Isolement des cellules trophoblastiques primaires de souris et le test invasion trophoblastique

Summary

Dans ce protocole, nous décrivons la dissection du placenta de la souris sur la grossesse D10.5, suivie de l'isolement des cellules trophoblastiques en utilisant un gradient de Percoll. Nous avons ensuite démontrer l'utilisation des cellules isolées dans un essai invasion matrigel.

Abstract

Le placenta est responsable du transport des nutriments, des gaz et des facteurs de croissance pour le fœtus, ainsi que l'élimination des déchets. Ainsi, des défauts dans le développement placentaire avoir des conséquences importantes pour le fœtus et la mère, et sont une cause majeure de la létalité embryonnaire. Le type cellulaire majeur de la portion fœtale du placenta est le trophoblaste. Des cellules primaires de souris trophoblastes placentaires sont un outil utile pour étudier le développement normal et anormal du placenta, et contrairement à des lignées cellulaires, peuvent être isolés et utilisés pour étudier trophoblaste à des étapes spécifiques de la grossesse. En outre, des cultures primaires de trophoblaste de souris transgéniques peuvent être utilisées pour étudier le rôle des gènes particuliers dans les cellules placentaires. Le protocole présenté ici est basée sur la description de Thordarson et al. ^1, dans lequel un gradient de Percoll est utilisé pour obtenir une population de cellules du trophoblaste relativement pur de placenta de souris isolées. Il est semblable à l'utiliser plus largementméthodes d pour ^2-3 trophoblaste humain isolement cellulaire. Pureté peut être évaluée par coloration immunocytochimique des cellules isolées pour la cytokératine 7 ^4. Ici, les cellules isolées sont ensuite analysés en utilisant un test invasion matrigel trophoblaste invasif pour évaluer in vitro ^5-6. Les cellules envahies sont analysés par immunocytochimie et colorées pour le comptage.

Protocol

1. Dissection du placenta de souris

1. Mettre en place paires d'accouplement de souris.
2. Sur chacun des jours suivants, vérifiez la présence d'un bouchon de copulation. Le jour où une prise est détecté est considéré comme 0,5 jours après le coït (dpc) ^7.
3. Placentas peuvent être perçues au stade de la grossesse désirée, avec une dissection propre du placenta début possible avec le développement du placenta mature sur d 10.5. Ici, nous démontrons 14,5 dpc. Lors des volumes donnés, 40-60 placentas de 10,5 dpc, et 10-20 placentas sur 14,5 dpc permettra d'obtenir une couche de trophoblaste clairement visible cellule.
4. Euthanasier la souris enceintes, et enlever l'utérus, la coupe au niveau du col et le long de la mésomètre.
5. Avec des ciseaux pointus, couper entre chaque conceptus (figure 1A).
6. L'utilisation de deux paires de pinces, saisir la paroi utérine à l'arête de coupe, et tirer, enlever le myomètre (figure 1B) . Une paire dentelée, pince modérément fines (courbe ou droite) plus une paire pinces très fines (# 5, par exemple) est recommandée.
7. En face du placenta, ouvrez la caduque avec des pinces ou des ciseaux, ce qui expose le placenta. Saisir le tissu utérin avec une paire pince, faites glisser une autre pince sous le placenta se séparer (figure 1C). Si nécessaire, le fœtus séparé et membranes fœtales à partir du placenta. Il n'est pas possible d'enlever tous les tissus déciduale par dissection sans perdre également le tissu placentaire, mais d'autres tissus déciduale (pâle) peut être enlevé de la surface du placenta par un léger gommage avec une pince. Nous nous appuierons sur le gradient de Percoll une purification supplémentaire.
8. Placez chaque placenta disséqué dans 25 ml de glace froide tampon de dissociation dans un tube conique de 50 ml jusqu'à ce que toutes les dissections sont terminées. Aux stades ultérieurs, émincer grossièrement tissu placentaire avec des ciseaux ou une lame de rasoir avant de les transférer dans la mémoire tampon de dissociation.

tle "> 2. Isolement des cellules trophoblastiques

1. Tube à bouchon conique sans serrer et placer dans un bain marie à 37 ° C pendant 45-60 minutes. Mélanger la solution de dissociation vigoureusement à la pipette environ toutes les 10 min. Le temps de digestion totale doivent être étroitement surveillés et il faudra probablement quelques essais et erreurs pour parvenir au recouvrement optimal des cellules. Les tissus doivent être en mesure de passer à travers une pipette de 10 ml, mais des morceaux visibles de tissu restera. Digestion excessive entraînera dans la survie cellulaire pauvres et l'efficacité de placage. La survie des cellules et une efficacité optimales plaquage se produit lorsque des amas de quelques cellules sont présents, plutôt que lorsque la dissociation complète est réalisée. A l'inverse, underdigestion mènera à la pureté réduite après la séparation percoll. Lorsque le point de digestion a été atteint, tube de place sur la glace pour arrêter l'activité de la collagénase.
2. Faire passer la solution à travers un tamis cellulaire pour éliminer les matières non digérées, et centrifuger à 500 xg pendant 5 minutes.
3. Pour laver, retirercellules surnageant et remettre en suspension dans 10 ml de solution de lavage. Centrifuger à 500 xg pendant 5 minutes.
4. Lors de la centrifugation, préparer la solution percoll en mélangeant 9,6 ml percoll, 13,4 ml de solution de lavage et de 1,1 ml de milieu 10x 199 dans un tube de 50 ml appropriée pour centrifugation à grande vitesse.
5. Retirez la cellule surnageant et resuspendre le culot dans 2 ml de solution de lavage.
6. Ajouter à cellules Percoll solution et centrifuger @ 30000 xg pendant 30 minutes à 4 ° C.
7. Retirer le tube de centrifugeuse sans déranger le gradient. Pour visualiser le tube de gradient lieu, devant une source de lumière vive. Repérez la bande trophoblaste (figure 2), et aspirer avec une pipette, en prenant soin de ne pas déranger la bande de globules rouges ci-dessous. Volume de la bande trophoblaste sera 5-8 ml.
8. Transfert cellules trophoblastiques dans un tube conique de 50 ml. Ajouter la solution de lavage pour un volume total de 45 ml.
9. Centrifuger à 500 xg pendant 5 minutes. Retirer le surnageant et remettre en suspension dans la culture médium (NCTC-135). Les cellules peuvent être cultivées sur couche mince ou en plastique matrigel culture de tissus à 37 ° C et 5% de CO _2. Au jour 10.5, chaque placenta donne environ 50.000 cellules vivantes, dont 80-90% sont cytokératine positive.

3. Essai invasion trophoblastique

1. Ajouter 1-2 ml du milieu de culture (NCTC-135) à chaque chambre matrigel et incuber à 37 °, 5% de CO ₂ pendant 30-90 min.
2. Retirer moyen et ajouter 1,5 ml x 10 ⁵ cellules fraîchement isolées en milieu 2ml à la chambre supérieure. Ajouter 1 ml de milieu de la chambre basse pour couvrir la surface inférieure membrane.
3. Cellules en culture dans des inserts pendant 18-24 heures.
4. Gratter les cellules et matrigel de l'insert à l'aide d'un écouvillon en mousse.
5. Rincer le haut et le bas de la chambre à 2 ml de PBS.
6. Fixer pendant 5 min dans 1 ml de paraformaldéhyde 4% dans du PBS.
7. Colorer en remplissant la chambre basse avec 400 pl DAPI (300 nm) et incuber pendant 30 min.
8. Laver trois fois brièvement dans du PBS.
9. Ajouter une chute de 10 pi de milieu de montage (glycérol à 50% dans du PBS) à glisser. En utilisant des pinces, poser la membrane sur la chute. Ajouter une autre baisse de 10 pi de milieu, puis lamelle avec soin.
10. Cellules et le nombre photographie. Veillez à orienter correctement la membrane (cellule vers le haut ou de la cellule vers le bas) pour le microscope utilisé. Image J logiciels (National Institutes of Health) comporte une fonction de comptage manuel qui peut être utilisé à cette fin, tout comme Adobe Photoshop ou un compteur manuel.

4. Les résultats représentatifs

Figure 1. Dissection du placenta de souris. (A) L'utérus est enlevé par une coupe suivant les oviductes (jaune), le long de la surface mesometrial, et au col de l'utérus (partie inférieure). Conceptus individuels peuvent ensuite être séparés en coupant avec des ciseaux comme indiqué. (B) Le utérine paroi est éliminé en plaçant deux pinces à la surface de coupe de l'utérus, et à la déchirure le long de la face anti-mesometrial, à proximité du foetus et à distance du placenta. (C) Le placenta est ensuite isolé par préhension avec une pince coulissante et une autre entre le placenta et le tissu utérin. Le cordon ombilical et les membranes extra-embryonnaires d'autres peuvent ensuite être séparés du placenta.

Figure 2. Percoll séparation des cellules trophoblastiques. Après centrifugation, trois bandes majeures sera visible comme indiqué dans le dessin animé à gauche, et la photo à droite. La bande supérieure contient des débris cellulaires et des fibroblastes et sera le plus apparent. Une serré (rouge) près de la bande de fond contenant des globules rouges sera visible juste en dessous de la bande trophoblaste diffus. Agrégats cellulaires seront probablement vu dans la bande de trophoblaste, comme dans les deux montré juste à gauche de la flèche sur la photo.

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La figure 3. Cellules trophoblastiques invasives (flèche blanche) passe à travers la couche de Matrigel et les pores de la membrane, apparaissant sur ​​la surface inférieure de la membrane. Les pores sont également visibles (flèche noire). Le nombre de cellules sur la surface de la membrane entière ou une zone échantillon représentatif peut être compté. Une image en niveaux de gris de fluorescence DAPI nucléaire a été inversé pour améliorer la visualisation des cellules.

Cellules trophoblastiques Figure 4. Peut être identifiée, et la pureté de la population isolée évalué par immunocoloration pour la cytokératine 7 (centre, magenta). Les cellules sont DAPI (en haut, bleu). Fusionnée image de fond.

Discussion

Dans cette vidéo, nous démontrons l'isolement de cellules trophoblastiques du placenta de souris. Nous montrons ensuite un test in vitro pour l'invasion du trophoblaste. Grâce à cette procédure, une grande partie, mais pas entièrement, la population pure de cellules trophoblastiques peuvent être obtenues. Si la pureté supplémentaire est nécessaire, de séparation du talon magnétique ou cytométrie en flux peut être réalisée, comme cela a été décrit pour les cellules trophoblastiques primaires de l'homme. La bonne longueur de l'étape de dissociation de la collagénase doit être déterminée par chaque expérience, et sera appris avec l'expérience. Au cours de digestion va fortement limiter la récupération des cellules, alors que la sous-digestion peut conduire à la pureté réduite, ainsi que les numéros de réduction. Bien que nous montrons l'utilisation de préparations commerciales de chambres invasion matrigel, ils peuvent également être préparés par addition de matrigel non couchés chambres transwell à l'épaisseur désirée.