Изоляция первичной мышь клетки трофобласта и анализа трофобласта Вторжение

Summary

В этом протоколе описываются вскрытие плаценты от мыши по беременности d10.5, с последующим выделением из клеток трофобласта с использованием градиента Percoll. Мы тогда продемонстрировать использование изолированных клеток в анализе вторжения матригель.

Abstract

Плацента отвечает за транспортировку питательных веществ, газов и факторы роста плода, а также ликвидации отходов. Таким образом, дефекты развития плаценты иметь важные последствия для плода и матери, и являются одной из основных причин эмбриональной летальности. Основным типом клеток плода часть плаценты трофобласта. Первичный мыши плацентарных клеток трофобласта являются полезным инструментом для изучения нормального и аномального развития плаценты, и в отличие от клеточных линий, могут быть выделены и использованы для изучения трофобласта в определенных стадиях беременности. Кроме того, первичные культуры трофобласта от трансгенных мышей, может быть использован для изучения роли определенных генов в клетках плаценты. Протокол, представленные здесь, основаны на описании по Тордарсон и соавт. ^1, в которой градиент Перколла используется для получения относительно чистого населения трофобласта клетки из плаценты изолированные мыши. Это похоже на более широкое использованиег методов человеческой ^2-3 изолятор трофобласта. Чистота может быть оценена иммуноцитохимических окрашивания изолированных клеток для цитокератин 7 ^4. Здесь, изолированные клетки затем анализируются с помощью матригель анализа вторжения для оценки инвазивности трофобласта в пробирке ^5-6. Вторглись в клетки анализируют иммуноцитохимия и витражи для подсчета.

Protocol

1. Препарирование мышей плаценты

1. Настройка спаривания пары мышей.
2. На каждый из следующих дней, проверьте на наличие копулятивного вилкой. На следующий день, в котором вилка обнаружены считается 0,5 суток после полового акта (ЦОД) ^7.
3. Плаценты могут быть собраны в нужной стадии беременности, с чистого вскрытия плаценты возможно, начиная с развития зрелой плаценты на D 10.5. Здесь мы покажем, 14,5 DPC. На данный объемах, 40-60 плаценты на 10,5 DPC, и 10-20 плаценты на 14,5 DPC даст ясно видимый слой трофобласта клетки.
4. Усыпить беременной мыши и удалить матку, резка на шейке матки, и по mesometrium.
5. Используя острые ножницы, разрезать между зародыш (рис. 1А).
6. Используя две пары щипцов, держитесь стенке матки на срезе края, и растащить, удаления миометрия (рис. 1б) . Одна пара зубчатых, умеренно штраф (изогнутые или прямые) щипцы плюс одна пара очень тонких щипцов (# 5, например) рекомендуется.
7. Напротив плаценты, открыть децидуальной пинцетом или ножницами, подвергая плаценты. Схватив ткани матки с одной парой щипцов, сдвиньте другой щипцы под плаценты отделить (рис. 1С). При необходимости, отдельные плода и плодных оболочек из плаценты. Это не возможно, чтобы удалить все децидуальной ткани без рассечения также теряет плацентарной ткани, но и дополнительные децидуальной ткани (бледная) могут быть удалены с поверхности плаценты, мягко пилинг с пинцета. Мы будем опираться на Percoll градиент для дальнейшей очистки.
8. Место каждого расчлененный плаценты в 25 мл ледяного буфера диссоциации в 50 мл коническую трубку, пока все вскрытий являются полными. На более поздних стадиях, грубо фарш плацентарной ткани с помощью ножниц или лезвия бритвы до передачи в буфер диссоциации.

TLE "> 2. Выделение клетки трофобласта

1. Свободно крышкой конической трубе и место в 37 ° C бане в течение 45-60 минут. Смешайте решение диссоциации энергично с помощью пипетки примерно каждые 10 мин. Общее время пищеварения следует тщательно следить и, вероятно, потребует некоторых проб и ошибок, чтобы достичь оптимального восстановления клеток. Ткани должны быть в состоянии быть пропущен через 10 мл пипетки, но видны кусочки ткани останется. Overdigestion приведет к снижению выживаемости клеток и покрытие эффективности. Оптимальное выживания клеток и эффективность покрытия будет происходить, когда скопления нескольких клеток присутствуют, а не при полной диссоциации достигается. Наоборот, underdigestion приведет к снижению чистоты после Перколла разделения. При надлежащей точки пищеварения была достигнута, местом пробирку на льду, чтобы остановить активность коллагеназы.
2. Передайте решение через ячейку сито, чтобы удалить непереваренной материалов, а также центрифуги при 500 х г в течение 5 минут.
3. Чтобы вымыть, удалитьсупернатант и ресуспендирования клеток в 10 мл промывочного раствора. Центрифуга при 500 х г в течение 5 минут.
4. Во время центрифугирования, подготовить Перколла решение путем смешивания 9,6 мл Перколла, 13,4 мл промывочного раствора и 1,1 мл 10х среды 199 в 50 мл трубки подходит для высокоскоростного центрифугирования.
5. Удалите супернатант и ресуспендируют осадок клеток в 2 мл промывочного раствора.
6. Добавить клетки Перколла решение и центрифуги @ 30000 х г в течение 30 минут при 4 ° C.
7. Убрать трубы от центрифуги, не нарушая градиент. Для визуализации градиента, место трубку перед ярким источником света. Найдите трофобласта группы (рис. 2), и аспирации с пипеткой, стараясь не нарушить красная полоса клеток крови ниже. Объем трофобласта группа будет 5-8 мл.
8. Передача клетки трофобласта в 50 мл коническую трубку. Добавить мыть решения общим объемом 45мл.
9. Центрифуга при 500 х г в течение 5 минут. Удалите супернатант и ресуспендируют в культуре медицинскиемкм (NCTC-135). Клетки можно культивировать на тонком слое матригель или пластиковой культуре ткани при температуре 37 ° C и 5% CO _2. В день 10,5, каждая плацента дает примерно 50000 живых клеток, из которых 80-90% будут цитокератин положительные.

3. Анализ трофобласта вторжения

1. Добавить 1-2 мл культуральной среды (NCTC-135) для каждой камеры матригель и инкубировать при 37 ° С, 5% CO ₂ в течение 30-90 мин.
2. Удалите среду и добавьте 1,5 мл х 10 ⁵ свежевыделенных клеток в 2 мл средней верхней палаты. Добавить 1 мл среды в нижнюю палату для покрытия нижней поверхности мембраны.
3. Культуры клеток в вставок в течение 18-24 часов.
4. Scrape клеток и матригель с использованием вставки пены тампоном.
5. Промойте верхнюю и нижнюю палаты в 2 мл PBS.
6. Исправить в течение 5 мин в 1 мл 4% параформальдегидом в PBS.
7. Пятно, заполнив нижнюю палату с 400 мкл DAPI (300 Нм) и инкубировать в течение 30 мин.
8. Вымойте три раза коротко PBS.
9. Добавить 10 мкл капли монтажа среднего (50% глицерина в PBS), чтобы скользить. Используя щипцы, лежал мембраны на каплю. Добавить еще 10 мкл каплю среды, то покровное тщательно.
10. Фотографии и подсчет клеток. Будьте уверены, чтобы ориентироваться мембраны (как правило ячейки стороной вверх или сотовый стороной вниз) на микроскопе используется. Изображение J программного обеспечения (Национальные Институты Здоровья) включает в себя функцию ручной подсчет, которые могут быть использованы для этой цели, так же как Adobe Photoshop или ручной счетчик.

4. Представитель Результаты

Рисунок 1. Препарирование мышей плаценты. (А) матка удаляется путем разрезания вдоль яйцеводы (желтый), а также mesometrial поверхности, так и на шейку матки (внизу). Индивидуальные оплодотворенные затем могут быть разделены путем разрезания ножницами, как показано на рисунке. (Б) матки стены удаляются, поставив два пинцета в разрез матки поверхности, и разрыв по борьбе с mesometrial стороны, у плода и от плаценты. (С) плаценты затем выделяют путем захвата пинцетом и раздвижные другой между плацентой и ткани матки. Пуповины и другие внеэмбриональной мембраны могут быть отделены от плаценты.

Рисунок 2. Percoll разделения клетки трофобласта. После центрифугирования три основные группы будет видно, как показано в мультфильме слева, и фотография справа. Верхняя полоса содержит продукты распада клеток и фибробластов и будет наиболее очевидной. Жесткие (красная) полоса в нижней содержащих красные кровяные клетки будут видны чуть ниже диффузная полоса трофобласта. Сотовые агрегатов, вероятно, видели в трофобласта группа, как и в двух показана только слева от стрелки на фотографии.

ove_content ">
Рисунок 3. Инвазивные клетки трофобласта (белая стрелка) будет проходить через слой матригель и поры мембраны, появляясь на нижней поверхности мембраны. Поры видны также (черная стрелка). Число клеток на всей поверхности мембраны или представитель площадь образца может быть подсчитаны. Черно-белое изображение люминесцентных DAPI окрашивание ядер была обращена к улучшению визуализации клеток.

Клетки Рисунок 4. Трофобласта могут быть идентифицированы, и чистота изолированная популяция оценивается, по иммунным для цитокератин 7 (центр, пурпурный). Клетки контрастно DAPI (верх, синий). Объединенные изображение, внизу.

Discussion

В этом видео мы покажем, выделение клеток трофобласта от мыши плаценты. Затем мы показываем в пробирке для анализа трофобласта вторжения. Используя эту процедуру, в значительной степени, но не полностью, чистый населения клетки трофобласта могут быть получены. Если в дальнейшем чистоты требуется, магнитных гранул разделения или проточной цитометрии могут быть выполнены, как это было описано для первичных человеческих клеток трофобласта. Надлежащую длину шага коллагеназы диссоциации должны быть определены с каждым экспериментом, и будет научился с опытом. За пищеварения будет серьезно уменьшить восстановления клеток, тогда как при пищеварения может привести к снижению чистоты, а также снижение числа. Хотя мы показываем использованием коммерчески подготовленные камеры матригель вторжения, они также могут быть получены путем добавления к матригель без покрытия Transwell камеры в нужной толщины.