Isolering av primära celler Mus trofoblaster och trofoblaster Invasion Assay

Summary

I detta protokoll beskriver vi dissektion av efterbörd från musen om graviditet d10.5, följt av isolering av trofoblastceller med en Percoll-gradient. Vi visar då användning av de isolerade cellerna i en Matrigel invasion assay.

Abstract

Moderkakan är ansvarig för transporten av näringsämnen, gaser och tillväxtfaktorer till fostret, liksom eliminering av avfall. Således brister i placenta utveckling har viktiga konsekvenser för fostret och modern, och är en viktig orsak till embryonal dödlighet. Den stora celltyp av fostrets del av moderkakan är trofoblaster. Primära mus placentala trofoblastceller är ett användbart verktyg för att studera normal och onormal moderkakan utveckling, och till skillnad cellinjer, kan isoleras och användas för att studera trofoblaster i vissa stadier av graviditeten. Dessutom kan primära kulturer av trofoblaster från transgena möss användas för att studera rollen av specifika gener i placentaceller. Protokollet som presenteras här är baserat på beskrivningen av Thordarson et al. ^1, i vilken en Percoll-gradient används för att erhålla en relativt ren population trofoblast cell från mus isolerade moderkakor. Det liknar mer allmänt användad metoder för mänsklig trofoblaster cellisolering ^2-3. Renhet kan bedömas genom immunocytokemisk färgning av de isolerade cellerna för cytokeratin 7 ^4. Här är de isolerade cellerna analyserades sedan med användning av en Matrigel invasion analys för att bedöma trofoblast invasivitet in vitro ^5-6. De invaderade cellerna analyseras med immuncytokemi och färgas för räkning.

Protocol

1. Dissektion av mus moderkakan

1. Ställ in passande par möss.
2. På vart och ett av de följande dagarna, kontrollera närvaron av en copulatory plugg. Den dag då en plugg upptäcks anses 0,5 dagar efter samlag (DPC) ^7.
3. Moderkakor kan samlas vid den önskade skede av graviditeten, med en ren dissektion av moderkakan möjliga börjar med utvecklingen av den mogna moderkakan på d. 10,5. Här visar vi 14,5 DPC. Vid givna volymer, kommer 40-60 moderkakor på 10,5 DPC och 10-20 moderkakor på 14,5 DPC ger en tydlig lager trofoblaster cell.
4. Avliva den gravida möss, och ta bort livmodern, skär i livmoderhalsen, och längs mesometrium.
5. Använda vassa saxar, skär mellan varje conceptus (Figur 1A).
6. Med hjälp av två par tänger, tag i livmoderväggen vid den skurna kanten, och dra isär, avlägsna myometrium (Figur 1B) . Ett par tandad, måttligt fina (krökt eller rak) tång plus ett par mycket fina pincett (# 5, till exempel) rekommenderas.
7. Mittemot moderkakan, öppna decidua med pincett eller sax, utsätta moderkakan. Gripa uterin vävnad med en pincett par, skjut annan pincett under moderkakan att separera (figur 1C). Om det behövs, separat fostret och fosterhinnorna från moderkakan. Det är inte möjligt att avlägsna all decidual vävnad genom dissektion utan också förlora placentavävnad, men ytterligare decidual vävnad (blek) kan avlägsnas från ytan av moderkakan genom att försiktigt peeling med pincett. Vi kommer att förlita sig på PercoU gradienten för ytterligare rening.
8. Placera varje dissekerade moderkakan i 25 ml iskall buffert dissociation i en 50 ml koniskt rör tills alla dissektioner är klar. I senare skeden, grovt finhacka moderkakan vävnad med sax eller rakblad före överföringen till dissociation buffert.

TLE "> 2. Isolering av trofoblastceller

1. Löst lock koniskt rör och placera det i en 37 ° C bad under 45-60 minuter. Blanda dissociationslösningen kraftigt genom pipettering ungefär var 10 minut. Den totala koktiden bör övervakas noga och kommer sannolikt att kräva några försök och misstag för att uppnå optimal cell återhämtning. Vävnader bör kunna passera genom en 10 ml pipett, men synliga bitar av vävnad kommer att kvarstå. Overdigestion kommer att resultera i dålig cellöverlevnad och utstrykningseffektivitet. Optimal cellöverlevnad och utstrykningseffektivitet kommer att uppstå när klumpar av ett fåtal celler är närvarande, snarare än när du är klar dissociation uppnås. Omvänt kommer underdigestion leder till minskad renhet efter Percoll separation. När rätt matsmältning punkt har nåtts, till plats rör på is stoppa kollagenasaktivitet.
2. Passera lösningen genom en cell sil för att avlägsna osmälta material, och centrifugera @ 500 xg under 5 minuter.
3. Att tvätta, ta bortsupernatant och återsuspendera cellerna i 10 ml tvättlösning. Centrifugera @ 500 xg under 5 minuter.
4. Under centrifugeringen, bereda PercoU lösning genom att blanda 9,6 ml Percoll, 13,4 ml tvättlösning och 1,1 ml 10x mediet 199 i en 50 ml rör lämplig för höghastighetscentrifugering.
5. Avlägsna supernatanten och återsuspendera cellpelleten i 2 ml tvättlösning.
6. Lägg celler till percoll lösning och centrifugera @ 30.000 xg under 30 minuter vid 4 ° C.
7. Ta röret från centrifugen utan att störa gradienten. För att visualisera övertoningen plats rör framför en stark ljuskälla. Leta reda på trofoblasten bandet (figur 2) och aspirera med en pipett, noga med att inte störa det röda bandet blodkroppar nedan. Volym av trofoblasten bandet blir 5-8 ml.
8. Överför trofoblastceller till en 50 ml koniskt rör. Lägg tvättlösning till en total volym av 45 ml.
9. Centrifugera @ 500 xg under 5 minuter. Avlägsna supernatanten och återsuspendera i kultur medium (NCTC-135). Celler kan odlas på tunnskikts-Matrigel eller vävnadsodlingsplast vid 37 ° C och 5% COj _2. Dag 10,5, ger varje moderkakan cirka 50.000 levande celler, av vilka 80-90% är cytokeratin positiva.

3. Trofoblast invasion analys

1. Lägg 1-2 medelhög ml kultur (NCTC-135) till varje Matrigel kammare och inkubera vid 37 °, 5% CO ₂ under 30-90 minuter.
2. Ta medium och tillsätt 1,5 ml x 10 ⁵ nyisolerade celler i 2 ml medium till övre kammaren. Tillsätt 1 ml medium till lägre kammaren för att täcka nedre membranytan.
3. Kultur celler i skär för 18-24 timmar.
4. Skrapa celler och Matrigel från insatsen med en skum svabb.
5. Skölj toppen och botten av kammaren i 2 ml PBS.
6. Fix i 5 minuter i 1 ml 4% paraformaldehyd i PBS.
7. Stain genom att fylla undre kammare med 400 pl DAPI (300 nM) och inkubera under 30 minuter.
8. Tvätta tre gånger kort i PBS.
10. Lägg en 10 pl droppe monteringsmedium (50% glycerol i PBS) för att glida. Använd pincett, lägg membran på droppe. Lägga till ytterligare 10 pl droppe medium sedan täckglas försiktigt.
11. Fotografi och räkna celler. Var noga med att orientera membranet lämpligt (cell uppåt eller cell nedåt) för mikroskop som används. Bild J programvara (National Institutes of Health) innehåller en funktion manuell räkning som kan användas för detta ändamål, liksom Adobe Photoshop eller en manuell disk.

4. Representativa resultat

Figur 1. Dissektion av musens moderkakan. (A) livmodern avlägsnas genom att skära längs äggledarna (gul), längs den mesometrial ytan, och vid livmoderhalsen (botten). Enskilda conceptuses kan sedan separeras med sax såsom visas. (B) livmoder vägg avlägsnas genom att placera två tång i den skurna ytan livmodern, och rivning längs anti-mesometrial sida, nära fostret och bort från moderkakan. (C) moderkakan därefter isoleras genom att greppa med en pincett och skjuta en annan mellan moderkakan och uterin vävnad. Navelsträng och andra extraembryonic membran kan därefter separeras från moderkakan.

Figur 2. Percoll separation av trofoblastceller. Efter centrifugering, kommer tre större band synas såsom visas i tecknad till vänster, och fotografera till höger. Det övre bandet innehåller cellrester och fibroblaster och kommer att vara mest uppenbara. En tät (röd) bandet nära botten innehållande röda blodkroppar kommer att vara synlig nedanför diffusa trofoblast bandet. Cellaggregat kommer sannolikt ses i trofoblasten bandet, som i två visade precis till vänster om pilen i bilden.

ove_content ">
Figur 3. Invasiva trofoblastceller (vit pil) kommer att passera genom Matrigel skiktet och porerna membran, som förekommer på den nedre ytan av membranet. Porerna är också synliga (svart pilspets). Antalet celler på hela membranytan eller ett representativt urval område räknas. En gråskalebild av fluorescerande DAPI nukleär färgning har inverterats att förbättra visualisering av celler.

Figur 4. Trofoblastceller kan identifieras, och renheten hos den isolerade populationen bedömas genom immunfärgning för cytokeratin 7 (centrum, magenta). Celler motfärgades med DAPI (topp, blå). Sammanslagna bilden, botten.

Discussion

I den här videon visar vi isolering av trofoblastceller från musen moderkakan. Vi visar en in vitro-analys för trofoblast invasion. Med användning av denna procedur, till stor del en, men inte helt, kan ren population av trofoblastceller erhållas. Om ytterligare renhet krävs, kan magnetiska pärlor separation eller flödescytometri utföras, såsom har beskrivits för primära humana trofoblastceller. Rätt längd på kollagenas dissociationssteget måste bestämmas med varje experiment, och kommer att lära med erfarenhet. Över-rötning kommer allvarligt att minska cell återhämtning, medan under-rötning kan leda till minskad renhet, samt minskade siffror. Även om vi visar användningen av kommersiellt framställda Matrigel invasion kammare, kan de också framställas genom att tillsätta Matrigel till obelagda transwell kamrarna vid den önskade tjockleken.