Summary
Visualiseren eiwit monsters door negatieve kleuring elektronenmicroscopie (EM) is uitgegroeid tot een populaire structurele analyse-methode. Het is nuttig voor kwantitatieve structurele analyse, zoals het berekenen van een 3D-reconstructie van de moleculen wordt bestudeerd, en ook voor kwalitatieve onderzoek naar de kwaliteit van het eiwit preparaten. In dit artikel geven we gedetailleerde protocollen voor de voorbereiding van de EM roosters, het kleuren van de steekproef en visualiseren van het monster in een elektronenmicroscoop. Beginnende gebruikers kunnen eenvoudig de volgende protocollen en te benutten negatieve EM vlek als een routine-test, in aanvulling op andere biochemische testen, voor het evalueren van hun eiwit monsters.
Abstract
Enkel deeltje elektronenmicroscopie (EM), van zowel negatieve gebeitst of bevroren gehydrateerd biologische monsters, is uitgegroeid tot een veelzijdig instrument in de structurele biologie 1. In de afgelopen jaren, heeft deze methode grote successen behaald in het bestuderen van structuren van eiwitten en macromoleculaire complexen 2, 3. Vergeleken met elektron cryomicroscopy (cryoEM), waarin bevroren gehydrateerd eiwit monsters worden ingebed in een dunne laag van glasvocht ijs 4, negatieve kleuring is een eenvoudiger monstervoorbereiding methode waarbij eiwitten monsters worden ingebed in een dunne laag van gedroogde heavy metal zout te verhogen exemplaar contrast 5. De verbeterde contrast van negatieve vlek EM laat onderzoek van de relatief kleine biologische monsters. In aanvulling op het bepalen van driedimensionale (3D) structuur van gezuiverde eiwitten of eiwitcomplexen 6, kan deze methode worden gebruikt voor veel bredere doeleinden. Bijvoorbeeld, negatieve vlek EM kan eenvoudig worden gebruikt voor het visualiseren gezuiverdeeiwit monsters, het verkrijgen van informatie, zoals homogeniteit / heterogeniteit van de steekproef, de vorming van eiwit complexen of grote samenstellingen, of gewoon om de kwaliteit van een eiwit preparaat te evalueren.
In deze video artikel presenteren we een compleet protocol voor het gebruik van een EM negatief gekleurde eiwitmonster te observeren, van het voorbereiden van carbon gecoate roosters voor negatieve vlek EM aan het verwerven van beelden van negatief gekleurde monster in een elektronenmicroscoop werken bij 120kV versnellen spanning. Deze protocollen zijn gebruikt in ons laboratorium routinematig en kan gemakkelijk worden gevolgd door beginnende gebruikers.
Protocol
1. Voorbereiding van de EM roosters voor carbon coating
- Vul een grote glazen beker met gedestilleerd water.
- Gebruik een glazen pipet met een enkele druppel collodium (~ 20μl, 2% in amylacetaat, Electron Microscopy Sciences, PA, USA) druppel op het oppervlak van het water. Collodium zal uitbreiden naar een dunne plastic laag te vormen op het water / lucht oppervlak; Opmerking: Een eerste druppel collodium kan worden gebruikt om het wateroppervlak uit stof deeltjes. Na het verwijderen van de film vanaf de eerste drop, het water oppervlak vrij is van stof.
- Plaats EM roosters, 400 of 200 mesh Gilder Cu roosters gekocht van Ted Pella Inc (USA), een voor een op de plastic laag drijvend op het wateroppervlak; We meestal plaats 50 ~ 100 roosters in een nauwe verpakking patroon, met de glimmende kant van het rooster naar beneden in de plastic laag (Fig. 1A). Let op: 400 mesh netwerken zijn goed voor de routine negatieve vlek EM grids, en dat 200 mesh netwerken zijn goed voor het verzamelen van tilt paar beelden.
- Snijden een taartce van papier met afmetingen iets groter dan het gebied waar de roosters worden geplaatst op de plastic laag. Zorgvuldig Plaats het papier op de top van de grid (Fig. 1B), en wacht totdat het papier helemaal nat (Fig. 1C). Let op: Verschillende soorten papier hebben verschillende wateropname tarieven. Het is belangrijk dat het papier geen water absorbeert te snel. Bijvoorbeeld, regelmatige filter papier is niet goed voor dit doel, omdat het water absorbeert te snel en maakt veel rimpels. De koolstof film gemaakt van gekreukt papier is niet vlak, en dus niet goed voor het verzamelen van tilt paar beelden voor willekeurige conische tilt 3D-reconstructie. Men moet verschillende papieren te testen om een geschikte te vinden. In ons laboratorium hebben we gebruik gemaakt van papieren van schrijfblokken gekocht bij de plaatselijke supermarkt. Soms is de krant papier bleek ook geschikt te zijn. Een andere optie is het gebruik van de relatieve dik rijstpapier gebruikt voor Chinese / Japanse kalligrafie.
- Snel te maken incisies op de plastic folie rond en dicht bij dede geweekte papier. Onmiddellijk daarna, gebruik dan een tang op te halen het papier met de roosters ingeklemd tussen de plastic folie en papier. Plaats het papier in een petrischaal met de roosters voor de lucht drogen (fig. 1D) naar; Opmerking: Het is belangrijk dat de papieren de lucht drogen. Drogen te snel genereert veel rimpels in de krant.
2. Carbon coating roosters
- De koolstof-coating machine die in ons laboratorium is een Cressington 208C High Vacuüm Turbo koolstofbedamper (Ted Pella). Ons systeem is uitgerust met een Cressington laagdikte monitor, die de dikte van gecoate carbon film gebaseerd op het principe dat de oscillerende frequentie van een kwartskristal is veranderd door de massa van een film afgezet op het oppervlak maatregelen. Echter, de hier beschreven protocol vereist geen dikte monitor, omdat het vaak niet beschikbaar is in elk laboratorium.
- Verscherpen een carbon staaf met een puntenslijper (Ted Pella) en de belasting koolstof staven in carbon coating machine (Fig. 2A). Twee hengels, een met een scherpe punt en de andere met een plat uiteinde worden geplaatst tegen elkaar.
- Het toepassen van vacuüm vet op de helft van de matte oppervlakte van een glasplaatje en leg deze naast de roosters (Fig. 2B). Slechts de helft van de matte oppervlakte van het glas dia moet worden bedekt met vacuüm vet. Opmerking: Het gebied met onderdruk vet zal niet kleur veranderen na carbon coating. Het contrast tussen de aangrenzende gebieden met en zonder vacuüm vet geeft een schatting van de dikte van gecoat koolstof.
- Plaats het papier met roosters op het podium van carbon coating machine. Plaats het glaasje naast de roosters (Fig. 2C). Opmerking: Men kan ook eerst overbrengen grids gecoat met het plastic folie om een glasplaatje voor het coaten, in het geval een groot aantal netten vallen van het papier.
- Pomp de vacuümkamer, en wachten tot het vacuüm bereikt een niveau van 10 -5 Torr. Let op: coating met lager vacuüm genereert vaak veel vonken heeft geleid tot veel grote carbon deeltjes ophet rooster.
- Verhoging van de huidige zeer langzaam. De scherpe punt van de koolstof staaf wordt eerst rood en daarna wit als de huidige toeneemt. Geen hoge helderheid tip direct met het blote oog te zien. Stoppen met het verhogen stroom wanneer de coating begint. Het glasplaatje zal van kleur veranderen van wit naar grijs en vervolgens donker grijs licht. De duisternis van de dia's correleert de dikte van de koolstof-film worden gecoat. Schakel de stroom uit om te stoppen als coating gewenste dikte is bereikt (fig. 2D). Let op: 1) Na herhaalde carbon coating processen, gecoat koolstof uit de binnenkant van de glazen stolp kunnen donkerder de kleur. Dit maakt de gecoate carbon folie dikker lijken dan het werkelijk is. 2) Een geslepen koolstof staaf kan worden gebruikt voor meerdere coating. De scherpte van de tip wordt geleidelijk verminderd na elke coating. De maximale stroom wordt beïnvloed door de scherpte van de koolstof staaf. Een vers geslepen stang met een kleinere diameter is een relatief lagerestroom naar carbon verdampen. Later coating kan verlangen iets hogere stroom.
- Vent de vacuümkamer en verwijderen gecoate roosters voor later gebruik.
Noot 1. De meer nauwkeurige methode van controleren van de dikte van koolstof is met behulp van een laagdikte monitor. Of men kan kwalitatief kalibreren kleur tegen de juiste dikte gemeten door de monitor. Een nuttige carbon dikte voor deze techniek is tussen de 3 en 7 nm.
Dit is een eenvoudige en gemakkelijke methode om een grote hoeveelheid koolstof gecoate roosters voor te bereiden, meestal ~ 100 rasters per voorbereiding. De roosters bevatten een dunne plastic laag, die meestal geen invloed op de kwaliteit van de negatief gekleurde afbeelding. Echter, roosters opgesteld in deze methode zijn niet geschikt voor cryoEM. Deze laag van het plastic kan worden verwijderd door het weken van de om te zetten in chloroform voor enkele uren.
3. Voorbereiden uranyl formate-oplossing (0,75%) voor negatieve vlek EM. De gedetailleerde protocol werdeerder beschreven vijf
- Weeg 37,5 mg van uranyl formate in een klein bekerglas;
- Voeg 5 ml kokend water en roer gedurende 5 minuten in het donker;
- Voeg 10μl 5M NaOH, blijven roeren gedurende 5 minuten;
- Filtreer de oplossing met behulp van een injectiespuit filter (Fisherbrand, 13mm spuitfilter, 0.2μm, Nylon niet-steriele, catalogus nummer 09-720-5), en sla het gefilterde oplossing in een 8 ml Falcon buis bedekt met aluminiumfolie;
Let op. Uranyl Formate poeder kan worden gekocht bij Elektronenmicroscopie Sciences (Hatfield, PA), catalogusnummer 22451. Uranyl formate oplossing is lichtgevoelig en moet uit de buurt van direct licht worden gehouden, bijvoorbeeld door het bedekken van de Falcon buis met aluminium folie. Een vers bereide oplossing heeft een licht gele kleur (Fig. 3A). Vlek oplossing kan worden bewaard op de bank voor een tot twee weken voordat het begint neerslaat. Uranyl formate is zuur met een pH ~ 4. Het toevoegen van NaOH stijgt de pH-waarde, maar het toevoegen van u te snelof groter kan leiden tot de vlek neer te slaan. In aanvulling op het genereren van contrast, uranyl formiaat lost ook het eiwit monster. Omdat de fixatie tarief is zo snel, de lage pH-waarde meestal niet van invloed op de totale eiwit conformaties of eiwitcomplex vorming van 7.
4. Protocol voor het bereiden van een negatieve vlek EM grid. Dit protocol werd in detail beschreven eerder 5
- Glow-ontlading carbon gecoate rooster, met behulp van PELCO easiGlow GlowDischarge systeem (Ted Pella Inc, USA). De gebruikte stroom is 15 mA en roosters zijn glow gekweten is voor de 30 sec. Note. Glow-ontladen grids moet worden gebruikt kort na gloed ontladen. We maken vaak gebruik van de netten in minder dan 2 uur na de glimontlading.
- Plaats twee 20μl druppels gedestilleerd water en twee 25μl druppels uranyl formate oplossing op een stuk van parafilm (Fig. 3B).
- Houd een gloed-ontladen raster met behulp van reverse-force anti-capillaire pincet met de autobon-gecoate zijde naar boven. Opmerking: Het is noodzakelijk om anti-capillaire pincet te gebruiken. Anders zal vloeistof monster uit de buurt van netten worden aangezogen door de capillaire kracht tussen de tang.
- Van toepassing 2μl eiwitmonster om de gloed-ontladen grid, en wacht 30 sec. Opmerking: De wachttijd en de lengte van de glimontlading invloed op de concentratie van eiwitten geadsorbeerd in het net. Zeer verdunde monsters vereisen een langere adsorptie tijden. Echter, kan langdurig adsorptie veranderen de buffer concentratie sinds water dampen. Om een goede deeltjesverdeling in het net vergt een beetje trial and error aanpak.
- Blot uit het monster met behulp van filter papier.
- Raak het net oppervlak tot een druppel water en dep vervolgens uit het water met filtreerpapier. Herhaal dit met de 2e druppel water.
- Raak het rooster oppervlak om de eerste druppel vlek kort. Blot de vlek oplossing met filtreerpapier.
- Raak het rooster oppervlak om de tweede druppel van de vlek gedurende 20 seconden. Blot off vlek oplossing met filtreerpapier.
- Droog het rooster met behulp van een vacuüm. Opmerking: men kan ook grids laten op de bank of in een chemisch kap aan de lucht drogen. Het voordeel van vacuüm droog is dat men de netten in de EM direct te observeren. De mogelijke artefact gegenereerd door snelle droging is ongelijk vlek.
5. Transmissie-elektronenmicroscoop
- De microscoop wordt gebruikt in deze demonstratie is een Tecnai T12 (FEI Company) zijn uitgerust met een Gatan 4K x 4K-CCD-camera.
- Kort Controleer de uitlijning van de microscoop voordat u monster; Opmerking: Dit is slechts een keer per EM sessie nodig. In een model microscoop, kan de buurt van een perfecte uitlijning eerder gered worden. Laden van een dergelijke afstemming een bestand moet herstellen van de microscoop aanpassing aan een bijna perfecte conditie.
- Laad de EM rooster in de interne tilt standaard preparaathouder.
- Plaats de houder in CompuStage van de T12. Wacht tot de pomp cyclus te voltooien.
- Plaats de houder in de kolom. </ Li>
- Focus monster en stel een gewenste defocus, meestal-1.5um. Let op: Scherpstellen kan worden bereikt door handmatig scherpstellen met de minimum contrast methode of met behulp van CCD-camera om live beelden vast te leggen en live Fourier power spectrum te berekenen.
- Record een afbeelding met behulp van CCD-camera;
- In beelden van negatief gekleurde eiwitten monsters, worden eiwitten vaak gezien met wit contrast, dat wil zeggen witte dichtheid tegen een donkere achtergrond. Merk op dat, terwijl het eiwit concentraties in verschillende delen van hetzelfde netwerk zijn meestal zeer vergelijkbaar, een doet verschillende niveaus van de vlek te observeren in verschillende gebieden van hetzelfde net. Soms zijn gebieden kunnen hebben ongelijkmatige vlekken of zelfs positieve kleuring (eiwit verschijnt donker op een lichte achtergrond), terwijl sommige andere gebieden hebben een perfecte vlek. Het is vaak nodig om het net zoekopdracht naar een goed gebied voor de beeldvorming te zoeken.
6. Representatieve resultaten
Voorbeelden van typische goede beelden van negatief staINED monsters, paard milt ferritine (Figuur 4A), Fab (Fig. 4B), Archaea 20S proteasoom (fig. 4C) en nucleosoom (Fig. 4D), worden getoond.
Figuur 1. De voorbereiding van koolstof gecoate roosters voor negatieve vlek EM. A) Het plaatsen van rasters een EM-voor-een in een gesloten verpakking patroon op het oppervlak van collodium film. B) Het plaatsen van een stuk papier iets groter dan het gebied van de roosters. C) Wacht tot het papier komt volledig nat. D) Pak het papier samen met de roosters voor lucht-drogen.
Figuur 2. . Coating EM roosters met carbon A) Stel de koolstof verdamper: plaats de twee koolstof staven in de coating apparatuur, met een hengel (links) verscherpt om een punt te tip. De andere stang (rechts) heeft een vlakke ondergrond en komen in contact met de punt topje van de ene in de andere side. B) Plaats een kleine hoeveelheid vacuüm vet in een kant van een bevorderd glasplaatje. Het gebied binnen het zwarte frame is vacuüm vet. C) Stel de roosters voor coating. De glazen dia's worden gebruikt om het papier in positie te houden. De pijlpunt wijst het gebied met vacuüm vet. D) Na het coaten, is de kleur van de dia met overdekte vacuüm vet niet veranderen van de kleur. Het contrast geeft de dikte van gecoat koolstof.
Figuur 3. Ter illustratie van de negatieve kleuring procedure. A) vers bereid (links) uranyl formiaat oplossing is transparant, zonder teken van precipitaten. Na 1 ~ 2 weken, start precipitaten zich ophopen in de bodem in de bodem van de buis. B) Plaats twee druppels (~ 25μl) van gedestilleerd water en twee druppels uranyl formate oplossing in een stuk van Parafilm. Gebruik een paar anti-capillaire een tang om een gloed ontslagen koolstof beklede EM rooster te houden met carbon kantomhoog. Een druppel van het monster (~ 2μl) is geplaatst in het rooster. C) Na het wachten voor 30 seconden, blot de oplossing met een papieren filter. D) Flip het raster om de steekproef kant van het rooster contact met de eerste druppel water. Herhaal de stap C en D om het proces van verkleuring te voltooien.
Figuur 4. Voorbeelden van EM beelden van negatief gekleurde eiwit monsters. A) paard milt ferritine, B) fragment van antigeen-bindende (Fab), C) Archaea 20S proteasoom en D) nucleosoom. Alle beelden werden opgenomen met dezelfde vergroting. De schaal bar is 20nm.
Discussion
Negatieve vlek EM is een krachtig instrument dat kan worden gebruikt om 3D-structuren van het gezuiverde eiwit monsters, zoals het gebruik van willekeurige conische kantelen 8-methode, die vereist dat het verzamelen van een paar van beelden met een exemplaar van gekanteld tot 60 ° en een uit hetzelfde gebied onderzoek maar Untilted, om 3D-reconstructies van macromoleculaire complexen te berekenen. Bovendien negatieve kleuring EM kan vele andere toepassingen, zoals screening voor twee-dimensionale (2D) kristallen van membraaneiwitten 9, het visualiseren van eiwitcomplexen in verschillende conformaties 10, of gewoon voor het visualiseren van homogeniteit en / of de heterogeniteit van de gezuiverde eiwitten monster dus het verstrekken van feedback aan eiwitzuivering procedures te verbeteren, enz. Het kan een krachtige test voor biochemici worden. In dit artikel presenteerden wij de protocollen, variërend van de voorbereiding van de koolstof beklede roosters aan het verzamelen van beelden van negatief gekleurde eiwit monsters in een elektronenmicroscoop. Zoals hier afgebeeld,de procedure is vrij eenvoudig en makkelijk te volgen. Als een poging om 3D-reconstructies van het monster wordt waargenomen door een willekeurige conische kantel methode te berekenen, is het noodzakelijk om kantelen paar beelden te verwerven. Echter, als het uitvoeren van een analyse van deeltjes is het doel, zullen meerdere Untilted beelden volstaan. In beide gevallen is verder beeldverwerking vereist en dit is buiten het bestek van deze video artikel.
Zoals bij elke methode, zijn er wijzigingen in de protocollen. Uranyl formate werkt erg goed als een negatieve vlek reagens in de meeste gevallen. Uranylacetaat is een andere veel gebruikte negatieve vlek reagens. Het werkt zeer vergelijkbaar als uranyl formate, maar met een grotere korrelgrootte en, in veel gevallen een lager contrast dan uranyl formate. Het voordeel van het gebruik van uranylacetaat is dat de oplossing langer duurt dan uranyl formate. Men heeft geen behoefte aan een nieuwe oplossing voor te bereiden om de een of twee weken. Zowel uranyl formiaat en acetaat zijn zuur. Een voor de hand liggende zorg is dat delage pH kan veroorzaken veranderingen in het eiwit monster wordt onderzocht. Beide vlekken oplossingen ook fungeren als eiwit fixatieven. Een eerdere studie heeft aangetoond dat zowel de fix eiwit monsters snel 7. Deze snelle fixatie maakt de lage pH minder belangrijk. Tijdens het proces van verkleuring, een eiwit monster wordt vastgesteld voordat de lage pH-waarde kan induceren eventuele wijzigingen. Toch kunnen andere negatieve vlekken reagentia, zoals ammoniummolybdaat en fosfowolfraamzuur, leveren betere resultaten voor het beitsen van monsters bij een lage pH-waarde is een punt van zorg 7. Zowel ammoniummolybdaat en fosfowolfraamzuur hebben een ongeveer neutrale pH-waarde, maar het contrast van eiwit monsters die door deze vlekken is meestal inferieur aan uranyl formate.
Disclosures
Geen belangenconflicten verklaard.
Acknowledgments
Elektronenmicroscopie werk bij Cheng laboratorium is deels te ondersteunen door subsidies van NIH (1R01GM082893, 1R01GM098672, 1S10RR026814-01 en P50GM082250 (naar A. Frankel)), en een subsidie van UCSF Programma van Doorbraak Biomedical Research, Opportunity Award en New Technology Award.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Collodion | Electron Microscopy Sciences | 12620-30 | 30ml, 2% in Amyl Acetate |
| Gilder Cu grids | Ted Pella, Inc. | G400/G200 | 400/200 mesh |
| Cressington 208C High Vaccume Turbo Carbon Coater | Ted Pella, Inc. | 9260 | |
| Double pointed Carbon rod | Ted Pella, Inc. | 58 | |
| Uranyl formate | Electron Microscopy Sciences | 16984-59-1 | 99.9% purity |
| PELCO easiGlow GlowDischarge system | Ted Pella, Inc. | 91000 | Purchase at local pharmacy |
| Whatman #1 Filter paper | Fisher Scientific | 09-805E |
References
- Cheng, Y., Walz, T. The advent of near-atomic resolution in single-particle electron microscopy. Annu. Rev. Biochem. 78, 723-742 (2009).
- Grigorieff, N., Harrison, S. C. Near-atomic resolution reconstructions of icosahedral viruses from electron cryo-microscopy. Curr. Opin. Struct. Biol. 21 (2), 265-273 (2011).
- Zhou, Z. H. Atomic resolution cryo electron microscopy of macromolecular complexes. Adv. Protein Chem. Struct. Biol. 82, 1-35 (2011).
- Adrian, M., Dubochet, J., Lepault, J., McDowall, A. W. Cryo-electron microscopy of viruses. Nature. 308 (5954), 32-36 (1984).
- Ohi, M., Li, Y., Cheng, Y., Walz, T. Negative Staining and Image Classification - Powerful Tools in Modern Electron Microscopy. Biol. Proced. Online. 6, 23-34 (2004).
- Rabl, J. Mechanism of gate opening in the 20S proteasome by the proteasomal ATPases. Mol. Cell. 30 (3), 360-368 (2008).
- Zhao, F. Q., Craig, R. Capturing time-resolved changes in molecular structure by negative staining. J. Struct. Biol. 141 (1), 43-52 (2003).
- Radermacher, M., Wagenknecht, T., Verschoor, A., Frank, J. Three-dimensional reconstruction from a single-exposure, random conical tilt series applied to the 50S ribosomal subunit of Escherichia coli. J. Microsc. 146 (Pt. 2), 113-136 (1987).
- Zhao, G. Two-dimensional crystallization conditions of human leukotriene C4 synthase requiring adjustment of a particularly large combination of specific parameters. J. Struct. Biol. 169 (3), 450-454 (2010).
- Nishida, N. Activation of leukocyte beta2 integrins by conversion from bent to extended conformations. Immunity. 25 (4), 583-594 (2006).
