Summary
नकारात्मक दाग इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी (EM) द्वारा Visualizing प्रोटीन के नमूने एक लोकप्रिय संरचनात्मक विश्लेषण पद्धति बन गया है. यह मात्रात्मक संरचनात्मक विश्लेषण के लिए उपयोगी है, जैसे अध्ययन किया जा रहा है अणुओं के एक 3D पुनर्निर्माण की गणना, और भी प्रोटीन की तैयारी की गुणवत्ता के गुणात्मक परीक्षा के लिए. इस अनुच्छेद में हम EM ग्रिड की तैयारी, नमूना धुंधला हो जाना और एक इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोप में नमूना visualizing के लिए विस्तृत प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं. नौसिखिया उपयोगकर्ताओं के इन प्रोटोकॉल का पालन करें और आसानी से उपयोग करने के लिए नकारात्मक EM एक नियमित परख के रूप में दाग, अन्य जैव रासायनिक assays के लिए इसके अलावा में अपने प्रोटीन के नमूने का मूल्यांकन करने के लिए कर सकते हैं.
Abstract
एकल कण इलेक्ट्रॉन (EM) दोनों नकारात्मक दाग या जमी हाइड्रेटेड जैविक नमूनों के माइक्रोस्कोपी, संरचनात्मक 1 जीव विज्ञान में एक बहुमुखी उपकरण बन गया है. हाल के वर्षों में, इस विधि प्रोटीन और macromolecular परिसरों 2, 3 की संरचना का अध्ययन करने में बड़ी सफलता हासिल की है. इलेक्ट्रॉन (cryoEM) cryomicroscopy, जिसमें जमी हाइड्रेटेड प्रोटीन के नमूने शीशे 4 बर्फ की एक पतली परत में एम्बेडेड रहे हैं के साथ तुलना में, नकारात्मक धुंधला हो जाना एक सरल नमूना तैयारी विधि जिसमें प्रोटीन के नमूने सूखे भारी धातु नमक की एक पतली परत में एम्बेडेड रहे हैं वृद्धि नमूना विपरीत 5. नकारात्मक दाग बढ़ाया विपरीत EM अपेक्षाकृत छोटे जैविक नमूनों की जांच की अनुमति देता है. तीन आयामी (3 डी) प्रोटीन या प्रोटीन परिसरों 6 शुद्ध संरचना का निर्धारण करने के अलावा, इस पद्धति बहुत व्यापक उद्देश्यों के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. उदाहरण के लिए, नकारात्मक EM दाग आसानी से हो सकता है शुद्ध कल्पना इस्तेमाल किया जा सकता हैप्रोटीन के नमूने, इस तरह की विविधता एकरूपता / नमूना, प्रोटीन परिसरों या बड़े विधानसभाओं के गठन, या बस एक प्रोटीन तैयार की गुणवत्ता का मूल्यांकन करने के लिए के रूप में जानकारी प्राप्त करने.
इस वीडियो लेख में, हम एक EM का उपयोग नकारात्मक दाग प्रोटीन नमूना निरीक्षण के लिए कार्बन लेपित ग्रिड की तैयारी नकारात्मक EM 120kV तेजी वोल्टेज में संचालित एक इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोप में नकारात्मक दाग नमूना के छवियों को प्राप्त के दाग से के लिए एक पूरा प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं. ये प्रोटोकॉल हमारी प्रयोगशाला में नियमित रूप से इस्तेमाल किया गया है और नौसिखिया उपयोगकर्ताओं द्वारा आसानी से पीछा कर सकते हैं.
Protocol
1. EM ग्रिड के कार्बन कोटिंग के लिए तैयार
- आसुत जल के साथ एक बड़ा गिलास बीकर भरें.
- एक गिलास विंदुक प्रयोग के लिए पानी की सतह पर कोलाइडयन (~ 20μl amyl एसीटेट में 2%, इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी विज्ञान, फिलीस्तीनी अथॉरिटी, संयुक्त राज्य अमरीका) की एक बूंद बूंद के लिए. कोलाइडयन पानी / हवा सतह पर एक प्लास्टिक की पतली परत के रूप में फैल जाएगा, नोट: कोलाइडयन का एक प्रथम ड्रॉप करने के लिए किसी भी धूल कणों से पानी की सतह को साफ करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. फिल्म की पहली बूंद से हटाने के बाद, पानी की सतह धूल के स्पष्ट है.
- EM ग्रिड, 400 या 200 जाल चमकानेवाला घन टेड पेला (यूएसए) इंक, एक प्लास्टिक की परत पर पानी की सतह पर तैरते द्वारा एक से खरीदा ग्रिड प्लेस, हम आम तौर पर 50 जगह ~ चमकदार के साथ एक करीबी पैकिंग पैटर्न में 100 ग्रिड प्लास्टिक की परत (छवि 1A) में नीचे का सामना करना पड़ रहा ग्रिड की ओर. नोट: 400 जाल ग्रिड दिनचर्या नकारात्मक दाग EM ग्रिड के लिए अच्छा कर रहे हैं, जबकि 200 मेष ग्रिड झुकाव जोड़ी छवियों को इकट्ठा करने के लिए अच्छा कर रहे हैं.
- काटें एक पाईक्षेत्र है जहां ग्रिड प्लास्टिक की परत पर रखा जाता है की तुलना में थोड़ा बड़ा आयाम के साथ कागज के CE. कागज ध्यान से ग्रिड (छवि 1B) के शीर्ष पर, प्लेस और इंतजार जब तक कागज पूरी तरह से गीला (छवि 1C) हो जाता है. नोट: कागज के विभिन्न प्रकार के विभिन्न जल अवशोषण की दर है. यह महत्वपूर्ण है कि कागज पानी भी तेजी से अवशोषित नहीं करता है. उदाहरण के लिए, इस उद्देश्य के लिए नियमित रूप से फिल्टर पेपर अच्छा है क्योंकि यह पानी भी तेजी से अवशोषण और झुर्रियों के एक बहुत बनाता है नहीं है. कार्बन फिल्म की झुर्रियों वाली होती है कागज से बने फ्लैट नहीं है, और इस प्रकार यादृच्छिक शंक्वाकार झुकाव 3D पुनर्निर्माण के लिए झुकाव जोड़ी छवियों को इकट्ठा करने के लिए अच्छा नहीं है. एक अलग कागजात का परीक्षण करने के लिए एक उपयुक्त एक मिल गया है. हमारी प्रयोगशाला में, हम स्थानीय किराने की दुकान से खरीदा notepads से किया गया है कागजात का उपयोग कर. कभी कभी अखबार के कागज भी उपयुक्त हो पाया था. एक अन्य विकल्प के रिश्तेदार मोटी चावल चीनी / जापानी सुलेख के लिए इस्तेमाल कागज का उपयोग करने के लिए है.
- तेजी से चारों ओर प्लास्टिक की फिल्म पर चीरों बनाने के लिए और बंद करने केलथपथ कागज. तुरंत बाद, संदंश की एक जोड़ी का उपयोग करने के लिए प्लास्टिक की फिल्म और कागज के बीच sandwiched ग्रिड के साथ कागज लेने. हवा (छवि 1D) सुखाने के लिए ऊपर का सामना करना पड़ ग्रिड के साथ एक पेट्री डिश में कागज प्लेस, नोट: यह महत्वपूर्ण है कि कागज हवा के शुष्क चलो. सुखाने भी तेजी से अखबार में कई झुर्रियाँ उत्पन्न.
2. कार्बन कोटिंग ग्रिड
- हमारी प्रयोगशाला में प्रयोग किया जाता कार्बन कोटिंग मशीन एक Cressington 208C उच्च वैक्यूम टर्बो कार्बन coater (टेड पेला) है. हमारी प्रणाली Cressington फिल्म मोटाई की निगरानी, जो कि एक क्वार्ट्ज क्रिस्टल की oscillating आवृत्ति इसकी सतह पर जमा फिल्म के द्रव्यमान से बदल रहा है लेपित कार्बन सिद्धांत पर आधारित फिल्म की मोटाई उपाय के साथ सुसज्जित है. हालांकि, प्रोटोकॉल यहाँ वर्णित मोटाई की निगरानी की आवश्यकता नहीं है, क्योंकि यह अक्सर हर प्रयोगशाला में उपलब्ध नहीं है.
- (टेड पेला) चोखा और लोड कार्बन छड़ का उपयोग कार्बन कोटिंग मीटर में एक कार्बन रॉड पैनापनachine (छवि 2A). एक दूसरे के खिलाफ एक तेज और एक फ्लैट अंत के साथ टिप अन्य के साथ दो, छड़ रखा जाता है.
- एक गिलास स्लाइड के पाले सेओढ़ लिया क्षेत्र के आधे पर वैक्यूम तेल लागू है और यह ग्रिड (छवि 2B) के लिए अगले जगह. पाले सेओढ़ लिया गिलास स्लाइड के क्षेत्र का केवल आधा वैक्यूम तेल के साथ कवर किया जाना चाहिए. नोट: वैक्यूम तेल के साथ क्षेत्र का रंग कार्बन कोटिंग के बाद नहीं बदल जाएगा. के साथ और बिना वैक्यूम तेल आसन्न क्षेत्रों के बीच विपरीत लेपित कार्बन की मोटाई के एक अनुमान प्रदान करता है.
- कार्बन कोटिंग मशीन के मंच पर ग्रिड के साथ कागज रखें. गिलास स्लाइड ग्रिड (छवि 2C) के बगल में रखें. नोट: एक भी पहली हस्तांतरण एक गिलास स्लाइड के लिए प्लास्टिक की फिल्म के साथ लेपित ग्रिड कोटिंग से पहले कर सकते हैं मामले में कई ग्रिड कागज से गिर.
- निर्वात चैम्बर पम्प, और इंतजार जब तक वैक्यूम 10 Torr -5 के एक स्तर तक पहुँचता है. नोट: कम वैक्यूम के साथ कोटिंग अक्सर कई स्पार्क्स उत्पन्न करता है, पर कई बड़े कार्बन कणों के परिणामस्वरूपग्रिड.
- वर्तमान बहुत धीरे धीरे बढ़ाएँ. पहले कार्बन छड़ी के तेज टिप और तब वर्तमान बढ़ जाती है के रूप में सफेद लाल हो जाएगा. नग्न आंखों के साथ सीधे उच्च चमक टिप घड़ी नहीं है. वर्तमान बढ़ती है जब कोटिंग शुरू करना बंद करो. गिलास स्लाइड से सफेद रंग बदलने के लिए और फिर अंधेरे ग्रे ग्रे प्रकाश होगा. स्लाइड्स के अंधेरे कार्बन फिल्म लेपित किया जा रहा है की मोटाई संबद्ध करता है. वर्तमान बंद कोटिंग रोकने जब इच्छित मोटाई हासिल किया गया है (छवि 2 डी). नोट: 1) दोहराया कार्बन कोटिंग प्रक्रियाओं, गिलास घंटी जार के अंदर से लेपित कार्बन के बाद उसका रंग काला कर सकता है. इससे लेपित कार्बन फिल्म मोटा की तुलना में यह वास्तव में दिखाई देते हैं. 2) एक तेज कार्बन रॉड कई कोटिंग के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. टिप के तीखेपन प्रत्येक कोटिंग के बाद धीरे - धीरे कम है. अधिकतम वर्तमान कार्बन रॉड के तीखेपन से प्रभावित है. छोटे व्यास के साथ एक ताजा तेज छड़ी एक रिश्तेदार कम की आवश्यकताकार्बन लुप्त हो जाना करने के लिए वर्तमान. बाद में थोड़ा उच्च वर्तमान कोटिंग की आवश्यकता हो सकती है.
- निर्वात चैम्बर वेंट और बाद में उपयोग के लिए लेपित ग्रिड को हटा दें.
नोट 1. एक फिल्म मोटाई की निगरानी का उपयोग करके कार्बन मोटाई को नियंत्रित करने के लिए और अधिक सटीक तरीका है. या एक गुणात्मक सटीक मॉनिटर द्वारा मापा मोटाई के खिलाफ रंग जांचना कर सकते हैं. इस तकनीक के लिए एक उपयोगी कार्बन मोटाई 3 और 7 के बीच एनएम है.
यह एक सरल और आसान कार्बन लेपित ग्रिड की एक बड़ी मात्रा में तैयार करने की विधि है, आमतौर पर तैयारी प्रति 100 ग्रिड ~. ग्रिड एक प्लास्टिक की पतली परत है, जो आम तौर पर नकारात्मक दाग छवि की गुणवत्ता को प्रभावित नहीं करता है होते हैं. हालांकि, इस विधि में तैयार ग्रिड cryoEM के लिए उपयुक्त नहीं हैं. प्लास्टिक की यह परत क्लोरोफॉर्म में कई घंटे के लिए ग्रिड को भिगोने द्वारा हटाया जा सकता है है.
3. नकारात्मक के लिए uranyl formate समाधान (0.75%) की तैयारी EM दाग. विस्तृत प्रोटोकॉल था5 पहले वर्णित
- बाहर एक छोटे से बीकर में uranyl formate के 37.5mg वजन;
- 5 मिलीलीटर उबलते पानी जोड़ें और अंधेरे में 5 मिनट के लिए हलचल;
- 10μl 5M NaOH जोड़ें, 5 मिनट के लिए हलचल करने के लिए जारी;
- एक सिरिंज फिल्टर (Fisherbrand, 13mm सिरिंज फिल्टर, 0.2μm, नायलॉन गैर बाँझ, सूची 09-720-5 संख्या) का उपयोग कर समाधान फ़िल्टर, और एक 8ml फाल्कन ट्यूब एल्यूमीनियम पन्नी के साथ कवर में फ़िल्टर समाधान की दुकान;
नोट Formate Uranyl. पाउडर इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी (Hatfield, फिलीस्तीनी अथॉरिटी) विज्ञान, सूची संख्या 22451 से खरीदा जा सकता है है . Uranyl formate समाधान प्रकाश के प्रति संवेदनशील है और प्रत्यक्ष प्रकाश से दूर रखा जाना चाहिए, एल्यूमीनियम पन्नी के साथ कवर फाल्कन ट्यूब द्वारा उदाहरण के लिए. हौसले से तैयार समाधान एक हल्के पीले रंग (छवि 3A) है. दाग समाधान एक से दो सप्ताह के लिए बेंच पर रखा जा सकता है पहले यह precipitating शुरू होता है. Uranyl formate एक ~ 4 पीएच के साथ अम्लीय है. जोड़ना NaOH पीएच बढ़ जाती है, लेकिन यह बहुत जल्दी से जोड़नेया अधिक में वेग के लिए दाग हो सकता है. इसके विपरीत पैदा करने के लिए इसके अलावा में, uranyl formate भी प्रोटीन नमूना को हल करता है. क्योंकि निर्धारण की दर इतनी तेजी से है, कम पीएच में आम तौर पर समग्र प्रोटीन रचना या प्रोटीन जटिल 7 गठन को प्रभावित नहीं करता है.
4. नकारात्मक दाग ग्रिड EM तैयार करने के लिए प्रोटोकॉल. इस प्रोटोकॉल में विस्तार से वर्णित किया गया था 5 पहले
- चमक निर्वहन कार्बन लेपित ग्रिड, PELCO easiGlow GlowDischarge प्रणाली (टेड पेला इंक, संयुक्त राज्य अमरीका) का उपयोग. इस्तेमाल किया वर्तमान है 15 मा ग्रिड और 30 सेकंड के लिए छुट्टी चमक चमक - छुट्टी ग्रिड के बाद शीघ्र ही चमक निर्वहन किया जाना चाहिए.. हम अक्सर चमक छुट्टी के बाद कम से कम 2 घंटे में ग्रिड का उपयोग करें.
- आसुत जल प्लेस के दो 20μl बूँदें और parafilm के एक टुकड़े पर दो uranyl formate समाधान के 25μl बूँदें (3B छवि).
- कार के साथ एक चमक छुट्टी रिवर्स - विरोधी बल केशिका संदंश का उपयोग ग्रिड पकड़ोबॉन - लेपित पक्ष को सामना करना पड़ रहा. नोट: यह विरोधी केशिका संदंश का उपयोग करने के लिए आवश्यक है. अन्यथा, तरल नमूना संदंश के बीच केशिका बल द्वारा ग्रिड से दूर चूसा होगा.
- चमक - छुट्टी ग्रिड 2μl प्रोटीन नमूने लागू है, और 30 सेकंड के लिए प्रतीक्षा करें. नोट: प्रतीक्षा समय और चमक निर्वहन की लंबाई ग्रिड में adsorbed प्रोटीन की एकाग्रता को प्रभावित करते हैं. बहुत पतला नमूने अब सोखना समय की आवश्यकता है. बहरहाल, लंबे समय तक सोखना के बाद से पानी वाष्पकणों बफर एकाग्रता बदल सकते हैं. ग्रिड में एक उचित कण वितरण को प्राप्त करने के लिए कुछ हद तक परीक्षण और त्रुटि दृष्टिकोण की आवश्यकता है.
- फिल्टर पेपर का उपयोग नमूना ब्लाट.
- एक पानी की बूंद के लिए ग्रिड सतह को छूने के लिए और फिर से पानी फिल्टर पेपर के साथ दाग. पानी की 2 बूंद के साथ दोहराएँ.
- दाग संक्षिप्त के पहले ड्रॉप करने के लिए ग्रिड सतह टच करें. फिल्टर पेपर के साथ दाग समाधान ब्लाट.
- 20 सेकंड के लिए दाग की दूसरी ड्रॉप करने के लिए ग्रिड सतह को टच करें. ब्लाट ओएफएफ फिल्टर पेपर के साथ दाग समाधान.
- एक निर्वात का उपयोग ग्रिड सूखी. नोट: एक भी बेंच पर या शुष्क हवा करने के लिए एक रासायनिक हुड में ग्रिड को छोड़ सकते हैं. शुष्क वैक्यूम के लाभ यह है कि एक EM में ग्रिड तुरंत पालन कर सकते हैं. संभव जल्दी सूख द्वारा उत्पन्न artifact के दाग असमान है.
5. ट्रांसमिशन इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोप
- इस प्रदर्शन में इस्तेमाल सूक्ष्मदर्शी Tecnai (फी कंपनी) T12 Gatan 4K एक्स 4K सीसीडी कैमरे के साथ सुसज्जित है.
- संक्षेप में नमूना डालने से पहले माइक्रोस्कोप के संरेखण की जाँच करें, नोट: यह केवल EM प्रति एक बार सत्र की जरूरत है. एक मॉडल माइक्रोस्कोप में, पास सही संरेखण पहले बचाया जा सकता है. इस तरह के एक संरेखण फ़ाइल लोड हो रहा है एक के पास सही हालत के लिए खुर्दबीन के संरेखण को पुनर्स्थापित करना चाहिए.
- एकल झुकाव मानक नमूना धारक में EM ग्रिड लोड.
- T12 के CompuStage में धारक डालें. पम्पिंग चक्र के लिए रुको पूरा करने के लिए.
- स्तंभ में धारक डालें. </ Li>
- नमूना फोकस और एक वांछित defocus, आमतौर पर 1.5um सेट. नोट: ध्यान केंद्रित मैन्युअल रूप से न्यूनतम विपरीत पद्धति का उपयोग करके ध्यान केंद्रित है या सीसीडी कैमरा का उपयोग करने के लिए रहते हैं छवियों पर कब्जा करने और जीना फूरियर सत्ता स्पेक्ट्रम की गणना के द्वारा या तो हासिल कर सकते हैं.
- एक सीसीडी कैमरे का उपयोग कर छवि रिकार्ड;
- नकारात्मक दाग प्रोटीन के नमूने की छवियों में, प्रोटीन अक्सर सफेद विपरीत, अर्थात् एक गहरे रंग की पृष्ठभूमि के खिलाफ सफेद घनत्व के साथ देखा जाता है. ध्यान दें कि जबकि एक ही ग्रिड के विभिन्न क्षेत्रों में प्रोटीन सांद्रता आमतौर पर काफी समान हैं, एक ही ग्रिड के विभिन्न क्षेत्रों में दाग के विभिन्न स्तरों का निरीक्षण करता है. कभी कभी क्षेत्रों असमान धुंधला हो जाना या भी सकारात्मक धुंधला (प्रोटीन एक प्रकाश पृष्ठभूमि पर अंधेरा दिखाई देता है) है, जबकि कुछ अन्य क्षेत्रों सही दाग सकता है. यह अक्सर करने के लिए ग्रिड को खोज करने के लिए इमेजिंग के लिए एक अच्छा क्षेत्र का पता लगाने के लिए आवश्यक है.
6. प्रतिनिधि परिणाम
नकारात्मक स्टेशन के विशिष्ट अच्छा छवियों के उदाहरणined नमूने, घोड़े तिल्ली (4A चित्रा) ferritin, फैब (4B छवि), एंटीबॉडी (छवि 4C) और nucleosome (छवि 4D) archaeal 20S, दिखाए जाते हैं.
चित्रा 1. नकारात्मक के लिए कार्बन लेपित ग्रिड की तैयारी EM दाग. EM रखकर कोलाइडयन फिल्म की सतह पर एक बंद पैकिंग पैटर्न में एक से एक ग्रिड). बी) ग्रिड के क्षेत्र की तुलना में थोड़ा बड़ा कागज का एक टुकड़ा दे. सी) रुको जब तक कागज पूरी तरह से गीला हो जाता है. डी) हवा सुखाने के लिए ग्रिड के साथ एक साथ कागज उठाओ.
चित्रा 2. कोटिंग उपकरण में एक छड़ी (बाईं ओर) एक बिंदु टिप करने के लिए तीव्रता के साथ दो जगह कार्बन छड़, कोटिंग कार्बन के साथ EM ग्रिड) कार्बन बाष्पीकरण सेटअप. अन्य रॉड (सही पर) एक फ्लैट सतह है और बिंदु एक के विपरीत में टिप के साथ संपर्क में आते हैंआईडीई. बी) एक बढ़ावा गिलास स्लाइड का एक पक्ष में वैक्यूम तेल की एक छोटी राशि रखें. काले फ्रेम के भीतर क्षेत्र वैक्यूम तेल है. सी) कोटिंग के लिए ग्रिड सेटअप. कांच स्लाइड की स्थिति में कागज पकड़ करने के लिए उपयोग किया जाता है. arrowhead वैक्यूम तेल के साथ क्षेत्र में अंक. डी) कोटिंग के बाद, कवर वैक्यूम तेल के साथ स्लाइड की रंग रंग बदल नहीं करता है. इसके विपरीत लेपित कार्बन की मोटाई इंगित करता है.
चित्रा 3. नकारात्मक धुंधला प्रक्रिया ए) illustrating. हौसले से तैयार (बाएं) uranyl formate समाधान precipitates के हस्ताक्षर के बिना पारदर्शी है . 1 ~ 2 सप्ताह के बाद precipitates, ट्यूब के नीचे में नीचे में जमते शुरू करते हैं. बी) आसुत जल और parafilm का एक टुकड़ा में uranyl formate समाधान की दो बूँदें (~ 25μl) की दो बूँदें प्लेस. कार्बन पक्ष के साथ चमक छुट्टी कार्बन लेपित EM ग्रिड पकड़ विरोधी केशिका संदंश के एक जोड़ी का उपयोग करेंऊपर. नमूना की एक बूंद (2μl ~) ग्रिड में रखा गया है. सी) 30 सेकंड के लिए प्रतीक्षा के बाद, एक फिल्टर पेपर के साथ समाधान दाग. डी) के लिए पानी की पहली बूंद के साथ ग्रिड ग्रिड के नमूना पक्ष स्पर्श फ्लिप. धुंधला की प्रक्रिया को पूरा करने के लिए कदम सी और डी दोहराएँ.
चित्रा 4. प्रतिजन (फैब) बंधन, सी ए) हार्स तिल्ली ferritin EM नकारात्मक दाग प्रोटीन के नमूने की छवियों के उदाहरण, बी) टुकड़ा) archaeal 20S एंटीबॉडी और डी) nucleosome. सभी छवियों को एक ही बढ़ाई के साथ दर्ज किए गए. पैमाने बार 20nm है.
Discussion
नकारात्मक दाग EM एक शक्तिशाली उपकरण है कि शुद्ध प्रोटीन के नमूने के यादृच्छिक शंक्वाकार झुकाव 8 विधि है, जो नमूना से 60 डिग्री झुका और एक साथ एक ही क्षेत्र से छवियों की एक जोड़ी इकट्ठा की आवश्यकता का उपयोग कर के रूप में 3 डी संरचनाओं का अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है लेकिन untilted, macromolecular परिसरों के 3D पुनर्निर्माण की गणना. इसके अलावा, नकारात्मक धुंधला EM दो आयामी (2d) के झिल्ली 9 प्रोटीन क्रिस्टल के लिए स्क्रीनिंग के रूप में कई अन्य अनुप्रयोगों, है, 10, या बस एकरूपता और / या प्रोटीन नमूना इस प्रकार शुद्ध की विविधता दृश्यमान करने के लिए अलग अलग रचना में प्रोटीन परिसरों visualizing कर सकते हैं प्रोटीन शुद्धीकरण प्रक्रियाओं में सुधार करने के लिए feedbacks प्रदान करने, आदि यह जीव रसायन के लिए एक शक्तिशाली परख किया जा सकता है. इस अनुच्छेद में, हम कार्बन लिपटे एक इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोप में नकारात्मक दाग प्रोटीन के नमूने की छवियों का संग्रह ग्रिड की तैयारी से लेकर प्रोटोकॉल प्रस्तुत किया. जैसा कि यहाँ सचित्र है,प्रक्रिया बजाय सरल और का पालन करने के लिए आसान है. यदि करने के लिए यादृच्छिक शंक्वाकार झुकाव विधि द्वारा मनाया जा रहा है नमूने के 3D पुनर्निर्माण की गणना करने का प्रयास है, यह झुकाव जोड़ी छवियों को प्राप्त करने के लिए आवश्यक है. हालांकि, अगर एकल कण विश्लेषण प्रदर्शन उद्देश्य है, कई untilted छवियों पर्याप्त होगा. दोनों ही मामलों में, आगे इमेज प्रोसेसिंग की आवश्यकता है और यह इस वीडियो लेख के दायरे से परे है.
किसी भी विधि के साथ के रूप में, वहाँ प्रोटोकॉल के लिए बदलाव कर रहे हैं. Uranyl formate ज्यादातर मामलों में एक नकारात्मक दाग अभिकर्मक के रूप में बहुत अच्छी तरह से काम करता है. Uranyl एसीटेट एक और सामान्य रूप से उपयोग किए जाने वाले नकारात्मक दाग अभिकर्मक है. यह बहुत uranyl formate के रूप में इसी तरह काम करता है, लेकिन एक बड़ी अनाज के आकार और कई मामलों में, uranyl formate से कम विपरीत के साथ. uranyl एसीटेट का उपयोग कर के लाभ यह है कि समाधान uranyl formate की तुलना में लंबे समय तक रहता है. एक के हर एक या दो सप्ताह एक ताजा समाधान तैयार करने की जरूरत नहीं है. दोनों uranyl formate और एसीटेट अम्लीय रहे हैं. एक स्पष्ट चिंता का विषय है किकम पीएच प्रोटीन नमूना अध्ययन किया जा रहा में परिवर्तन उत्पन्न कर सकता है. दोनों दाग समाधान भी प्रोटीन fixatives के रूप में कार्य करते हैं. पहले के एक अध्ययन से पता चला है कि दोनों तय प्रोटीन के नमूने जल्दी 7. यह तेजी निर्धारण कम पीएच कम महत्वपूर्ण बनाता है. धुंधला की प्रक्रिया के दौरान एक प्रोटीन नमूना तय हो जाता है है कम पीएच से पहले किसी भी परिवर्तन पैदा कर सकते हैं. फिर भी, अमोनियम molybdate और phosphotungstic एसिड जैसे अन्य नकारात्मक दाग अभिकर्मकों, धुंधला नमूने जब कम pH 7 चिंता का विषय है के लिए बेहतर परिणाम हो सकता है . दोनों अमोनियम molybdate और phosphotungstic एसिड लगभग एक तटस्थ पीएच है, लेकिन प्रोटीन इन दाग द्वारा उत्पन्न नमूने के विपरीत आमतौर पर uranyl formate को नीचा है.
Disclosures
ब्याज की कोई संघर्ष की घोषणा की.
Acknowledgments
चेंग प्रयोगशाला में इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी काम आंशिक रूप से (1R01GM082893, 1R01GM098672, 1S10RR026814-01 और P50GM082250 (ए Frankel)) एनआईएच, और निर्णायक बायोमेडिकल रिसर्च, अवसर पुरस्कार और नई प्रौद्योगिकी पुरस्कार के UCSF कार्यक्रम से एक अनुदान से अनुदान द्वारा समर्थन है.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Collodion | Electron Microscopy Sciences | 12620-30 | 30ml, 2% in Amyl Acetate |
| Gilder Cu grids | Ted Pella, Inc. | G400/G200 | 400/200 mesh |
| Cressington 208C High Vaccume Turbo Carbon Coater | Ted Pella, Inc. | 9260 | |
| Double pointed Carbon rod | Ted Pella, Inc. | 58 | |
| Uranyl formate | Electron Microscopy Sciences | 16984-59-1 | 99.9% purity |
| PELCO easiGlow GlowDischarge system | Ted Pella, Inc. | 91000 | Purchase at local pharmacy |
| Whatman #1 Filter paper | Fisher Scientific | 09-805E |
References
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