Summary
M-Zellen in einem spezialisierten Follikel-assoziierte Epithel Peyer-Plaques eine wichtige Rolle spielen für die Schleimhaut Immunüberwachung im Darm-assoziierten lymphatischen Gewebe. Hier beschreiben wir die Auswertungsverfahren für die bakterielle Transzytose von M-Zellen
Abstract
Das Innere unseres Darms ist mit enormen Anzahl von symbiotischer Bakterien besiedelt. Die Schleimhautoberfläche des Magen-Darm-Trakt ist ständig mit ihnen und gelegentlich, um Krankheitserreger ausgesetzt. Der Darm-assoziierten lymphatischen Gewebe (GALT) spielen eine Schlüsselrolle für die Induktion der mukosalen Immunantwort auf diese Mikroben 1, 2. Zur Initiierung der mukosalen Immunantwort, muss die Schleimhautzellen Antigene aus dem Darmlumen in das Epithel in organisierte lymphoide Follikel, wie Peyer-Plaques transportiert werden. Dieses Antigen Transzytose wird von spezialisierten epithelialen Zellen M 3, 4 vermittelt. M-Zellen sind atypische Epithelzellen, die sich aktiv phagozytieren Makromoleküle und Mikroben. Im Gegensatz zu dendritischen Zellen (DCs) und Makrophagen, die Ziel-Antigene zu Lysosomen zum Abbau, M-Zellen hauptsächlich transcytose die verinnerlichten Antigene. Diese kräftige makromolekularen Transzytose durch M-Zellen liefert Antigen auf die zugrunde liegende organisierte lymphoide Follikel eind ist vermutlich wesentlich für die Einleitung Antigen-spezifische mukosale Immunantworten. Allerdings sind die molekularen Mechanismen der Förderung dieses Antigen-Aufnahme durch M-Zellen weitgehend unbekannt. Wir haben bereits berichtet, dass Glykoprotein 2 (GP2), insbesondere auf der apikalen Plasmamembran der M-Zellen unter Enterozyten exprimiert, als transcytotic Rezeptor für eine Teilmenge von Kommensalen und pathogene Enterobakterien, darunter Escherichia coli und Salmonella enterica Serovar Typhimurium (S. typhimurium dient ), durch die Anerkennung FimH, eine Komponente des Typ-I-Pili auf der bakteriellen äußeren Membran 5. Hier stellen wir eine Methode für die Anwendung einer Maus Peyer-Patch Darmschlinge Test auf bakterielle Aufnahme durch M-Zellen zu bewerten. Diese Methode ist eine verbesserte Version der Maus Darmschlinge Assay zuvor beschriebenen 6, 7. Die verbesserte Punkte sind wie folgt: 1. Isofluran wurde als Narkotikum verwendet. 2. Etwa 1 cm ligiert Darmschlinge einschließlichIng. Peyer-Patch wurde eingerichtet. 3. Bakterien durch M-Zellen aufgenommen wurden Fluoreszenz durch Fluoreszenzmarkierung Reagenz oder durch Überexpression fluoreszierenden Proteins, wie grün fluoreszierende Protein (GFP) markiert. 4. M-Zellen in der Follikel-assoziierte Epithel Peyer-Patch wurden von insgesamt-mount immunostainig mit anti Gp2 Antikörper nachgewiesen. 5. Fluoreszierende Bakterien Transzytose von M-Zellen wurden durch konfokale mikroskopische Analyse beobachtet. Die Maus Peyer-Patch Darmschlinge Test liefern könnte die Antwort, welche Art von Kommensalen oder pathogenen Bakterien durch M-Zellen transcytosed und kann uns dazu bringen, den molekularen Mechanismus, wie mukosalen Immunsystems durch M-Zellen zu stimulieren verstehen.
Protocol
1. Vorbereitung von Bakterienzellen
- Streak Glycerin gefüllt fluoreszierende Bakterien (z. B. GFP-exprimierenden S. typhimurium) auf LB-Agar-Platte mit 100 ug / ml Ampicillin.
- Kultur einer einzelnen Kolonie von LB-Agar über Nacht in 2 ml der neuen LB-Medium.
- 0,5 ml Bakterienkultur zu 4,5 ml der neuen LB-Medium und Inkubation bis optischen Dichte von 1,0 bei 600 nm erreicht ist.
- Ernte Bakterienzellen durch Zentrifugation (3.000 xg, 5 min, 4 ° C).
- Überstand verwerfen und waschen zweimal mit 5,0 ml sterilem Phosphatpuffer (PBS).
- Resuspendieren Bakterienpellet mit 5 ml PBS, und verwenden Sie 50 ul der Suspension, die etwa 10 7 koloniebildenden Einheit (KBE) als Inokulum.
- Bei Verwendung von fluoreszenzmarkierten Bakterien wurden die Bakterienzellen durch Fluoreszenzmarkierung Reagenz nach Standard-Protokoll bezeichnet.
2. Anesthesia
- Füllen Sie eine kleine Kunststoff-Box (10 x 10 x 5 cm) mit 5% (v / v) verdampft Isofluran mit Luft gemischt (Flussrate: 200 ml / min).
- Anesthetize acht bis sechzehn schwachen alten männlichen oder weiblichen Mäusen in der Box.
- Bewegen Sie die Maus zu einem Seziertisch nach der Narkose.
- Kontinuierlich betäuben die Mäuse um 2% (v / v) verdampft Isofluran mit Luft gemischt (Flussrate: 200 ml / min) (Abbildung 1). Dies ist ein Terminal-Verfahren.
3. Ligiert Peyer-Patch Loop-Test
- Incise 1cm der Bauchhaut und dann schneiden Sie die Bauch-Peritoneum einer narkotisierten Maus und nehmen Sie den Dünndarm mit der Peyer-Patch.
- Ligieren des Darms mit Nähgarn, kümmert sich um Blutgefäße zu vermeiden. Hinweis: nur binden einen Seite des Darmes, und lassen Sie die andere Seite zu verlieren.
- Inject 50 ul Bakteriensuspension oder PBS (Kontrolle) mit einer Spritze in ligiert Peyer-Patch-Schleife auf dem losen side des Darms (Abbildung 2).
- Bind Losseite, und schließen Sie die Maus den Bauch mit einem Clip.
- Nach 1 h, entfernen Sie die ligiert Peyer-Patch-Schleife, und einschläfern mit der Maus durch Genickbruch.
- Excise Peyer-Patch von ligiert Peyer-Patch-Schleife.
- Flashing der apikalen Seite der Peyer-Patch von 1 ml PBS mit der Verwendung von Spritzen an einer Nadel, um überschüssige Schleimhaut Flüssigkeit und Bakterien zu entfernen. Flashen der Peyer-Patch weitere zwei Male.
4. Whole mount-Färbung und konfokale mikroskopische Analyse der Peyer-Patch
- Fix Peyer-Patch in BD Cytofix / Cytoperm Lösung auf Eis für 1 Stunde.
- Wash Peyer-Patch dreimal mit 1 ml BD Perm / Wash-Puffer für 5 min und dann Block mit 1 ml Blocking-Puffer mit 0,1% (w / v) Saponin, 0,2% (w / v) BSA in PBS für 30 min auf Eis.
- Add 200-fach verdünnt Anti-Maus-GP2 monoklonaler Antikörper (5 pg / ml) auf die Probe zu erkennenM-Zellen.
- Inkubieren für 2 Stunden bei Raumtemperatur oder über Nacht bei 4 ° C.
- Wash dreimal mit 1 ml kaltem PBS, fügen Sie dann 200-fach verdünnt Anti-Ratte-IgG-Antikörper, konjugiert mit DyLight549 (20 ug / ml) auf die Probe.
- Inkubieren Sie die Probe auf Eis für 2 Stunden.
- Wash dreimal mit 1 ml kaltem PBS, dann fügen Sie 50-fach verdünnt Alexa 633 konjugierten Phalloidin auf die Probe zu F-Aktin zu erkennen.
- Inkubieren auf Eis für 2 Stunden.
- Wash leicht mit 1 ml kaltem PBS. Dann legen Sie drei Minuten vor vier Stücke runden Deckglas auf einem Objektträger, und betten Sie die Proben in eine 30% ige Glycerin-Lösung in PBS auf der Folie (Abbildung 3).
- Beachten Proben mit einer DM-IRE2 konfokalen Laser Scanning Mikroskop oder einem DeltaVision Restoration Dekonvolution Mikroskop.
5. Repräsentative Ergebnisse:
Die Probe beispielsweise einer Maus ligiert Peyer-Patch Loop-Test mit GFP-S. Typhimurium wurde mit einem DeltaVision Restoration Dekonvolution Mikroskop (Abbildung 4) beobachtet. GFP-S. typhimurium wird durch GP2 + M-Zellen transcytosed. Eine Maus Peyer-Patch Darmschlinge Assay identifizieren kann die Art der Kommensalen oder pathogene Bakterien, die durch M-Zellen transcytosed werden kann.
Abbildung 1. Anesthesia von Mäusen unter verdampft Isofluran Zustand. Verdampft Isofluran wurde von einer Anästhesie-dedicated Gerät (links) geliefert.
Abbildung 2. Zusammenfassung der ligiert Peyer-Patch Darmschlinge Assay. Die fluoreszierenden Bakteriensuspension wurde mit einer Spritze in ligiert Peyer'schen Patch Schleife auf der losen Seite des Darms injiziert.
Abbildung 4. Beispiel einer Maus ligiert Peyer-Patch Loop-Test mit GFP-S. typhimurium. GP2, die als M-Zell-spezifische Marker 5 berichtet wird, wurde mit anti-Maus-Antikörper GP2 (Red) gefärbt. Die Probe wurde mit einer DeltaVision Restoration Dekonvolution Mikroskop beobachtet. GFP-exprimierenden S. Typhimurium wurde mit GP2 auf der apikalen Plasmamembran der M-Zelle und in der subapicalen zytoplasmatischen Vesikeln (Pfeilspitzen) co-lokalisiert. Top, apikale Ansicht. Unten und seitlich, seitliche Ausblicke. Maßstab: 10 pm.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Die Inkubationszeit von ligiert Peyer-Patch mit Bakteriensuspension ist in der Regel für 1 Stunde, um die bakterielle Einbau in M-Zellen zu beobachten. Im Falle von 4 Stunden Inkubation werden die Bakterien oft in der T-Zell-Zone der Peyer-Plaques nachgewiesen. Wie das verdampfte Isofluran inhalant Anästhesie halten konnte Mäusen stabil ist, ist die Inkubationszeit von ligiert Peyer-Patch mit Bakteriensuspension erweiterbar, um die Bakterien, die in T-Zell-Zone in die Peyer-Patch bewegen zu beobachten. Der wichtige Punkt dieses Versuchs ist darauf zu achten, nicht auf das Blutgefäß kratzen, wenn Ligation des Darms. Im Falle von nicht GFP-Ausdruck Bakterien verwenden, könnten wir alternativ fluoreszenzmarkierten Bakterien durch kommerzielle Fluoreszenzmarkierung Reagenz. Wenn das Reagenz möglicherweise hemmt die bakterielle, die Sie verwenden möchten, Bindung an das Molekül auf M Zelle exprimiert wird, sollten Sie die spezifischen primären Antikörper, falls vorhanden, die einbezogen Bakterien zu erkennen.
NHALT "> Die ligiert Loop-Test-Methode wurde bisher 6, 7 beschriebenen Wir verbessern in einigen Punkten von dieser Methode wie folgt:... 1 Isofluran als Narkotikum für die Führung der Mäuse konstant 2 verwendet wird ca. 1 cm ligiert Darmschlinge einschließlich Peyer'schen. flicken ist. Satz 3. Bakterien durch M-Zellen aufgenommen fluoreszierend sind durch Fluoreszenzmarkierung Reagenz oder durch Überexpression fluoreszierendes Protein wie GFP markiert. 4. M-Zellen in der Follikel-assoziierte Epithel Peyer-Patch werden durch ganze-mount immunostainig mit hinreichender Sicherheit erkannt Anti Gp2 Antikörper. 5. Fluorescent bakterielle Transzytose von M-Zellen werden durch konfokale mikroskopische Analyse beobachtet.Wir und andere haben gezeigt, dass diverse heterogene Antigene aktiv zu gewinnen Einstieg in M-Zellen. Beträchtliche Zahl von Erregern einschließlich Salmonella spp., Shigella spp., Yersinia spp. Exploit M-Zellen für die Host-Invasion 8-10. Darüber hinaus die coccoid Form Helicobacter pylori kann potenziell in Peyer-Patch via M-Zellen transloziert, und diese Translokation ist essentiell für die Induktion einer chronischen Entzündung im Magen 11. Auf der anderen Seite bleiben die Mechanismen, mit denen diese Erreger eindringen M-Zellen nicht vollständig geklärt. Wir schlagen vor, dass die ligiert Peyer-Patch Loop-Test eine geeignete experimentelle Methode zur Zerlegung der Wechselwirkung zwischen M-Zellen und Krankheitserreger in vivo ist.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Keine Interessenskonflikte erklärt.
Acknowledgments
Die Autoren bedanken sich bei allen EIB-Mitglieder für die Entwicklung dieser Technik zu danken. Diese Arbeit wurde zum Teil durch Grant-in-Aid for Scientific Research auf Priority Areas "Membrane Traffic" (HO) und "Matrix of Infectious Phenomena" (KH), Young Scientists (SF und KH) und Wissenschaftliche Forschung (HO unterstützt ) und Scientific Research on Innovative Areas "Intrazelluläre Logistik" (HO), vom Ministerium für Bildung, Kultur, Sport, Wissenschaft und Technologie in Japan.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| LB Agar Ampicillin- 100 | SIGMA | L5667 | |
| Cy3 mono-Reactive Dye Pack | GE Healthcare | PA23001 | |
| Alexa Fluor 350 carboxylic acid, succinimidyl ester | Invitrogen | A10168 | |
| Inhalation anesthesia apparatus | Shinano Seisakusho | SN-487 | |
| Fixation and Permeabilization Solution | BD | 554722 | |
| Anti mouse Glycoprotein 2 antibody | MBL | D278-3 | 200-fold dilution (5μg/ml) |
| Goat Anti-Rat IgG, F(ab')2 fragment specific | Jackson ImmunoResearch | 112-505-006 | 200-fold dilution (20μg/ml) |
| Alexa Fluor 633 Phalloidin | Molecular Probes | A22284 | 50-fold dilution |
| Confocal laser scanning microscope | Leica Microsystems | DMIRE2 | |
| DeltaVision Restoration deconvolution microscope | Applied Precision | DeltaVision Core |
References
- Fagarasan, S., Honjo, T. Intestinal IgA synthesis: regulation of front-line body defences. Nat. Rev. Immunol. 3, 63-72 (2003).
- Hapfelmeier, S. Reversible microbial colonization of germ-free mice reveals the dynamics of IgA immune responses. Science. 328, 1705-1709 (2010).
- Owen, R. L., Jones, A. L. Epithelial cell specialization within human Peyer's patches: an ultrastructural study of intestinal lymphoid follicles. Gastroenterology. 66, 189-203 (1974).
- Neutra, M. R., Mantis, N. J., Kraehenbuhl, J. P. Collaboration of epithelial cells with organized mucosal lymphoid tissues. Nat. Immunol. 2, 1004-1009 (2001).
- Hase, K. Uptake through glycoprotein 2 of FimH(+) bacteria by M cells initiates mucosal immune response. Nature. 462, 226-230 (2009).
- Punyashthiti, K., Finkelstein, R. A. Enteropathogenicity of Escherichia coli. I. Evaluation of mouse intestinal loops. Infect. Immun. 4, 473-478 (1971).
- Owen, R. L., Pierce, N. F., Apple, R. T., Cray, W. C. Jr M cell transport of Vibrio cholerae from the intestinal lumen into Peyer's patches: a mechanism for antigen sampling and for microbial transepithelial migration. J. Infect. Dis. 153, 1108-1118 (1986).
- Owen, R. L. M cells--entryways of opportunity for enteropathogens. J. Exp. Med. 180, 7-9 (1994).
- Clark, M. A., Hirst, B. H., Jepson, M. A. M-cell surface beta1 integrin expression and invasin-mediated targeting of Yersinia pseudotuberculosis to mouse Peyer's patch M cells. Infect. Immun. 66, 1237-1243 (1998).
- Jensen, V. B., Harty, J. T., Jones, B. D. Interactions of the invasive pathogens Salmonella typhimurium, Listeria monocytogenes, and Shigella flexneri with M cells and murine Peyer's patches. Infect. Immun. 66, 3758-3766 (1998).
- Nagai, S. Role of Peyer's patches in the induction of Helicobacter pylori-induced gastritis. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 104, 8971-8976 (2007).
