Summary
负染色电子显微镜（EM）的可视化蛋白质样品已成为一种流行的结构分析方法。它是有用的定量结构分析，如计算一个正在研究的分子的三维重建，也为蛋白质制剂质量的定性检查。在这篇文章中，我们目前准备的EM电网，染色样品，并在电子显微镜下的可视化样品的详细协议。新手用户可以轻松地遵循这些协议，并利用负染作为常规检测EM，除了其他生化分析评估其蛋白质样品，。
Abstract
负染色或冷冻水合生物样品的单粒子电子显微镜（EM），已成为一个多功能的工具，在结构生物学 1 。近年来，这种方法已取得了巨大的成功，研究蛋白质和大分子复合物2，3结构。电子低温显微镜（cryoEM），其中冷冻水合蛋白样品是在一层薄薄的玻璃体冰4的嵌入式相比，负染色是一个简单的样品制备方法，其中蛋白质样品嵌入一层薄薄的干重金属盐，以增加标本的对比5。负染色增强对比EM允许相对较小的生物样品的检查。此外，以确定三维（3D）纯化蛋白质或蛋白质复合物6的结构，这种方法可以用于更广泛的用途。例如，负染色的EM可以很容易地使用可视化纯化蛋白质样品，获得信息，如同质/异质性的样品，蛋白质复合物或大型集会的形成，或简单地评价一种蛋白质制剂的质量。
在这个视频文章中，我们提出一个完整的协议使用的EM观察负染蛋白质样品，准备为负碳包覆电网收购在加速电压在120KV经营电子显微镜负染样品图像污渍的EM。这些协议已在我们的实验室常规新手用户可以很容易地遵循。
Protocol
1。电磁电网碳涂层的制备
- 填充用蒸馏水的大烧杯。
- 使用玻璃吸管砸在水面单一的火棉胶（〜20μL，2％戊酯，电子显微镜学，PA，美国）下降。火棉胶将蔓延在水/空气表面，形成一个薄薄的塑料层;注意：可用于任何尘埃颗粒清除水面的火棉胶的首次下降。从第一个下拉膜中取出后，水面上的灰尘清晰。
- 广场的EM电网，400或200目吉尔德铜电网购特德佩拉公司（美国），一个个浮于水面上的塑料层，我们通常的地方50〜100电网在一个紧密的包装图案，与光泽方电网面临的塑料层（图1A）。注：400目网格常规负染的EM电网;而200目网格收集倾斜对图像。
- 剪下一个馅饼CE纸张尺寸比电网的塑料层上放置的面积略大一些。仔细将纸张顶部的网格（图1B），等到纸张变得完全湿（图1C）。注：不同类型的纸张有不同的水的吸收率。重要的是，纸张不吸收水分太快。例如，定期的滤纸是不是为此目的，因为它吸收水分过快使得很多皱纹。碳薄膜皱纸不平整，从而不能收集随机的锥形倾斜三维重建倾斜对图像良好。来测试不同的文件，以找到一个合适的的。在我们的实验室，我们一直使用从当地的杂货店买的记事本文件。有时报纸的纸张也发现是合适的。另一种选择是使用相对厚的宣纸用于中国/日本书法。
- 迅速作出周围切口上的塑料薄膜和接近浸泡过的纸。紧接着，使用一对镊子，拿起纸与塑料薄膜和纸张之间夹着网格。放置在培养皿纸与电网所面临的空气干燥（图1D）;注意：重要的是让纸张风干。干燥过快产生许多皱纹的文件。
2。碳涂层网格
- 在我们的实验室中使用的碳涂布机是一个Cressington 208C高真空涡轮增压碳镀膜机（泰德佩拉）。我们的系统配备一个Cressington薄膜厚度的显示器，该措施的原则的基础上涂碳薄膜的厚度，石英晶体的振荡频率是在其表面沉积薄膜的质量改变。然而，协议在这里不需要厚度的显示器，因为它往往不是在每一个实验室。
- 锐化使用卷笔刀（泰德佩拉）和负载炭棒中碳涂层米碳棒achine（图2A）。两棒，用锋利的尖端和其他与平坦的放置互相反对。
- 应用真空润滑脂磨砂载玻片面积的一半，并把它旁边电网（图2B）。只有一半的载玻片磨砂面积应包括真空润滑脂。注：真空润滑脂面积不会改变碳涂层后的颜色。真空润滑脂与邻近地区之间的对比提供了一种涂碳的厚度估计。
- 广场与舞台上的碳涂布机电网的纸张。将载玻片电网（图2C）。注：你也可以用塑料薄膜载玻片涂电网首次转让涂装前，很多情况下电网下降从纸张。
- 泵的真空室，等到真空达到10-5托的水平。注：低真空镀膜往往会产生许多火花，导致许多大型的碳粒子网格。
- 增加当前非常缓慢。碳棒的锐利尖端会先变成红色，然后作为当前增加的白色。不要用肉眼直接观看高亮度提示。停止增加涂层启动时的电流。载玻片上会改变颜色从白色，浅灰色和深灰色。黑暗幻灯片的关联被涂碳薄膜的厚度。关闭当前的关闭停止涂层时所需的厚度已经达到（图2D）。注：1）经过反复的碳涂层工艺，玻璃钟罩内涂碳，其颜色变暗。这使得涂碳膜厚度大于它实际上是。 2）一个削尖的碳棒可用于几个涂层。每次涂后逐渐减少提示的清晰度。最大电流是影响碳棒的清晰度。一个直径较小的新鲜削尖杆需要一个相对较低的当前蒸发碳。后来涂层可能需要略高的电流。
- 放空真空室，取出后用涂电网。
注1：控制碳厚度更精确的方法是使用薄膜的厚度监视器。或者可以定性校准对精确的厚度测量显示器的颜色。这种技术的一个有用的碳厚度为3至7纳米。
这是一个简单的方法，准备大量的碳包覆电网，通常〜100％准备网格。网格包含一个薄薄的塑料层，它通常不会影响负染图像的质量。然而，在此方法制备的网格是不适合用于cryoEM。这层塑料可以去掉浸泡了几个小时到氯仿电网。
3。准备铀甲酸溶液（0.75％）为负染色的EM。详细的协议此前5介绍
- 到小烧杯称取37.5mg铀酸盐;
- 添加5毫升的开水，搅拌5分钟在黑暗中;
- 加入10μL5M NaOH溶液，继续搅拌5分钟;
- 过滤器的解决方案，使用注射器过滤器（Fisherbrand，13毫米注射器过滤器，0.2μm的尼龙非无菌，目录编号09-720-5），并存储在一个覆盖着铝箔的8毫升猎鹰管过滤的解决方案;
注意。铀酸盐粉末，就可以买到从电子显微镜科学（哈特菲尔德，PA），目录号22451 。铀酸盐的解决方案是光敏感，应尽量远离直射光线，例如，通过覆盖猎鹰管铝箔。新鲜配制的解决方案有一个浅黄色（图3A）。染色解决方案，可以保持一到两周之前开始沉淀在板凳上。铀酸盐是酸性的pH〜4。加入NaOH的pH值增加，但增加速度太快或过量可导致色斑沉淀。除了产生对比，铀酸盐也修复的蛋白质样品。由于固定利率是如此之快，低pH值通常不影响整体的蛋白质构象或蛋白质复合物的形成 7 。
4。准备负染色EM网格的议定书“。该协议是此前5详细描述
- 辉光放电的碳镀膜网格，使用Pelco easiGlow GlowDischarge系统（特德佩拉公司，美国）。当前使用的是15 mA和网格为30秒。 注意出院焕发。辉光出院电网，辉光放电后不久，应使用。我们经常使用的辉光放电后在不到2个小时的网格。
- 将两个20μL滴蒸馏水和两个铀酸盐溶液25μl滴在一块的封口膜（图3B）。
- 保持辉光放电的网格，与汽车使用反向力抗毛细管钳碳涂层的一面朝上。注：这是有必要使用抗毛细管钳。否则，液体样品将被吸走从电网由毛细管力之间的镊子。
- 应用2μL蛋白质样品辉光放电的电网，并等待30秒。注：等待时间和辉光放电的长度影响吸附在网格蛋白的浓度。非常稀释的样本，需要更长的吸附倍。然而，长时间吸附，可能会改变，因为水蒸汽的缓冲液浓度。为了达到适当的粒度分布在电网需要有些试验和错误做法。
- 用滤纸吸干样本。
- 触摸网格表面的水滴，然后水用滤纸吸干。重复与水的第二次下降。
- 触摸网格表面的污渍简要的首次下降。用滤纸吸干污渍的解决方案。
- 触摸网格表面的色斑20秒第二个下拉。印迹ØFF染色溶液用滤纸。
- 使用真空干燥电网。注：也可以留在板凳上，或在空气干燥的化学物质罩网格。真空干燥的好处是可以立即观察在EM电网。快干产生可能的神器是不均匀的色斑。
5。透射电子显微镜
- 在这个演示中使用的显微镜（FEI公司）与一个加坦的4K x 4K CCD相机配备一个Tecnai的T12。
- 简单插入样品前检查显微镜对齐;注意：这是只需要每一次的EM会议。在一个模型显微镜中，近乎完美的对齐可以保存。载入这样的一个对齐文件应恢复显微镜对准了近乎完美的条件。
- 装入单倾斜的标准试样座EM网格。
- 插入CompuStage的T12的持有人。抽水周期，等待完成。
- 插入列持有人。</ LI>
- 焦点标本，并设置所需的散焦，通常1.5um。注：基础，可以实现手动对焦使用最低对比的方法，或使用CCD相机，捕捉到的实时图像和计算生活傅立叶功率谱。
- 使用CCD相机记录图像;
- 在图像的负面染色的蛋白质样品，蛋白质往往被与白的对比，即对一个比较暗的背景色的白色密度。请注意，而不同地区的同一电网中的蛋白质含量通常都颇为相似，不观察不同领域不同层次的染色在同一电网。有时地区可能有不均匀染色或染色阳性（蛋白质出现白底黑字），而其他一些地区有完善的污渍。它往往是必要的网格搜索找到一个良好的成像面积的。
6。代表性的成果
典型的良好形象产生负面STA的例子独立非执行董事的样本，马脾铁蛋白（图4A），厂（图4B），古20S蛋白酶体（图4c）和核小体（图4D），显示。
图1。制备碳包覆电网为负染色的EM。）配售EM电网在火棉胶薄膜表面上的封闭包装图案由一。 b）将一块略高于网格面积较大的纸张。三）等待，直到纸张得到完全湿。四）拿起纸连同空气干燥的电网。
图2。 。涂层的EM电网与碳一）设置的碳蒸发器：在涂料仪器的两个碳杆，以一杆削尖点提示（左）。其他杆（右）在平坦的表面，并在接触与在对面s的一个点提示IDE。 b）放置在一个培育的载玻片的一侧少量的真空油脂。黑框内的面积真空润滑脂。 c）设置为涂层的电网。玻片用于保存的文件位置。箭头指向真空润滑脂的区域。 d）在涂层，覆盖与真空油脂的幻灯片的颜色不改变颜色。对比表明涂碳的厚度。
图3。说明负染色过程A）刚准备（左）铀酸盐的解决方案是透明无沉淀的迹象。 1〜2周后，沉淀在试管底部的底部开始积累。 b）将蒸馏水和铀在一块的封口膜甲酸溶液滴两滴（约25μl）。使用一对反毛细管钳与碳端辉光排出的碳包覆EM网格起来。下降的样品（〜2μL）是放置在网格中。 c）在等待30秒，印迹滤纸的解决方案。四）翻转网格网格的样品侧接触水的首次下降。重复步骤C和D来完成染色过程。
图4。负染蛋白质样品EM图像的例子。）马脾铁蛋白中的B）片段的抗原结合（FAB），C）古细菌20S蛋白酶体和D）核小体。所有图像记录具有相同的放大倍率。比例尺是20nm的。
Discussion
负染色EM是一个强大的工具，可以用来研究纯化的蛋白质样品的三维结构，如使用随机的锥形倾斜8方法，它需要从试样倾斜至60 °，并收集来自同一地区的一对图像，但untilted，计算大分子复合体的三维重建。此外，负染EM可以有许多其他应用，如二维（2D）的膜蛋白9晶体筛选，观察在不同的构象10，或者干脆进行可视化从而纯化的蛋白质样品的均匀性和/或异质性的蛋白质复合体提供反馈，以提高蛋白质纯化程序，等它可以是一个强大的生物化学检测。在这篇文章中，我们提出的协议，从准备收集在电子显微镜负染的蛋白质样品图像的碳包覆电网。如下图所示，程序比较简单，易于遵循。如果试图计算由随机的锥形倾斜方法观察到的样品的三维重建，这是必要的收购倾斜对图像。但是，如果进行单粒子分析的目的是，多个untilted图像就足够了。在这两种情况下，进一步的图像处理是必要的，这超出了这个视频文章的范围。
任何方法，有变化的协议。铀酸盐作品非常好，在大多数情况下为负染色试剂。醋酸铀是另一种常用的负染试剂。它的工作原理非常相似铀酸盐，但更大的晶粒尺寸，并在许多情况下，低于铀酸盐的对比。使用醋酸铀的好处是，解决方案的持续时间长于铀酸盐。一个并不需要每隔一至两个星期准备一个新的解决方案。两个铀甲酸和醋酸的酸性。一个明显的关注的是，低pH值可诱导在被研究的蛋白质样品的变化。两种染色的解决方案也可作为蛋白固定剂。早先的研究已经表明，这两个修复蛋白样品迅速 7 。这种快速的固定低pH值不太重要。在染色过程中，成为一个蛋白质样品固定前低的pH值可诱导任何更改。然而，其他如钼酸铵和磷钨酸负染试剂，可能会产生更好的效果染色样品时，低pH值是关注 7 。钼酸铵和磷钨酸约中性pH值，但这些污渍产生的蛋白质样品的对比度通常比铀酸盐。
Disclosures
没有利益冲突的声明。
Acknowledgments
程实验室的电子显微镜的工作部分是支持由NIH（1R01GM082893，1R01GM098672，1S10RR026814 - 01和P50GM082250（A.弗兰克尔）），和来自加州大学旧金山分校的生物医学研究的突破，机会奖和新技术奖项目给予资助。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Collodion | Electron Microscopy Sciences | 12620-30 | 30ml, 2% in Amyl Acetate |
| Gilder Cu grids | Ted Pella, Inc. | G400/G200 | 400/200 mesh |
| Cressington 208C High Vaccume Turbo Carbon Coater | Ted Pella, Inc. | 9260 | |
| Double pointed Carbon rod | Ted Pella, Inc. | 58 | |
| Uranyl formate | Electron Microscopy Sciences | 16984-59-1 | 99.9% purity |
| PELCO easiGlow GlowDischarge system | Ted Pella, Inc. | 91000 | Purchase at local pharmacy |
| Whatman #1 Filter paper | Fisher Scientific | 09-805E |
References
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