Summary
في هذا البروتوكول، ونحن تصف تشريح المشيمة من الماوس على الحمل d10.5، تليها عزل خلايا الأرومة الغاذية باستخدام التدرج Percoll. علينا أن نبرهن ثم استخدام الخلايا المعزولة في مقايسة الغزو matrigel.
Abstract
المشيمة هي المسؤولة عن نقل الغازات، والمغذيات وعوامل النمو على الجنين، وكذلك القضاء على النفايات. وهكذا، عيوب في التنمية المشيمة لها آثار هامة على الجنين والأم، وهي سبب رئيسي من الفتك الجنينية. نوع من الخلايا الرئيسية للجزء من المشيمة الجنين هو الأرومة الغاذية. الأولية خلايا فأر الأرومة الغاذية المشيمة هي أداة مفيدة لدراسة التنمية المشيمة طبيعية وغير طبيعية، وعلى عكس خطوط الخلايا، قد تكون معزولة وتستخدم لدراسة الأرومة الغاذية في مراحل معينة من الحمل. وبالإضافة إلى ذلك، يمكن استخدام الثقافات الأولية من الأرومة الغاذية من الفئران المعدلة وراثيا لدراسة دور جينات معينة في خلايا المشيمة. ويستند بروتوكول المعروضة هنا على وصف من قبل Thordarson وآخرون. 1، والذي يستخدم في الانحدار percoll للحصول على الخلايا الأرومة الغاذية نقي نسبيا من السكان مشيمة الماوس معزولة. وهو يشبه إلى استخدام أكثر على نطاق واسعد طرق الإنسان الأرومة الغاذية الخلية 2-3 العزلة. يمكن تقييم النقاء من تلطيخ immunocytochemical للخلايا معزولة عن cytokeratin 7 4. هنا، ثم يتم تحليل الخلايا المعزولة باستخدام مقايسة الغزو matrigel لتقييم الغزو الأرومة الغاذية في المختبر 5-6. ويتم تحليل الخلايا التي غزتها كيمياء سيتولوجية مناعية والملون لفرز الأصوات.
Protocol
1. تشريح المشيمة الماوس
- إعداد أزواج التزاوج من الفئران.
- على كل من الأيام التالية، تحقق من وجود المكونات copulatory. ويعتبر اليوم الذي تم الكشف عن المكونات 0،5 يوما بعد الجماع (DPC) 7.
- ويمكن جمع مشيمة المطلوب في المرحلة من الحمل، مع تشريح نظيفة من بداية المشيمة ممكن مع تطور المشيمة ناضجة على 10.5 د. هنا، علينا أن نبرهن 14،5 DPC. في وحدات التخزين معينة، سوف 40-60 مشيمة على DPC 10.5، و 10-20 مشيمة على 14،5 DPC تسفر عن الخلية الأرومة الغاذية واضحة للعيان طبقة.
- الموت ببطء الماوس الحوامل، وإزالة الرحم، وقطع في عنق الرحم، وعلى طول مسراق الرحم.
- باستخدام مقص حاد، وقطع بين كل الحمل المستكن (الشكل 1A).
- باستخدام اثنين من أزواج من ملقط، فهم جدار الرحم عند حافة قطع، ومزق، وإزالة عضل الرحم (1B الشكل) . ويوصى احدة مسننة الزوج، ملقط غرامة معتدلة (منحني أو مستقيم)، بالإضافة إلى زوج واحد ملقط دقيق جدا (# 5، على سبيل المثال).
- مقابل المشيمة، فتح الساقط مع ملقط أو مقص، وتعريض المشيمة. استيعاب الأنسجة الرحم مع الزوج ملقط واحد، حرك آخر ملقط تحت المشيمة لفصل (الشكل 1C). إذا لزم الأمر، الجنين والأغشية الجنينية منفصلة من المشيمة. ليس من الممكن لإزالة جميع الأنسجة ساقطي من دون أن تفقد أيضا تشريح أنسجة المشيمة، ولكن يمكن إزالة الأنسجة ساقطي إضافية (شاحب) من سطح المشيمة عن طريق تقشير بلطف مع ملقط. وسوف نعتمد على التدرج Percoll نحو المزيد من التنقية.
- وضع كل المشيمة تشريح في 25 مل العازلة الجليد الباردة التفكك في أنبوب مخروطي 50 مل حتى جميع تشريح كاملة. في مراحل لاحقة، المفروم خشنا أنسجة المشيمة مع مقص أو شفرة حلاقة قبل نقل إلى المخزن المؤقت التفكك.
- أنبوب فضفاضة غطاء مخروطي الشكل والمكان في حمام 37 درجة مئوية لمدة 45-60 دقيقة. مزيج الحل تفارق بقوة من قبل pipetting تقريبا كل 10 دقيقة. وينبغي رصد الوقت الهضم الكلي عن كثب وسوف يتطلب على الأرجح بعض التجربة والخطأ لتحقيق أقصى قدر من الانتعاش الخلية. يجب أن تكون قادرة على الأنسجة تمريرها من خلال الماصة 10 مل، ولكن قطع صغيرة مرئية من الأنسجة ستبقى. سوف يؤدي إلى بقاء Overdigestion خلية الفقراء وكفاءة الطلاء. سوف الأمثل بقاء الخلية وكفاءة الطلاء تحدث عندما كتل من بضع خلايا في وجود، وليس عندما يتحقق التفكك الكامل. وعلى العكس، سوف يؤدي إلى نقاء underdigestion خفض percoll بعد الانفصال. عندما تم الوصول إلى نقطة هضم السليم، أنبوب مكان على الجليد لوقف النشاط كولاجيناز.
- تمرير الحل من خلال مصفاة الخلية لإزالة المواد غير مهضوم، وأجهزة الطرد المركزي @ 500 x ج لمدة 5 دقائق.
- لغسل وإزالةطاف و resuspend الخلايا في 10 مل محلول الغسيل. أجهزة الطرد المركزي @ 500 x ج لمدة 5 دقائق.
- خلال الطرد المركزي، وإعداد حل percoll عن طريق خلط 9،6 مل percoll و 13.4 مل حل غسيل و 1.1 مل 10X المتوسطة 199 في أنبوب 50 مل مناسبة للالطرد المركزي بسرعة عالية.
- إزالة طاف بيليه و resuspend خلية في 2 مل حل غسيل.
- إضافة إلى خلايا percoll حل وأجهزة الطرد المركزي 30000 XG @ لمدة 30 دقيقة في 4 درجات مئوية.
- إزالة أنبوب الطرد المركزي من دون إزعاج التدرج. لتصور أنبوب التدرج المكان، أمام مصدر الضوء الساطع. تحديد موقع الفرقة الأرومة الغاذية (الشكل 2)، ونضح مع الماصة، مع الحرص على عدم تعكير صفو خلايا الدم الحمراء الفرقة أدناه. وحجم الفرقة الأرومة الغاذية تكون 5-8 مل.
- نقل خلايا الأرومة الغاذية إلى أنبوب 50 مل المخروطية. إضافة إلى غسل حل إجمالي حجم 45ml.
- أجهزة الطرد المركزي @ 500 x ج لمدة 5 دقائق. إزالة طاف، و resuspend في ميدي الثقافةأم (NCTC-135). يمكن تربيتها الخلايا على طبقة رقيقة من البلاستيك أو الأنسجة matrigel الثقافة في 37 ° C و 5٪ CO 2. في اليوم 10.5، كل المشيمة ينتج ما يقرب من 50000 الخلايا الحية، التي من 80-90٪ وcytokeratin إيجابية.
3. الأرومة الغاذية الغزو الفحص
- إضافة 1-2 مل مستنبت (NCTC-135) لكل غرفة matrigel واحتضان عند 37 درجة مئوية، 5٪ CO 2 ل30-90 دقيقة.
- إزالة المتوسطة، وإضافة 1.5 مل × 10 5 خلايا معزولة حديثا في وسط 2ml إلى مجلس الشيوخ. إضافة 1 مل المتوسطة لمجلس النواب لتغطية السطح السفلي الغشاء.
- خلايا الثقافة في إدراج ل18-24 ساعة.
- وكشط خلايا matrigel من إدراج باستخدام مسحة الرغوة.
- شطف أعلى وأسفل للغرفة PBS مل 2.
- إصلاح لمدة 5 دقائق في بارافورمالدهيد مل 1 4٪ في برنامج تلفزيوني.
- وصمة عار عن طريق ملء النواب مع 400 ميكرولتر دابي (300nM) واحتضان لمدة 30 دقيقة.
- يغسل ثلاث مرات لفترة وجيزة في برنامج تلفزيوني.
- إضافة 10 ميكرولتر من انخفاض متوسط تركيب (الجلسرين 50٪ في برنامج تلفزيوني) إلى الشريحة. باستخدام ملقط، وضع غشاء على انخفاض. إضافة آخر قطرة 10 ميكرولتر من المتوسط، ثم ساترة بعناية.
- صورة والعد الخلايا. تأكد من غشاء مناسب المشرق (الخلايا أو الخلية الجانب الأعلى إلى أسفل الجانب) لمجهر المستخدمة. الصورة J البرمجيات (المعاهد الوطنية للصحة) يتضمن ميزة العد اليدوي التي يمكن استخدامها لهذا الغرض، كما يمكن أدوبي فوتوشوب أو عداد اليدوي.
4. ممثل النتائج
الشكل 1. تشريح المشيمة الماوس. (أ) يتم إزالة الرحم عن طريق قطع على طول ناقلة البيضات (الصفراء)، وعلى طول سطح mesometrial، وعلى عنق الرحم (الجزء السفلي). ويمكن بعد ذلك conceptuses الفردية يمكن فصلها عن طريق قطع مع مقص كما هو موضح. (ب) الرحم تتم إزالة الجدار بوضع اثنين في ملقط قطع سطح الرحم، وتمزق على طول الجانب مكافحة mesometrial، بالقرب من الجنين والمشيمة بعيدا عن. (ج) يتم عزل ثم المشيمة من استيعاب ملقط مع انزلاق وآخر بين المشيمة والأنسجة الرحم. ويمكن بعد ذلك الحبل السري والأغشية خارج الجنين لا يمكن فصلها عن غيرها من المشيمة.
الفصل Percoll الرقم 2. من الخلايا الأرومة الغاذية. بعد الطرد المركزي، وثلاثة نطاقات رئيسية تكون مرئية كما هو مبين في الرسوم المتحركة في اليسار، وصورة على اليمين. الشريط العلوي يحتوي على الحطام الخلوية والخلايا الليفية، وسوف تكون أكثر وضوحا. وهناك ضيق (الحمراء) الفرقة بالقرب من أسفل تحتوي خلايا الدم الحمراء تكون مرئية فقط تحت الأرومة الغاذية الفرقة منتشر. سوف ينظر المرجح المجاميع خلية في النطاق الأرومة الغاذية، كما في جهازي المبينة فقط إلى يسار السهم في الصورة.
والشكل 3. خلايا الأرومة الغاذية الغازية (السهم الأبيض) تمر من خلال طبقة matrigel والمسام الغشاء، والتي تظهر على السطح السفلي من الغشاء. المسامات هي أيضا مرئية (أسود رأس السهم). قد تحسب عدد الخلايا على سطح الغشاء بأكمله أو منطقة عينة تمثيلية. وقد عكس صورة الرمادي من تلطيخ دابي الفلورسنت النووية لتحسين التصور من الخلايا.
ويمكن تحديد خلايا الأرومة الغاذية الشكل 4.، ونقاء من السكان معزولة المقررة، من قبل المناعية للcytokeratin 7 (مركز والأرجواني). وcounterstained الخلايا مع دابي (أعلى والأزرق). الصورة المدمجة، أسفل.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
في هذا الفيديو، ونحن تثبت عزل خلايا الأرومة الغاذية من المشيمة الماوس. ثم نعرض لفحص المختبر في الأرومة الغاذية للغزو. باستخدام هذا الإجراء، وإلى حد كبير، ولكن ليس تماما، يمكن الحصول على السكان نقية من خلايا الأرومة الغاذية. إذا كان مطلوبا المزيد من النقاء، يمكن أن يؤديها الفصل المغناطيسي حبة أو التدفق الخلوي، كما وصفت لخلايا الأرومة الغاذية الأساسي الإنسان. يجب تحديد طول السليم للخطوة التفكك كولاجيناز مع كل تجربة، وسيتم المستفادة من التجربة. والإفراط في الهضم تقلل بشدة الانتعاش الخلية، في حين كيل الهضم قد يؤدي إلى انخفاض النقاء، فضلا عن أعداد أقل. على الرغم من أن نظهر استخدام أعد تجاريا غرف الغزو matrigel، يمكن أيضا أن تكون مستعدة من خلال إضافة إلى غرف matrigel transwell غير المصقول في سمك المطلوب.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
ليس لدينا شيء في الكشف عنها.
Acknowledgments
الكتاب أود أن أشكر فريق الخدمات الإبداعية في جامعة ميسوري مركز الدعم الأكاديمي الذي أنتج هذا الفيديو. وأيد هذا العمل من قبل كينيدي شرايفر يونيس المعهد الوطني للصحة والتنمية البشرية للأطفال من المعاهد الوطنية للصحة، ومنحة عدد HD055231
References
- Thordarson, G., Folger, P., Talamantes, F. Development of a placental cell culture system for studying the control of mouse placental lactogen II secretion. Placenta. 8, 573-585 (1987).
- Petroff, M. G., Phillips, T. A., Ka, H., Pace, J. L., Hunt, J. S. Isolation and culture of term human trophoblast cells. Methods. Mol. Med. 121, 203-217 (2006).
- Kliman, H. J., Nestler, J. E., Sermasi, E., Sanger, J. M., Strauss, J. F. Purification, characterization, and in vitro differentiation of cytotrophoblasts from human term placentae. Endocrinology. 118, 1567-1582 (1986).
- Blaschitz, A., Weiss, U., Dohr, G., Desoye, G. Antibody reaction patterns in first trimester placenta: implications for trophoblast isolation and purity screening. Placenta. 21, 733-741 (2000).
- Librach, C. L. 92-kD type IV collagenase mediates invasion of human cytotrophoblasts. J. Cell. Biol. 113, 437-449 (1991).
- Schulz, L. C., Widmaier, E. P. The effect of leptin on mouse trophoblast cell invasion. Biol. Reprod. 71, 1963-1967 (2004).
- Tanaka, S., Kunath, T., Hadjantonakis, A. K., Nagy, A., Rossant, J. Promotion of trophoblast stem cell proliferation by FGF4. Science. 282, 2072-2075 (1998).
