlas in vitro i närvaro av puromycin att eliminera eventuella kontaminerande cancer celler och mus stromaceller (P6). Den resulterande puromycin-resistenta celler kallades experimentellt genererade CAF1 (exp-CAF1) celler. Dessa celler, opererande 42 dagar efter implantationen, har återigen blandat med MCF-7-ras celler och implanteras subkutant i en mängd mus som tidigare (P7a). Den resulterande tumör tilläts växa med ytterligare 200 dagar, sedan dissekeras, dissocierade, och odlade i närvaro av puromycin. De isoleradepuromycin-resistenta celler kallades exp-CaF2 celler (242 dagar gamla).

Bb) att isolera styra cellerna mot exp-CAFS, GFP ⁺ Puro ^R förevigat människors bröst fibroblaster injicerades subkutant i en naken mus som rena kulturer utan MCF-7-ras celler (P3B). Den fibroblastic vävnad, dissekerade 42 dagar efter implantation (P4b) var dissocierade i encelliga suspensioner (P5) och puromycin-resistenta celler, som heter kontroll fibroblast-1 celler, var isolerade som beskrivits tidigare (P6). Dessa fibroblaster var återigen implanteras subkutant i en naken mus utan MCF-7-ras celler dessutom för 200 dagar (P7B). Den fibroblastic vävnaden var dissekeras, dissocierade, och odlade i närvaro av puromycin. De isolerade puromycin-resistenta celler kallades kontroll fibroblast-2-celler (242 dagar gamla).

Figur 2 (B) Däremot pan-Cytokeratin, en markör för epitelceller , kan inte påvisas i exp-CaF2 celler som uttrycker GFP (grönt). Cellkärnan färgas med 4'-6-Diamidino-2-phenylindole (DAPI) (blå). Skala bar, 50 ìm (som från Kojima et al. ¹¹⁾

(C) Immunofluorescens av exp-CaF2 celler och kontroll fibroblast-2-celler (kontroll f.) med hjälp av antikroppar mot α-SMA (röd) eller tenascin-C (TN-C) (röd). Cellkärnan färgas med DAPI (blå). Skala Bar, 50 ìm. (D) 48% av exp-CaF2 cellerna färgas positivt för α-SMA, medan en4% av 42-dagar gamla exp-CAF1 och 2,5% av kontrollgruppen fibroblast-2 cellpopulationer är positiva för α-SMA. (Som från Kojima et al.11)

Discussion

Bristen på CAF-specifika markörer och graden av heterogenitet som observerats bland CAFS göra karakterisering av denna celltyp en utmaning i sig. Studera CAFS in vitro har även hindrats av den ytterligare komplikation att dessa celler senesce och stoppa sprider sig vid odling under lång tid. Våra tidigare försök att direkt föreviga primära CAFS använder ett retrovirus hTERT cDNA konstruera misslyckades. Därför att ytterligare undersöka tumören främja egenskaperna hos dessa celler har vi utvecklat en metod för att generera förevigade CAFS från mänskliga bröst fibroblaster med en coimplantation modell tumör xenograft. Primär mänskliga bröst fibroblaster, ur minskningen mammoplasty vävnaden var förevigade innan de injiceras med celler bröstcancer i möss. Den mänskliga fibroblaster har sedan isolerade från den resulterande tumörxenografter (se bild. 1Ba för detaljer). Viktigt är människans bröst fibroblaster e alltvolved i tumör-främjande myofibroblastic CAFS under tumörprogression. Vi konstaterade mycket riktigt att 242-dagar gamla exp-CaF2 celler visar en mycket större tumör-främjande myofibroblastic förmåga jämfört med 42 - eller 70-dagar gamla exp-CAF1 celler och kontroll fibroblast-2-celler ^11. En sådan tumör-främjande myofibroblastic förmåga exp-CaF2 celler, som också observerats i CAFS beretts av bröstcancerpatienter, beror på införandet av autokrin signalering loopar medierad av TGF-β och SDF-1 cytokiner ^11. Varken genöverföring eller cell fusion mellan cancer celler och fibroblaster, medierar fenotyper av CAFS genereras i vår xenograft modell ^11. Sammantaget dessa observationer tyder på att xenograft-derived exp-CAFS fungera som ett användbart verktyg för att studera CAFS närvarande i människans bröst carcinom. Den beskrivna försöksprotokoll kan också utvidgas för att isolera olika CAFS med ursprung från andra typer av mänsklig cancer.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
DMEM	Invitrogen	61965-026
Fetal calf serum	GIBCO, by Life Technologies	10270
Penicillin-streptomycin	Invitrogen	15140-122
Collagenase type I	Sigma-Aldrich	C0130-1G
hyaluronidase	Sigma-Aldrich	H4272
Vimentin (V9) antibody	Novocastra Laboratories	NCL-L- VIM-V9
Tenascin C (BC-8) antibody			a gift from Dr. Luciano Zardi
α-SMA-Cy3 (1A4) antibody	Sigma-Aldrich	C6198
Prolyl-4-hydroxylase	Dako	M0877
(5B5) antibody
Collagen type1 1A antibody	Sigma-Aldrich	HPA011795
Pan-cytokeratin antibody	Sigma-Aldrich	C5992
Fibronectin antibody	BD Biosciences	610077
S100A4/FSP-1 (fibroblast- specific protein-1) antibody	Dako	A5114
Fibroblast surface protein (clone 1B10) antibody	Abcam	ab11333
MSCV-IRES-GFP construct			Request to the the authors
pBabe-puro construct			Purchase from Addgene
Puromycin	Sigma-Aldrich	P8833
DAPI	Sigma-Aldrich	D9564
15 ml conical tube	Corning	430766
Nude mouse	Taconic	NCRNU-F	Female NCr nude
C3H/10T1/2 cells	ATCC		CCL-226