Summary
Visualisation des échantillons de protéines par microscopie électronique à coloration négative (EM) est devenue une méthode d'analyse structurelle populaires. Il est utile pour l'analyse structurelle quantitative, comme le calcul d'une reconstruction 3D des molécules étudiées, et aussi pour un examen qualitatif de la qualité des préparations de protéines. Dans cet article nous présentons des protocoles détaillés pour la préparation des grilles EM, la coloration de l'échantillon et la visualisation de l'échantillon dans un microscope électronique. Les utilisateurs novices peuvent suivre ces protocoles à utiliser facilement et négatifs EM tache comme un test de routine, en plus d'autres dosages biochimiques, pour évaluer leurs échantillons de protéines.
Abstract
Simple microscopie électronique de particules (EM), à la fois teinté négatifs ou congelé hydraté échantillons biologiques, est devenu un outil polyvalent en biologie structurale 1. Ces dernières années, cette méthode a obtenu de grands succès dans l'étude de structures de protéines et de complexes macromoléculaires 2, 3. Comparé à d'électrons cryomicroscopie (cryoEM), dans lequel la protéine hydratée échantillons congelés sont noyées dans une couche mince de glace vitreuse 4, coloration négative est une méthode simple de préparation d'échantillons dans lesquels des échantillons de protéines sont noyées dans une couche mince de sel métallique lourde séchées pour augmenter 5 Contrairement spécimen. Le contraste amélioré de tache négative EM permet l'examen de relativement petite des échantillons biologiques. En plus de déterminer trois dimensions (3D) la structure des protéines purifiées ou des complexes protéiques 6, cette méthode peut être utilisée à des fins beaucoup plus large. Par exemple, une teinture négative EM peut être facilement utilisé pour visualiser purifiéeéchantillons de protéines, d'obtenir des informations telles que l'homogénéité / hétérogénéité de l'échantillon, la formation de complexes protéiques ou des assemblages de grande taille ou simplement pour évaluer la qualité d'une préparation de protéines.
Dans cet article, vidéo, nous présentons un protocole complet pour une utilisation EM pour observer l'échantillon de protéines colorées négativement, de la préparation des grilles de carbone enduit pour négatifs EM tache pour acquérir des images de l'échantillon colorées négativement dans un microscope électronique fonctionnant à tension d'accélération 120 kV. Ces protocoles ont été utilisés couramment dans notre laboratoire et peut être facilement suivi par les utilisateurs novices.
Protocol
1. Préparation de l'EM grilles pour revêtement carbone
- Remplir un bécher de verre avec de l'eau distillée.
- Utiliser une pipette en verre de laisser tomber une seule goutte de collodion (~ 20 pi, 2% dans l'acétate d'amyle, Sciences Electron Microscopy, PA, Etats-Unis) sur la surface de l'eau. Le collodion se propage à former une couche mince en plastique à l'eau / air en surface; Remarque: Une première goutte de collodion peut être utilisée pour effacer de la surface de l'eau de toute particule de poussière. Après avoir retiré le film de la première goutte, la surface de l'eau est exempte de poussière.
- Placez les grilles EM, 400 ou 200 mesh Gilder grilles Cu achetés auprès de Ted Pella Inc (Etats-Unis), un par un sur la couche de plastique flottant à la surface de l'eau; Nous lieu habituellement 50 ~ 100 grilles dans un schéma proche d'emballage, avec la brillante côté de la grille vers le bas dans la couche de plastique (fig. 1A). Remarque: 400 mailles des grilles sont bons pour la routine négatifs grilles EM tache, tandis que 200 grilles mailles sont bons pour recueillir des images paires d'inclinaison.
- Couper une tarteCE de papier avec des dimensions légèrement plus grandes que la zone où les grilles sont placées sur la couche de plastique. Placez le papier soigneusement au-dessus de la grille (Fig. 1B), et attendre que le papier devient complètement mouillée (Fig. 1C). Remarque: Différents types de papier sont différents taux d'absorption d'eau. Il est important que le papier n'absorbe pas l'eau trop vite. Par exemple, régulièrement papier filtre n'est pas bon pour cette fin parce qu'il absorbe l'eau trop vite et fait beaucoup de rides. Le film de carbone à base de papier froissé n'est pas plat, et donc pas bon pour la collecte des images paires d'inclinaison pour la reconstruction d'inclinaison aléatoire 3D conique. On doit tester différents papiers pour trouver une qui me convienne. Dans notre laboratoire, nous avons été en utilisant des papiers à partir des blocs-notes acheté de l'épicerie locale. Parfois, le papier journal a également été jugée appropriée. Une autre option est d'utiliser le papier de riz relativement épais utilisé pour la calligraphie chinoise / japonaise.
- Rapidement faire des incisions sur le film plastique autour et à proximitéle papier trempé. Immédiatement après, utiliser une paire de pinces pour ramasser le papier avec les grilles en sandwich entre le film plastique et le papier. Placez le papier dans une boîte de Pétri avec des grilles vers le haut pour le séchage de l'air (Fig. 1D); Note: Il est important de laisser le papier sécher à l'air. Séchage trop rapide génère de nombreuses rides dans le document.
2. Grilles revêtement carbone
- La machine de carbone revêtement utilisé dans notre laboratoire est un Cressington 208C Haute Turbo Vacuum Coater carbone (Ted Pella). Notre système est équipé d'un moniteur Cressington épaisseur du film, qui mesure l'épaisseur du film de carbone revêtu basé sur le principe que la fréquence d'oscillation d'un cristal de quartz est changé par la masse d'un film déposé sur sa surface. Toutefois, le protocole décrit ici n'a pas besoin d'un moniteur d'épaisseur, car il n'est souvent pas disponible dans tous les laboratoires.
- Aiguiser une tige de carbone en utilisant un taille-crayon (Ted Pella) et des tiges de carbone de charge en carbone enduit machine (figure 2A). Deux tiges, l'une avec un bout pointu et l'autre avec une extrémité plate sont placés les uns contre les autres.
- Appliquer de la graisse à vide sur la moitié de la surface dépolie d'une lame de verre et le placer à côté de la grille (figure 2B). Seule la moitié de la zone dépolie de la lame de verre devrait être couvert avec de la graisse à vide. Note: La zone avec de la graisse à vide ne sera pas changer de couleur après le revêtement de carbone. Le contraste entre les zones adjacentes, avec et sans graisse à vide fournit une estimation de l'épaisseur du carbone revêtu.
- Placez le papier avec des grilles du stade de machine d'enduction de carbone. Placez la lame de verre à côté de la grille (figure 2C). Remarque: On peut aussi les grilles premier transfert revêtu du film plastique pour une lame de verre avant le revêtement, en cas de nombreuses grilles tombent du papier.
- Pompe à vide de la chambre, et attendre que le vide atteint un niveau de 10 -5 Torr. Remarque: Un revêtement à faible dépression génère souvent des étincelles nombreuses, ce qui entraîne de nombreuses particules de carbone sur les grandesla grille.
- Augmenter le courant très lentement. L'extrémité pointue de la tige de carbone deviendra d'abord rouge, puis blanc comme le courant augmente. Ne regardez pas la pointe haute luminosité directement à l'œil nu. Arrêtez l'augmentation actuelle lorsque le revêtement commence. La lame de verre change de couleur du blanc au gris clair et gris foncé. L'obscurité de la glisse est corrélée à l'épaisseur du film de carbone étant couché. Tourner le courant OFF pour arrêter revêtement lorsque l'épaisseur souhaitée a été réalisée (Fig. 2D). Note: 1) Après plusieurs procédés de revêtement de carbone, revêtement de l'intérieur de la cloche de verre pourrait assombrir sa couleur. Cela rend le film carbone revêtu apparaissent plus épaisse qu'elle ne l'est réellement. 2) Une tige de carbone affûté peut être utilisé pour le revêtement de plusieurs années. La netteté de la pointe est réduite progressivement après chaque revêtement. Le courant maximum est influencée par la netteté de la tige de carbone. Une tige fraîchement aiguisée avec de plus petit diamètre nécessite une relative inférieureactuelle de s'évaporer de carbone. Plus tard revêtement peut exiger un peu plus élevée.
- Purger l'enceinte sous vide et retirez grilles recouvertes pour une utilisation ultérieure.
Remarque 1. La méthode la plus précise de contrôler l'épaisseur de carbone est d'utiliser un moniteur épaisseur du film. Ou on peut calibrer la couleur qualitativement contre l'épaisseur précise mesurée par le moniteur. Une épaisseur de carbone utile pour cette technique se situe entre 3 et 7 nm.
C'est une méthode simple et facile à préparer une grande quantité de grilles de carbone revêtu, généralement ~ 100 grilles par la préparation. Les grilles contiennent une couche de plastique mince, qui n'a généralement pas d'incidence sur la qualité de l'image colorées négativement. Cependant, les grilles préparées dans cette méthode ne convient pas à cryoEM. Cette couche de plastique peuvent être enlevés par le trempage des grilles dans le chloroforme pendant plusieurs heures.
3. Préparer une solution de formiate d'uranyle (0,75%) pour les négatifs EM tache. Le protocole détaillé a étédécrite précédemment 5
- Peser 37,5 mg de formiate d'uranyle dans un petit bécher;
- Ajouter 5 ml d'eau bouillante et remuer pendant 5 minutes dans l'obscurité;
- Ajouter 10 ul de NaOH 5M, continuent remuer pendant 5 minutes;
- Filtrer la solution à l'aide d'une seringue (Fisherbrand, 13mm filtre seringue, 0,2 um, Nylon non-stériles, numéro de catalogue 09-720-5) filtre, et de stocker la solution filtrée dans un tube Falcon 8ml recouvert de papier d'aluminium;
Poudre de formiate Remarque. Uranyle peuvent être achetés auprès de Sciences Electron Microscopy (Hatfield, PA), numéro de catalogue 22451. Solution de formiate d'uranyle est sensible à la lumière et doivent être tenus à l'écart de la lumière directe, par exemple en recouvrant le tube Falcon de papier d'aluminium. Une solution fraîchement préparée a une couleur jaune pâle (figure 3A). Solution de teinture peut être gardé sur le banc pour une à deux semaines avant qu'elle ne commence précipitation. Formiate d'uranyle est acide avec un pH ~ 4. Ajout de NaOH augmente le pH, mais il en ajoutant trop rapidementou en excès peut causer la tache à précipiter. En plus de générer l'inverse, le formiate d'uranyle corrige également l'échantillon de protéine. Parce que le taux de fixation est si rapide, le faible pH n'a généralement pas d'incidence sur les conformations de protéines ou de la formation des protéines complexes 7.
4. Protocole pour la préparation de coloration négative EM grille. Ce protocole a été décrite en détail précédemment 5
- La grille de carbone à décharge luminescente revêtue, à l'aide PELCO GlowDischarge easiGlow système (Ted Pella Inc, États-Unis). Le courant utilisé est de 15 mA et les grilles sont lueur déchargée pendant 30 sec. Remarque. Glow-déchargée des grilles doit être utilisé juste après lueur de déchargement. Nous utilisons souvent des grilles en moins de 2 heures après la décharge luminescente.
- Placez deux gouttes d'eau distillée 20 pi et deux gouttes de solution de formiate de 25 pi uranyle sur un morceau de parafilm (figure 3B).
- Tenir une lueur déchargée grille à l'aide inverse force anti-capillarité forceps avec la voitureBon revêtement vers le haut. Note: Il est nécessaire d'utiliser des anti-capillarité forceps. Sinon, l'échantillon liquide sera aspiré par les grilles de la force capillaire entre les pinces.
- Appliquer échantillon de protéine 2μl à la lueur déchargée grille, et d'attendre 30 sec. Remarque: Le temps d'attente et la durée de la décharge luminescente influence sur la concentration des protéines adsorbées sur la grille. Échantillons très dilués prennent plus de temps d'adsorption. Toutefois, prolongée d'adsorption peut changer la concentration du tampon, depuis les vapeurs d'eau. Pour obtenir une bonne répartition des particules dans la grille nécessite peu d'essai et d'erreur démarche.
- Blot hors de l'échantillon en utilisant un papier filtre.
- Touchez la surface de la grille d'une goutte d'eau puis éponger hors de l'eau avec un papier filtre. Répéter l'opération avec la chute de 2e eau.
- Touchez la surface de la grille à la première goutte de brève tache. Blot hors la solution tache avec un papier filtre.
- Touchez la surface de la grille de la deuxième baisse de la tache pendant 20 secondes. Blot off solution de tache avec un papier filtre.
- Sécher la grille à l'aide du vide. Remarque: on peut aussi laisser des grilles sur le banc ou dans une hotte chimique à l'air sec. L'avantage du vide sec est que l'on peut observer les grilles de l'EM immédiatement. L'artefact possibles générées par un séchage rapide est inégale tache.
5. Microscope électronique à transmission
- Le microscope utilisé dans cette démonstration est un T12 Tecnai (FEI Company) équipé d'une caméra Gatan 4K x 4K CCD.
- Brièvement vérifier l'alignement du microscope avant d'insérer l'échantillon; Note: Ceci n'est nécessaire qu'une fois par EM session. Dans un microscope modèle, à proximité de l'alignement parfait ne peut être sauvé précédemment. Chargement un tel fichier alignement devrait rétablir l'alignement de microscope à un état presque parfait.
- Chargez la grille EM dans le seul titulaire spécimen d'inclinaison standard.
- Insérer porteur en CompuStage de T12. Attendez que le cycle de pompage à compléter.
- Insérez le support dans la colonne. </ Li>
- Accent mis échantillon et une défocalisation désirée, habituellement-1.5um. Remarque: mise au point peut être réalisé soit par mise au point manuelle en utilisant la méthode de contraste minimum ou en utilisant la caméra CCD pour capturer des images en direct et de calculer en direct du spectre de puissance de Fourier.
- Enregistrer une image en utilisant la caméra CCD;
- Dans les images d'échantillons négativement protéines colorées, les protéines sont souvent considérés avec un contraste blanc, à savoir la densité blanc contre un fond plus sombre. Notez que bien que les concentrations de protéines dans différentes zones de la même grille sont généralement assez semblables, on ne observent les différents niveaux de tache dans différentes zones de la même grille. Parfois, les zones pu coloration inégale ou même coloration positive (protéine apparaît sombre sur fond clair), alors que certaines autres régions ont parfaite tache. Il est souvent nécessaire de rechercher la grille pour repérer un bon endroit pour l'imagerie.
6. Les résultats représentatifs
Voici des exemples de bonnes images de façon négative staéchantillons Ined, rate de cheval de ferritine (figure 4A), Fab (figure 4B), 20S du protéasome archées (Fig. 4C) et nucléosome (figure 4D), sont présentés.
Figure 1. Préparation des grilles de carbone revêtu d'EM négatifs tache. A) Placer les grilles EM un par un dans un modèle d'emballage fermé sur la surface du film au collodion. B) Placer une feuille de papier légèrement plus grand que la zone des grilles. C) Attendez jusqu'à ce que le papier est complètement mouillée. D) Ramassez le papier avec les grilles d'air de séchage.
Figure 2. . Revêtement grilles EM avec le carbone A) Configuration de l'évaporateur de carbone: placer les deux tiges de carbone dans l'appareil de revêtement, avec une tige (sur la gauche) aiguisée à un bout point. La tige d'autres (à droite) a une surface plane et entrer en contact avec la pointe du point de celui de la face de side. B) Placer une petite quantité de graisse à vide d'un côté d'une lame de verre encouragée. La zone dans le cadre noir a graisse à vide. C) Installation des grilles pour le revêtement. Les lames de verre sont utilisés pour maintenir le papier en position. La flèche indique la zone avec de la graisse à vide. D) Après le revêtement, la couleur de la lame avec de la graisse à vide couvertes ne change pas la couleur. Le contraste indique l'épaisseur de carbone revêtu.
Figure 3. Illustrant la procédure de coloration négative. A) fraîchement préparés (à gauche) solution de formiate d'uranyle est transparent, sans signe de précipités. Après 1 ~ 2 semaines, commencer à accumuler des précipités dans le fond dans le fond du tube. B) Placez deux gouttes (~ 25 pi) d'eau distillée et deux gouttes de solution de formiate d'uranyle dans un morceau de parafilm. Utilisez une paire d'anti-capillarité pince pour tenir une lueur déchargée recouvert de carbone grille de EM avec le côté de carboneen place. Une goutte d'échantillon (~ 2μl) est placé dans la grille. C) Après une attente de 30 secondes, éponger la solution avec un papier filtre. D) Retourner la grille de toucher le côté de l'échantillon de la grille avec la première goutte d'eau. Répétez l'étape C et D pour terminer le processus de coloration.
Figure 4. Exemples de EM images d'échantillons de protéines colorées négativement. Un ferritine) Cheval rate, B) fragment de liaison à l'antigène (Fab), C) 20S du protéasome archées et D) nucléosome. Toutes les images ont été enregistrées avec le même grossissement. La barre d'échelle est 20nm.
Discussion
Coloration négative EM est un outil puissant qui peut être utilisé pour étudier les structures 3D des échantillons protéine purifiée, comme l'utilisation aléatoire d'inclinaison conique 8 méthode, qui nécessite la collecte d'une paire d'images avec un échantillon provenant inclinée à 60 ° et un de la même zone mais non incliné, pour calculer les reconstructions 3D des complexes macromoléculaires. De plus, une coloration négative EM peut avoir de nombreuses autres applications, telles que le dépistage de deux dimensions (2D) des cristaux de 9 protéines membranaires, la visualisation des complexes de protéines dans différentes conformations 10, ou tout simplement pour la visualisation de l'homogénéité et / ou de l'hétérogénéité des échantillons purifiés protéines ainsi fournir des rétroactions à améliorer les procédures de purification des protéines, etc Il peut être un test puissant pour biochimistes. Dans cet article, nous avons présenté les protocoles allant de la préparation des grilles recouvert de carbone à la collecte des images de façon négative échantillons de protéines colorées en un microscope électronique. Comme illustré ici,la procédure est assez simple et facile à suivre. Si vous essayez de calculer les reconstructions 3D de l'échantillon observé par la méthode d'inclinaison aléatoire conique, il est nécessaire d'acquérir des images paires d'inclinaison. Cependant, si on effectue l'analyse des particules unique est le but, les multiples images Untilted suffira. Dans les deux cas, le traitement d'image supplémentaire est nécessaire et cela dépasse le cadre de cet article vidéo.
Comme avec n'importe quelle méthode, il ya des variations à ces protocoles. Formiate d'uranyle fonctionne très bien en tant que réactif à coloration négative dans la plupart des cas. Acétate d'uranyle est un autre réactif couramment utilisé coloration négative. Il fonctionne très similaire que le formiate d'uranyle, mais avec une taille de grain et, dans de nombreux cas, un contraste plus faible que le formiate d'uranyle. L'avantage d'utiliser l'acétate d'uranyle est que la solution dure plus longtemps que le formiate d'uranyle. On n'a pas besoin de préparer une solution fraîche chaque semaine un ou deux. Formiate et l'acétate d'uranyle deux sont acides. Une préoccupation évidente est que lesfaible pH pourrait induire des changements dans l'échantillon de protéine étudiée. Les deux solutions fonctionnent aussi comme des taches de fixateurs de protéines. Une étude antérieure a montré que les deux échantillons de protéines réparer au plus vite 7. Cette fixation rapide rend le faible pH moins important. Pendant le processus de coloration, un échantillon de la protéine se fixe avant le faible pH peut induire des changements. Néanmoins, d'autres négatifs réactifs tache, tels que le molybdate d'ammonium et l'acide phosphotungstique, peuvent donner de meilleurs résultats pour la coloration des échantillons lorsque le pH faible est une préoccupation 7. Molybdate d'ammonium et l'acide phosphotungstique avoir un pH approximativement neutre, mais le contraste des échantillons de protéines produites par ces taches est généralement inférieure à formiate d'uranyle.
Disclosures
Pas de conflits d'intérêt déclarés.
Acknowledgments
Travaux microscopie électronique à Cheng de laboratoire est en partie le soutien par des subventions du NIH (1R01GM082893, 1R01GM098672, 1S10RR026814-01 et P50GM082250 (à A. Frankel)), et une subvention du Programme de recherche UCSF percée biomédicale, le Prix des Débouchés et de New Technology Award.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Collodion | Electron Microscopy Sciences | 12620-30 | 30ml, 2% in Amyl Acetate |
| Gilder Cu grids | Ted Pella, Inc. | G400/G200 | 400/200 mesh |
| Cressington 208C High Vaccume Turbo Carbon Coater | Ted Pella, Inc. | 9260 | |
| Double pointed Carbon rod | Ted Pella, Inc. | 58 | |
| Uranyl formate | Electron Microscopy Sciences | 16984-59-1 | 99.9% purity |
| PELCO easiGlow GlowDischarge system | Ted Pella, Inc. | 91000 | Purchase at local pharmacy |
| Whatman #1 Filter paper | Fisher Scientific | 09-805E |
References
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