分离小鼠原代滋养细胞及滋养细胞侵袭实验

Summary

在这个协议中，我们描述了剥离的胎盘从怀孕d10.5，将鼠标放在隔离的滋养层细胞，用Percoll梯度。然后，我们演示如何使用分离的细胞在基底膜侵袭实验。

Abstract

胎盘是负责运输的养分，气体和生长因子的胎儿，以及消除废物。因此，胎盘发育缺陷的胎儿和母亲有重要的影响，是胚胎致死的一个重要原因。胎盘的胎儿部分是主要的细胞类型的滋养。小学小鼠胎盘滋养层细胞是一种有用的工具，用于研究正常和不正常的胎盘发育，不同的细胞系，可以分离和研究滋养层细胞在特定阶段的怀孕。此外，从转基因小鼠的原代培养的滋养层细胞可用于研究胎盘细胞中的特定基因的作用。这里介绍的是基于该协议索尔达松等人的描述，其中一个Percoll梯度是用来获取一个相对纯净的小鼠离体胎盘滋养层细胞的人口从。这是一个类似的更广泛地使用ð人滋养层细胞的分离方法^2-3。分离的细胞的免疫细胞化学染色细胞角蛋白7 ⁴纯度进行评估。在这里，分离的细胞进行分析，然后使用基底膜侵袭实验，以评估滋养细胞侵袭的体外 ^5-6。入侵细胞和免疫组化染色，计数分析。

Protocol

1。解剖小鼠胎盘

1. 设置对小鼠交配。
2. 在随后的日子里，检查是否存在一个交配栓。这一天被认为是一个插件检测到0.5天后性交^{（DPC）7。}
3. 可以收集在所需阶段妊娠胎盘中，用干净的夹层胎盘可能的起始与发展成熟胎盘对于d 10.5。在这里，我们展示了14.5 DPC。在给定的卷,40-60 10.5 DPC，胎盘的14.5 DPC 10-20胎盘会产生一个清晰可见的滋养层细胞层。
4. 安乐死的孕鼠，并切除子宫，宫颈的切割，沿系膜及。
5. 使用锋利的剪刀，剪之间胎体（ 图1A）。
6. 使用钳2双，掌握的子宫壁切缘，并拉开，取出子宫肌层（ 图1B） 。一对锯齿形，适度罚款（曲线或直线）的镊子加上一对非常精细的镊子（＃5，例如）的建议。
7. 胎盘的对面，打开用钳子或剪刀，露出胎盘蜕膜。抓住一个镊子对子宫组织，另一个钳滑动下方的胎盘分离（ 图1C）。如果有必要，单独的胎儿和胎盘胎膜。也没有失去胎盘组织移除所有蜕膜组织通过解剖这是不可能的，但是可以从胎盘的表面轻轻用钳子剥离除去额外的蜕膜组织（浅）。我们将依靠Percoll梯度为进一步净化。
8. 每个解剖胎盘放置在25毫升冰冷的离解缓冲液在50毫升锥形管中，直到所有的夹层是完整的。在稍后的阶段，粗切末胎盘组织用剪刀或刀片之前转移到离解缓冲。

TLE“> 2。滋养层细胞的分离培养

1. 松散帽锥形管，在37°C的浴45-60分钟。剧烈混合分离解决方案，，吸取约每10分钟。总的消化时间应密切监测，并可能会需要一些试验和错误，以达到最佳的细胞恢复。组织应该能够通过一个10毫升移液管，但将保持可见组织片。过量会导致不良的细胞的存活和电镀效率。优化细胞的生存和电镀效率时会发生的几个细胞团块存在，而不是在实现完全溶解。相反，underdigestion会导致纯度下降的Percoll分离。当已达到适当的消化点，地点管冰以停止胶原酶活性。
2. 传递通过细胞过滤网的溶液以除去未消化的材料，离心@ 500×g离心5分钟。
3. 要洗净，去掉上清液和重悬细胞在10ml洗涤溶液。离心机@ 500×g离心5分钟。
4. 在离心分离期间，准备通过混合9.6毫升Percoll液，13.4毫升洗涤溶液和1.1ml的10倍的介质199在一个50毫升的试管适合高速离心的Percoll溶液。
5. 取出上清液和重悬细胞沉淀在2毫升的洗涤溶液。
6. 添加细胞的Percoll溶液离心@ 30,000 xg离心30分钟，在4℃下
7. 删除，而不会干扰梯度离心管。可视化的梯度，地方管前一个明亮的光源。找到的滋养层带（ 图2），用吸管吸出，小心不要打扰下面的红血细胞带。的滋养带量为5-8毫升。
8. 滋养层细胞转移到50毫升锥形管。上传洗溶液的总体积为45毫升。
9. 离心机@ 500×g离心5分钟。去除上清，重悬在文化中介UM（NCTC-135）。细胞可以培养薄层基底膜或组织培养塑料上，在37℃，5％CO _2。在10.5天，每个胎盘活细胞产生大约50,000，其中80％至90％的细胞角蛋白积极。

3。滋养细胞浸润含量

1. 1-2毫升培养基（NCTC-135）添加到每个基底膜室和孵育在37℃，5％CO _2的为30-90分钟。
2. 取出介质，并加入1.5毫升×10 ⁵ 2毫升培养基上腔新鲜分离的细胞。加入1毫升中下腔，以支付较低的膜表面。
3. 培养细胞中插入为18-24小时。
4. 刮细胞和基底膜使用泡沫拭子插入。
5. 冲洗2ml的PBS中的腔室的顶部和底部。
6. 在1毫升在PBS中的4％多聚甲醛固定5分钟。
7. 染色用400μlDAPI（300NM）通过下部腔室填充，并温育30分钟。
8. 简要在PBS中洗三次。
9. 添加10微升安装介质（在PBS中的50％的甘油）滑动下降。使用镊子，奠定膜下降。继续添加10微升滴介质，然后仔细盖玻片。
10. 照片和计数细胞。一定要适当的定位膜（细胞或细胞的一面朝下）正在使用的显微镜​​。 Image J软件（美国国立卫生研究院）包括一个手动，Adobe公司的Photoshop或手动计数器计数功能，可用于这一目的。

4。代表性的成果

图1。解剖小鼠胎盘。 （一）子宫通过切割沿输卵管（黄色），沿mesometrial表面除去，和在子宫颈（底部）。然后个别conceptuses可以通过如图所示，用剪刀切割分离。 （b）在子宫除去壁放置在切割子宫表面，两钳和撕裂沿反mesometrial侧附近的胎儿和远离胎盘。 （c）本胎盘然后通过把持钳子和滑动另一个之间的胎盘和子宫组织中分离。脐带等胚外膜然后可以从胎盘中分离出来。

图2。的Percoll分离的滋养层细胞。离心后，三个主要条带将可见的如卡通左侧所示，在右侧的照片。上部频带包含细胞碎片和成纤维细胞，将是最明显的。含有红血细胞的底部附近的一紧（红色）的频带将是正下方可见漫滋养频带。细胞聚集体可能会看到的滋养层带中，示出在两个只是在照片中的箭头左侧的。

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图3。侵入性滋养层细胞（白色箭头）将通过基底膜层和膜孔，在膜的底表面上出现。毛孔也可见（黑箭头）。可能在整个膜表面或有代表性的样品区上的细胞的数目进行计数。已经被颠倒的灰度图像的DAPI荧光核染色，以提高可视化的细胞。

可以被识别， 如图4所示。滋养细胞和隔离种群的纯度评估，通过免疫染色的细胞角蛋白7（中心，品红）。将细胞用DAPI复染（顶部，蓝色）。合并后的图像底部。

Discussion

在这段视频中，我们展示了从小鼠胎盘滋养层细胞的分离。然后，我们在体外试验对滋养细胞浸润。此过程中，主要的，但不完全，纯净的滋养层细胞可以得到。磁珠分离或流式细胞术如果需要进一步纯度，可以执行，正如已经描述了初级人类滋养层细胞。适当的长度，的胶原酶分离步骤必须确定每个实验，将学到的经验。消化严重降低细胞的恢复，而下消化可能导致降低纯度，以及减少数字。虽然我们表明商业制备的基底膜入侵室的使用，它们也可能被加入基底膜在所需厚度的未涂覆的Transwell小室制备。