Summary
이것은 수확 가압 혈관의 내피에 백혈구 유착을 시각화하는 방법입니다. 기술은 따라서 고혈압의 pathophysiological 조건을 모방 - 대답은 200 mmHg로 intraluminal 압력을 각기 다른 전단 흐름에 따라 혈관 접착력을 공부하고 있습니다.
Abstract
전세계, 고혈압은 인구의 약 분기로보고하고 사망률 전세계를위한 최고의 바이오 메디컬 위험 요소입니다. vasculature 고혈압에 내피 기능 장애와 죽상 경화증과 같은 만성 신장 질환 2, 뇌졸중 3 심장 마비 4와 같은 다양한 질병 상태에 선도적인 증가 염증과 관련된 것입니다. atherogenesis로 이어지는 혈관 염증의 초기 단계는 내피를 통해 압연, tethering, 준수 및 leukocytes의 후속 윤회과 관련된 유착 폭포입니다. 내피에 leukocytes의 채용과 축적 그러한에서 혈관 세포 접착 분자 - 1 (VCAM - 1), 세포 세포 접착은 분자 - 1 (ICAM - 1)과 E - selectin뿐만 아니라 증가로 접착 분자의 upregulation에 의해 중재됩니다 시토킨 및 케모카인 릴리스와 반응 산소 종의 upregulation 5. 같은 정적 유착 assays으로 체외 방식의 휴대 전화 부착에 관련된 메커니즘뿐만 아니라 세포 유착 분자의 분석을 결정하는 데 도움이됩니다. 체외 연구에서 이전에 사용된 방법은 내피에 압력 급성 증가는 단핵구 유착, 6 단, 체외의 assays 많은 마찬가지로, 이러한 결과가 실시간으로 수행되지 않은 접착 분자와 염증 마커의 upregulation로 이어질 수있다는 증명 생리적 흐름 조건 하에서 않으며, 전체 혈액과 함께. 따라서, 생체내의 assays에 점점 혈관 염증 및 플라크 개발을 증명하기 위해 동물 모델로 활용하고 있습니다. Intravital 현미경 지금은 널리 백혈구 유착, 압연, 마이 그 레이션과 윤회 7-9을 평가하는 데 사용됩니다. 생체내 연구에 내피 부착하는 백혈구에 대한 압력의 효과를 결합하면 광범위한 것은 덜 수 있습니다. 한 이러한 연구는 immunohistochemistry 10을 통해 평가되었다 동맥 성장과 리모델링하지만 염증성 마커에 대한 흐름과 전단의 실시간 효과를 검사합니다. 여기 우리는 전체 혈액 관류를 사용하여 가압 그대로 혈관에 실시간으로 백혈구 유착을 기록에 대한 모델을 제시한다. 방법론은 그대로 혈관에서 백혈구 - 내피 접착 상호 작용의 실시간 분석을 가능하게 전직 생체내 선박 챔버 재관류 모델 9 수정입니다. 우리 수정 intraluminal 압력뿐만 아니라 생리 흐름 조건뿐만 아니라 압력 조건 하에서 연구에 대한 허용 최대 200 mmHg의 조작이 가능합니다. 압력 myography 시스템은 이전에 혈관 벽 및 루멘 직경 11뿐만 아니라 혈관 수축을 관찰하기 위해 입증되었습니다 동안이 실시간으로 백혈구 - 내피 상호 작용을 보여주는 이번이 처음이다. 여기 쥐가에서 수확하고 형광 현미경을 결합 맞춤 제작 흐름 실로 cannulated 경동맥 동맥을 사용하는 방법을 보여줍니다. 선박 챔버는 이미지를 배가하기 위해 짧은 작동 거리와 큰 직경의 객관적인 렌즈를 허용하는 큰 바닥 coverglass 갖추고 있습니다. 또한, 선택한 작용제 및 / 또는 antagonists가 추가로 세포 접착을 조절하는 메커니즘을 조사하기 위해 이용하실 수 있습니다. intravital 현미경을 통해이 방법의 장점은 침략적 수술에 대한 개입을 포함하지 않으며 따라서 더 높은 처리량을 얻을 수 있습니다. intravital은 체계 억제제 치료를 가능하게하는 반면이 방법은 원하는 그릇에 현지 억제제 치료의 사용을 수 있습니다.
Protocol
1. 경동맥 동맥을 분리
- CO 2 / O 2 질식을 통해 Euthanase10 주 오래된 스프 라그 돌리 쥐.
- 최소 혈관의 스트레칭을 확보 대동맥과 마음으로 엑사이스 왼쪽과 오른쪽 경동맥 동맥 일반.
- 얼음 차가운 크렙스 버퍼에서 대동맥과 심장에서 경동맥 동맥을 분리하고 닫습니다 절개를 수행합니다.
- 장착하기 전에 얼음 크렙스에 고립된 선박 보관하십시오.
약. 시간 = 45 분
2. 마중물 선박 챔버
- 37 버퍼를 통해 ° C.; carbogen 가스 (5 % CO 2 95% O 2) 일으키는 생리적 산도에서 유지 선박 챔버 플러시 크렙스 버퍼의 근위 및 말초 커넥터에서
- 튜빙을 보장하고 cannulas 완전 플러시되고 정렬됩니다.
- P1 (근위)과 P2 (말초) 트랜스 듀서를 통해 Kreb 버퍼를 플러시. 트랜스 듀서에 공기 방울을 보장하지 닫기 두드린다.
- 해당 커넥터에 트랜스 듀서를 연결하고 다시 기포가 보장되지 더 크렙스 버퍼를 플러시. 챔버에 도청 장치를 닫습니다.
약. 시간 = 15 분
3. 선박 챔버를 가압
- 압력 장비를 켜고 : 압력 서보, 압력 모니터링, 연동 펌프 (그림 1).
- 기포가 보장하지 20 mmHg (1 전화)에서 튜브를 통해 자동 실행 크렙스 버퍼에 대한 압력과 압력 서보에 연동 펌프.
- 폐쇄 P2 변환기에 튜브를 연결합니다. 압력이 안정 될 것입니다.
- 모든 거품이 다음 봉쇄 살아가기 위해 선박 실로 P2 탭을 엽니다.
- 크렙스 버퍼 (- 7 ML 5)와 함께 목욕을 입력합니다.
약. 시간 = 10 분
4. 혈관을 장착
- 각 정맥에 해부 현미경 장소 블랙 폴리에스터 넥타이 (그림 2)에서.
- 분리 cannulas과 정맥 소유자로 이동 및 마운트 P1 정맥에 ¼ 혈관 (대동맥 아치 끝). 배가 찢어하지 확인하십시오.
- 크렙스 버퍼가 가득 주사기를 사용하면 부드럽게 P1 변환기를 통해 선박 초과 혈액을 밖으로 몰아내. 챔버에 P1을 닫습니다.
- 폴리에스터 넥타이 P1의 정맥에 안전하게 들어왔습니다.
- P2 정맥에 장착을위한 cannulas / 가까이 정맥 홀더를 이동합니다.
- 선박의 마운트 말초 끝 (~ ¼ 길이) 말초 정맥에. 폴리에스터 넥타이 고정합니다.
약. 시간 = 20 분
5. 혈관을 가압
- 선박에 구부 리거나 스트레칭을 보장하지 정맥 홀더를 조정합니다.
- P1과 P2는 실로 폐쇄와 함께 설명서를 자동에서 압력 서보를 전환합니다. 10 초 이내에 압력에 지속적인 감소가 없습니다 압력 서보를 확인합니다. 있다면, 누수가 발생하고 연결 및 트랜스 듀서는 장소에서 확보해야합니다.
- 실로 자동으로 누른 다음 열기를 P2로 다시 압력 서보를 조정합니다. 현미경 수돗물이 실로 열 때 혈관이 팽창 관찰합니다.
- 수동으로 압력 서보 스위치. 10 초 이내에 압력 지속적인 감소에 다시 확인하십시오. 누설이있다면 시스템이 꽉 압력 용기에 구멍 될 가능성이있다 없습니다.
- 챔버에 자동으로 열 P1로 다시 전환합니다. 수동 설정에 대한 압력이 안정 남아 있는지 확인합니다.
- 경우 수동 설정을 증가 다이얼 2 (40 mmHg)에 아무 누출도.
- 자동으로 조정하여 현미경으로 혈관을 관찰. 필요한 경우, 수동 설정에 누출 vessel.Check에 굽힘을 보장하지 정맥 홀더를 조정합니다.
- 5.7 원하는 압력에 도달할 때까지, 3 (60 mmHg) 4 (80 mmHg)과 정도 다이얼을 증가 - 단계 5.6를 반복합니다.
약. 시간 = 15-30 분
6. 압력 용기를 잠복기
- 37 온도 컨트롤러 세트 ° C.에 연결
- 선박 챔버 욕조에 두 번째 연동 펌프 perfuse 크렙스 버퍼 (1 ML / 분)와 함께.
- 목욕 단 상단 레이어를 보장 실로 흡인기가 제거 연결합니다.
- 자동으로 설정 압력을 1 시간 동안 37 ° C에서 압력 용기를 품어.
- 압력이 주기적으로 (수동으로 전환) 유출되지 않습니다 확인하십시오.
- 다양한 약리 개입의 효과는 단순히 부화 동안 목욕하는 화합물을 추가하여 볼 수 있습니다.
약. 시간 = 1시간
7. 전체 피가 압력 용기를 Perfusing
- 배양 기간 동안 적어도 7.5 ML 인간의 전체 혈액 / 40 U의 헤파린 / ML 혈액 수집 혈관을 구하십시오. 37 50 ML 팔콘에 품어 ° C.
- 십분 t의 끝나기 전에37 그가 10 분 VybrantDil (1:1000)와 인큐베이션 레이블 혈액 ° C 어둠 속에서.
- 십분 후에 모든 거품을 삭제 주사기로 혈액을 수집하고 37 세트 열 자켓 ° C.있는 주사기 펌프에 부착
- 챔버 / 선박에 P1 변환기를 닫고 주사기 및 폐기물 튜빙을 연결합니다.
- 1000 μL / 모든 거품을 제거하기 위해 폐기물 튜브를 통해 분 정화 혈액.
- 실로 P1을 엽니다. 압력 서보 원하는 압력을 유지하기 위해 자동으로 조정합니다.
- 100 μL / 분 피를 Perfuse.
- 디지털 카메라 레코드 하나에 15 초간 perfused 선박의 두 분야, 3, 5, 7.5 및 10 분 결합 형광 현미경을 사용합니다.
- 포스트 재관류 내피 무결성 및 기능 등 myograph 및 유착 분자 발현이 더욱 염증 반응을 확인할 수 immunohistochemistry에 의해 결정될 수있는 약리 기술로 평가하실 수 있습니다.
약. 시간 = 15 분
8. 대표 결과 :
압력 챔버 설정의 구조 다이어그램은 그림 1에 표시됩니다. 형광 현미경 결과를 결합하여 디지털 카메라는 라이브 비디오 레코딩을 통해 즉시 시각 수로. 대표 영상은 leukocytes는 그들이 10 초 고정 남아있는 경우 내피에 자기편 것으로 간주되어 그림 3에서 볼 수 있습니다. 연속 루프 준수 세포에서 비디오 레코딩과 평균마다 필드로 계산하실 수 있습니다. 모두 낮은 (그림 3A)와 높은 (그림 3B) 압력이 접착력의 일부 금액을 일으킬 수 있지만 높은 intraluminal 압력 백혈구 유착에 상당한 증가를 볼 수 있습니다이도 (그림 4) 양적 증명입니다.
그림 1. Pressurised 전직의 생체내 선박 챔버의 약도. 근위 (P1) 변환기 및 선박 내에서 조작으로 혈압을 가능하게하는 말초 (P2) 트랜스 듀서에 연결된 cannulated 들어왔습니다. 재관류가 P1 변환기 및 압력 통해이 P2 변환기를 통해 유지됩니다.
그림 2. 유대와 Cannuala. 블랙 폴리에스터 넥타이는 각 정맥에 붙어 있습니다.
그림 3. 대표 영상. 80 mmHg (A) 120 mmHg에서 형광에 따라 동적 세포 접착 (빨간색 화살표) (B) 재관류 10 분 후.
그림 4. 스프 라그 돌리의 백혈구 유착 1 시간 낮은에서 보육 (80 mmHg)과 고압 (120 mmHg) 이후 동맥 경동맥. ** P <0.001로 Bonferroni 게시물 임시 테스트를 사용하여 양방향 반복 측정 ANOVA로 분석했다.
Discussion
이것은 실시간으로 가압 조건 하에서 그대로 고립 혈관의 내피에 백혈구 유착을 공부하는 수정 방법입니다. 혼자 선박 챔버의 재관류 대형 쥐 및 쥐 선박의 프로 염증성 계통의 빠른 확인이 가능합니다. 사용 압력 조작은 동적 세포 상호 작용을함으로써 더 나은 모방 - 대답은 매우 높은 생리 intraluminal 압력, 그리고 pathophysiological 조건에 낮은에서 관찰 수 있습니다. 혈관의 직경도 충분한 셀 이미징 프로그램을 사용하고 있으므로 전단 흐름과 속도가 결정되므로 조절할 수 측정할 수 있습니다.
그 myograph 기능, 욕실에 배치 약리 중재는이 모델이 기계론의와 신호 경로의 연구를 활성화 가능 실험 조건에 또 다른 차원을 추가합니다. 내피 보존이 압력 조작하는 동안 확인되지 않을 수 있지만, ACH 및 PE에 대한 답변이 게시물 재관류 9 실시하실 수 있습니다.
이것이 설치가 휴대 전화의 상호 작용하지 타악기 혈액의 흐름이나 수축기 또는 diastolic 압력의 영향에 intraluminal 압력의 효과를 보여주는 것을인지해야합니다. 백혈구 유착에 대한 급성 압력의 변화가 관찰 동안 또한,이 설정은 또한 만성 압력 효과 (즉, 배양 시간을 증가하고 만성 압력 동물 모델을 사용)를보고 활용하실 수 있습니다. 스프 라그 돌리 일반적인 경동맥 동맥이 설정에서 보여주지만 다른 변종과 종의은 정맥의 크기에 적절한 조정과 함께 사용할 수 있습니다. 실제로, 동물의 연령 및 체중은 설정가 각 선박에 대한 개별 수 있어야함을 따라서 선박의 크기에 영향을하고 있습니다하는 것이 중요합니다. 결합 조직의 닫고주의 절개는 대단히 leukocytes의 시각화를 향상시킬 수 있습니다.
Disclosures
연구 프로토콜은 알프레드 의학 연구 및 교육 프리싱트 동물 윤리위원회와 알프레드 병원 윤리위원회에 의해 승인되었습니다.
Acknowledgments
이 연구는 빅토리아 정부의 OIS 프로그램, 국민 건강과 호주 프로그램과 프로젝트 보조금의 의학 연구 협의회 (JPF 친 - 더스팅) 및 대학원 장학금 (D 미셸)에 의해 부분적으로 지원되었다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Microscope | Carl Zeiss, Inc. | SteREO Discovery V.20 | |
| PHD 2000 Syringe Pump | Harvard Apparatus | 70-2016 | |
| Digital Camera and Controller | Hamamatsu Corp. | C4742-95 | |
| Fluorescence Illumination System | Lumen Dynamics | X-Cite 120 | |
| Vessel Chamber | Living Systems Instrumentation | CH/1/SH | |
| Pressure Servo Controller and Peristaltic Pump | Living Systems Instrumentation | PS - 200 | |
| Perfusion Pressure Monitor | Living Systems Instrumentation | PM - 4 | |
| 2 x Pressure Transducer | Living Systems Instrumentation | PT - F | |
| Temperature Controller | Living Systems Instrumentation | TC-01 | |
| Peristaltic Pump | Instech Laboratories, Inc | P720 | |
| VybrantDil cell-labelling solution | Invitrogen | V-22885 | Use 1:1000 |
References
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