Summary
इस प्रोटोकॉल में, हम d10.5 गर्भावस्था, ट्रोफोब्लास्ट एक Percoll ढाल का उपयोग कोशिकाओं के अलगाव के बाद पर माउस से अपरा के विच्छेदन का वर्णन. हम तो एक Matrigel आक्रमण परख में अलग कोशिकाओं के उपयोग के प्रदर्शन.
Abstract
नाल भ्रूण के लिए परिवहन, पोषक तत्वों, गैस, और वृद्धि कारकों के रूप में के रूप में अच्छी तरह से कचरे के उन्मूलन के लिए जिम्मेदार है. इस प्रकार, placental विकास में दोष भ्रूण और माँ के लिए महत्वपूर्ण परिणाम है, और भ्रूण मारक का एक प्रमुख कारण हैं. नाल के भ्रूण भाग के प्रमुख सेल प्रकार ट्रोफोब्लास्ट है. प्राथमिक माउस अपरा ट्रोफोब्लास्ट कोशिकाओं सामान्य और असामान्य placental विकास के अध्ययन के लिए एक उपयोगी उपकरण हैं, और सेल लाइनों के विपरीत है और अलग गर्भावस्था के विशिष्ट चरणों में ट्रोफोब्लास्ट का अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. इसके अलावा, ट्रांसजेनिक चूहों से ट्रोफोब्लास्ट की प्राथमिक संस्कृतियों placental कोशिकाओं में विशेष जीन की भूमिका का अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. यहाँ प्रस्तुत प्रोटोकॉल द्वारा Thordarson एट अल विवरण पर आधारित है. 1, जिसमें एक percoll ढाल करने के लिए पृथक माउस placentas से एक अपेक्षाकृत शुद्ध ट्रोफोब्लास्ट सेल की आबादी को प्राप्त करने के लिए प्रयोग किया जाता है. यह अधिक व्यापक रूप से उपयोग करने के लिए समान हैमानव ट्रोफोब्लास्ट सेल अलगाव 2-3 के लिए विकास के तरीकों. पवित्रता 7 cytokeratin 4 के लिए अलग कक्षों की immunocytochemical धुंधला हो जाना द्वारा मूल्यांकन किया जा सकता है. यहाँ, अलग कक्षों तो एक Matrigel आक्रमण परख का उपयोग करने के लिए इन विट्रो 5-6 में ट्रोफोब्लास्ट invasiveness का आकलन विश्लेषण कर रहे हैं. कोशिकाओं पर आक्रमण और गिनती के लिए immunocytochemistry दाग से विश्लेषण कर रहे हैं.
Protocol
1. माउस नाल के विच्छेदन
- चूहों के संभोग जोड़े सेट.
- बाद के दिनों में से प्रत्येक पर, एक मैथुनविषयक प्लग की उपस्थिति के लिए जाँच करें. जो दिन में एक प्लग का पता चला है 0.5 (डीपीसी) के बाद सहवास 7 दिन माना जाता है.
- Placentas गर्भावस्था के वांछित स्तर पर एकत्र किया जा सकता है, घ 10.5 पर परिपक्व नाल का विकास के साथ नाल संभव शुरुआत की एक साफ विच्छेदन के साथ. यहाँ, हम 14.5 डीपीसी को प्रदर्शित करता है. मात्रा में दिया है, 10.5 डीपीसी पर 40-60 placentas, और 14.5 डीपीसी पर 10-20 placentas एक स्पष्ट रूप से दिखाई दे ट्रोफोब्लास्ट सेल परत निकलेगा.
- गर्भवती माउस euthanize, और गर्भाशय निकालना, गर्भाशय ग्रीवा में काटने, और mesometrium साथ.
- तेज कैंची, प्रत्येक Conceptus (चित्रा 1 ए) के बीच में कटौती का उपयोग करना.
- संदंश के दो जोड़े का उपयोग, कट किनारे पर गर्भाशय की दीवार समझ, और अलग खींच, myometrium (चित्रा 1 बी) को हटाने . एक जोड़ी दाँतेदार, मध्यम ठीक संदंश (घुमावदार या सीधे) प्लस एक जोड़ी बहुत ठीक संदंश (# 5, उदाहरण के लिए) की सिफारिश की है.
- नाल सामने, संदंश या कैंची से पत्या खोलने के लिए, नाल को उजागर. एक संदंश जोड़ी के साथ गर्भाशय ऊतक लोभी, नाल अलग (चित्रा 1C) के नीचे एक और संदंश स्लाइड. यदि आवश्यक हो, अलग और नाल से भ्रूण भ्रूण झिल्ली. यह भी placental ऊतक को खोने के बिना विच्छेदन द्वारा सभी decidual के ऊतक को हटाने के लिए संभव नहीं है, लेकिन अतिरिक्त decidual ऊतकों (पीला) धीरे संदंश के साथ छीलने से नाल की सतह से हटाया जा सकता है. हम आगे शोधन के लिए Percoll ढाल पर निर्भर करेगा.
- 25 मिलीलीटर की एक 50 मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूब में बर्फ ठंड हदबंदी बफर में प्रत्येक dissected नाल रखें जब तक सभी dissections को पूरा कर रहे हैं. बाद के चरणों में, coarsely कैंची या रेजर ब्लेड के साथ placental ऊतक पहले बोटी - बोटी करना हदबंदी बफर में स्थानांतरित.
- शिथिल शंक्वाकार टोपी और 45-60 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस स्नान में ट्यूब जगह. लगभग हर 10 मिनट pipetting द्वारा पृथक्करण समाधान सख्ती मिश्रण. कुल पाचन समय बारीकी से निगरानी की जानी चाहिए और संभावना कुछ परीक्षण और त्रुटि इष्टतम सेल वसूली को प्राप्त करने की आवश्यकता होगी. ऊतकों एक 10 मिलीलीटर pipet के माध्यम से पारित किया जा करने में सक्षम होना चाहिए, लेकिन ऊतक के टुकड़े दिखाई रहेगा. Overdigestion गरीब सेल अस्तित्व और चढ़ाना दक्षता में परिणाम देगा. इष्टतम सेल अस्तित्व और चढ़ाना दक्षता जब कुछ कोशिकाओं के clumps मौजूद हैं बजाय जब पूरा हदबंदी हासिल है, हो जाएगा. इसके विपरीत, underdigestion percoll जुदाई के बाद कम शुद्धता के लिए नेतृत्व करेंगे. जब उचित पाचन बिंदु तक पहुँच गया है, बर्फ पर जगह ट्यूब कोलैजिनेज गतिविधि को रोकने के लिए.
- एक सेल झरनी के माध्यम से पचाया नहीं सामग्री हटाने, और 5 मिनट के लिए 500 XG अपकेंद्रित्र समाधान दर्रा.
- धोने के लिए निकालने के लिए,10 मिलीलीटर धोने समाधान में सतह पर तैरनेवाला और resuspend कोशिकाओं. 5 मिनट के लिए 500 XG अपकेंद्रित्र.
- अपकेन्द्रण के दौरान, 9.6 मिलीलीटर percoll, 13.4 मिलीलीटर धोने के समाधान और एक 50 मिलीलीटर ट्यूब में 1.1 मिलीलीटर 10x 199 मध्यम उच्च गति centrifugation के लिए उपयुक्त मिश्रण से percoll समाधान तैयार.
- 2 एमएल धोने समाधान में सतह पर तैरनेवाला और resuspend सेल गोली निकालें.
- कोशिकाओं को जोड़ें समाधान percoll और 4 पर 30 मिनट के लिए @ 30,000 XG अपकेंद्रित्र डिग्री सेल्सियस
- अपकेंद्रित्र से ढाल को परेशान करने के बिना ट्यूब निकालें. एक उज्ज्वल प्रकाश स्रोत के सामने ढाल, जगह ट्यूब कल्पना. ट्रोफोब्लास्ट बैंड (2 चित्रा) जानें, और एक pipet साथ aspirate, देखभाल करने के लिए नहीं लाल रक्त कोशिका बैंड नीचे परेशान. ट्रोफोब्लास्ट बैंड का आयतन 5-8 मिलीलीटर होगा.
- एक 50 मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूब ट्रोफोब्लास्ट कोशिकाओं स्थानांतरण. 45ml की कुल मात्रा का हल धो जोड़ें.
- 5 मिनट के लिए 500 XG अपकेंद्रित्र. तैरनेवाला निकालें, और संस्कृति दवा में resuspendउम (NCTC - 135). कोशिकाओं को 37 डिग्री सेल्सियस और 5% सीओ 2 पर पतली परत Matrigel या टिशू कल्चर प्लास्टिक पर संवर्धित किया जा सकता है. दिन 10.5, प्रत्येक नाल लगभग 50,000 जीवित कोशिकाओं, जिनमें से 80-90% सकारात्मक cytokeratin पैदावार.
3. ट्रोफोब्लास्ट आक्रमण परख
- प्रत्येक Matrigel चैम्बर और सेते 37 में 1-2 मिलीलीटर संस्कृति के माध्यम (NCTC 135) जोड़ें °, 30-90 मिनट के लिए 5% सीओ 2.
- निकालें मध्यम, और ऊपरी सदन 2ml माध्यम में 1.5 मिलीलीटर x 10 5 हौसले से अलग कक्षों जोड़ने. निचले सदन के लिए 1 मिलीग्राम मध्यम जोड़ें कम झिल्ली सतह को कवर करने के लिए.
- 18-24 घंटे के लिए आवेषण में संस्कृति कोशिकाओं.
- परिमार्जन और कोशिकाओं Matrigel एक फोम झाड़ू का उपयोग डालने से.
- शीर्ष और 2 मिलीलीटर पीबीएस में चैम्बर के नीचे कुल्ला.
- 1 मिलीलीटर पीबीएस में 4% paraformaldehyde में 5 मिनट के लिए ठीक है.
- 400 μl DAPI (300nm) के साथ निचले सदन द्वारा भरने दाग और 30 मिनट के लिए सेते हैं.
- पीबीएस में तीन बार संक्षिप्त धो.
- बढ़ते मध्यम (पीबीएस में 50% ग्लिसरॉल) स्लाइड के एक 10 μl बूंद जोड़ें. संदंश का प्रयोग, ड्रॉप पर झिल्ली करना. माध्यम की एक और 10 μl बूंद जोड़ें, तो ध्यान coverslip.
- तस्वीर और गिनती कोशिकाओं. पूरबी उचित खुर्दबीन के लिए इस्तेमाल किया जा रहा है झिल्ली (सेल की ओर अप या सेल की ओर नीचे) को यकीन है कि. छवि जम्मू सॉफ्टवेयर (राष्ट्रीय स्वास्थ्य संस्थान) एक मैनुअल गिनती विशेषता यह है कि इस उद्देश्य के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है शामिल है, एडोब या एक मैनुअल काउंटर Photoshop के रूप में.
4. प्रतिनिधि परिणाम
चित्रा 1 माउस नाल के विच्छेदन. (क) oviducts साथ काटने (पीला) सतह के साथ mesometrial, गर्भाशय निकाल दिया जाता है, और गर्भाशय ग्रीवा (नीचे) पर. व्यक्तिगत conceptuses तो कैंची के रूप में दिखाया गया के साथ काटने के द्वारा अलग किया जा सकता है. (ख) गर्भाशय दीवार कट गर्भाशय सतह में दो संदंश रखने, और विरोधी mesometrial पक्ष के साथ भ्रूण के पास और नाल से दूर, फाड़ द्वारा हटा दिया जाता है. (ग) नाल तो एक संदंश के साथ लोभी और नाल और गर्भाशय ऊतक के बीच एक और फिसलने से अलग है. नाल और अन्य extraembryonic झिल्ली फिर प्लेसेंटा से अलग किया जा सकता है.
चित्रा 2 ट्रोफोब्लास्ट कोशिकाओं के Percoll जुदाई. Centrifugation के बाद, तीन प्रमुख बैंड दिखाई के रूप में छोड़ दिया पर कार्टून में दिखाया गया हो सकता है, और सही पर तस्वीर. ऊपरी बैंड सेलुलर मलबे और fibroblasts होता है और सबसे अधिक स्पष्ट हो जाएगा. लाल रक्त कोशिकाओं से युक्त नीचे के निकट एक तंग बैंड (लाल) फैलाना ट्रोफोब्लास्ट बैंड नीचे दिखाई देता होगा. सेल समुच्चय संभावना ट्रोफोब्लास्ट बैंड में देखा, दो के रूप में सिर्फ तस्वीर में तीर की बाईं दिखाया.
चित्रा 3 इनवेसिव ट्रोफोब्लास्ट कोशिकाओं (सफेद तीर). Matrigel परत और झिल्ली pores के माध्यम से गुजरती हैं, झिल्ली के नीचे की सतह पर दिखने. pores भी दिखाई दे रहे हैं (काला arrowhead). पूरे झिल्ली सतह या एक प्रतिनिधि नमूने क्षेत्र पर कोशिकाओं की संख्या में गिना जा सकता है. फ्लोरोसेंट DAPI परमाणु धुंधला हो जाना का एक स्केल छवि कोशिकाओं के दृश्य में सुधार करने के लिए उलटा गया है.
चित्रा 4. ट्रोफोब्लास्ट कोशिकाओं, पहचाना जा सकता है और अलग आबादी की शुद्धता cytokeratin 7 (केंद्र, मैजंटा) के लिए immunostaining द्वारा मूल्यांकन. कोशिकाओं DAPI (ऊपर नीला) के साथ counterstained हैं. विलय छवि नीचे.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
इस वीडियो में, हम माउस नाल से ट्रोफोब्लास्ट कोशिकाओं के अलगाव को प्रदर्शित करता है. हम तो ट्रोफोब्लास्ट आक्रमण के लिए एक में इन विट्रो परख दिखाते हैं. इस प्रक्रिया का उपयोग कर, एक बड़े पैमाने पर है, लेकिन पूरी तरह से नहीं है, ट्रोफोब्लास्ट कोशिकाओं का शुद्ध जनसंख्या प्राप्त किया जा सकता है. यदि आगे शुद्धता की आवश्यकता है, चुंबकीय मनका जुदाई या प्रवाह cytometry, प्रदर्शन किया जा सकता है, के रूप में प्राथमिक मानव ट्रोफोब्लास्ट कोशिकाओं के लिए वर्णित किया गया है. कोलैजिनेज हदबंदी कदम की उचित लंबाई एक प्रयोग के साथ निर्धारित किया जाना चाहिए, और अनुभव से सीखा जा जाएगा. अधिक पाचन गंभीर रूप से सेल वसूली कम हो जाएगा, जबकि पाचन के तहत कम शुद्धता, साथ ही कम संख्या को जन्म दे सकती है. हालांकि हम व्यावसायिक तौर पर तैयार Matrigel आक्रमण कक्षों का उपयोग दिखाने के लिए, वे भी इच्छित मोटाई पर uncoated transwell कक्षों Matrigel जोड़कर तैयार किया जा सकता है.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
हम खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है.
Acknowledgments
लेखकों के लिए मिसौरी शैक्षणिक सहायता केंद्र है जो इस वीडियो का उत्पादन के विश्वविद्यालय में रचनात्मक सेवाओं टीम का शुक्रिया अदा करना चाहता हूँ. यह काम Eunice कैनेडी बाल स्वास्थ्य के राष्ट्रीय संस्थानों के स्वास्थ्य एवं मानव विकास की श्राइवर नेशनल इंस्टिट्यूट ऑफ मैनेजमैंट, अनुदान HD055231 संख्या द्वारा समर्थित किया गया
References
- Thordarson, G., Folger, P., Talamantes, F. Development of a placental cell culture system for studying the control of mouse placental lactogen II secretion. Placenta. 8, 573-585 (1987).
- Petroff, M. G., Phillips, T. A., Ka, H., Pace, J. L., Hunt, J. S. Isolation and culture of term human trophoblast cells. Methods. Mol. Med. 121, 203-217 (2006).
- Kliman, H. J., Nestler, J. E., Sermasi, E., Sanger, J. M., Strauss, J. F. Purification, characterization, and in vitro differentiation of cytotrophoblasts from human term placentae. Endocrinology. 118, 1567-1582 (1986).
- Blaschitz, A., Weiss, U., Dohr, G., Desoye, G. Antibody reaction patterns in first trimester placenta: implications for trophoblast isolation and purity screening. Placenta. 21, 733-741 (2000).
- Librach, C. L. 92-kD type IV collagenase mediates invasion of human cytotrophoblasts. J. Cell. Biol. 113, 437-449 (1991).
- Schulz, L. C., Widmaier, E. P. The effect of leptin on mouse trophoblast cell invasion. Biol. Reprod. 71, 1963-1967 (2004).
- Tanaka, S., Kunath, T., Hadjantonakis, A. K., Nagy, A., Rossant, J. Promotion of trophoblast stem cell proliferation by FGF4. Science. 282, 2072-2075 (1998).
