Summary
부정적인 얼룩 전자 현미경 (EM)에 의해 머릿속 단백질 샘플은 인기있는 구조적 분석 방법이되었다. 그것은 단백질 준비의 품질의 질적 심사 또한 연구되고있는 분자의 3 차원 재구성을 계산으로 정량 구조 분석에 유용합니다. 이 문서에서 우리는 EM 그리드를 준비 샘플을 염색법과 전자 현미경의 시료를 시각화에 대한 자세한 프로토콜을 제시한다. 초보자 사용자가 쉽게 이러한 프로토콜을 따르 수 있으며, 부정적인 자신의 단백질 샘플을 평가하기위한 다른 생화학 assays 이외에, 일상적인 분석으로 그들을 얼룩 활용합니다.
Abstract
부정적인 얼룩이나 냉동 수산화 생물 학적 샘플 모두 단일 입자 전자 현미경 (EM)는, 구조 생물학 1에서 다재 다능한 도구가되었습니다. 최근에는이 방법은 단백질과 macromolecular의 단지 2, 3의 구조를 공부하고 큰 성공을 이루었습니다. 냉동 수산화 단백질 샘플 유리 얼음 4 얇은 레이어에 포함된되는 전자 cryomicroscopy (cryoEM)와 비교할 때, 부정적인 얼룩은 단백질 샘플을 높이기 위해 건조 중금속 소금의 얇은 레이어에 포함된하는 간단한 샘플 준비 방법입니다 표본 대비 5. 부정적인 얼룩의 향상된 대조 EM은 상대적으로 작은 생물 학적 샘플의 시험을 수 있습니다. 단백질 또는 단백질 단지 6 정화의 입체 (3D) 구조를 결정하는 것 외에도,이 방법은 훨씬 넓은 용도로 사용할 수 있습니다. 예를 들어, 부정적인 EM 쉽게 시각화 정화하는 데 사용할 수있는 얼룩단백질 샘플, 같은 균질성 / 샘플 이질, 단백질 단지 또는 대형 어셈블리의 형성, 또는 단순히 단백질 준비의 품질을 평가 등의 정보를 획득.
이 비디오 문서에서, 우리는 120kV 가속 전압에서 작동 전자 현미경에 부정적인 스테인드 샘플의 이미지를 취득하기 위해 그들을 얼룩 부정을위한 탄소 코팅 그리드를 준비부터, 부정적인 스테인드 단백질 샘플을 관찰하기 위해 그들을 사용하기위한 완전한 프로토콜을 제시한다. 이러한 프로토콜은 일상적으로 우리 연구실에서 사용되었습니다 쉽고 초보자 사용자가 다음 수 있습니다.
Protocol
1. 탄소 코팅을위한 EM 격자의 준비
- 증류수와 대형 유리 비커를 입력합니다.
- 물의 표면에 콜로디온 (~ 20μl, 아밀 아세테이트 2 %, 전자 현미경 과학, PA, 미국)의 한 방울을 떨어뜨 유리 피펫을 사용합니다. 콜로디온 물 / 공기 표면에 얇은 플라스틱 레이어를 형성 확산 것이다; 참고 : 콜로디온의 첫 번째 드롭은 어떤 먼지 입자에서 수면을 취소하는 데 사용할 수 있습니다. 첫 번째 드롭에서 필름을 제거 후, 물 표면은 먼지가 분명하다.
- 그들에게 격자, 테드 펠라 주식 회사 (미국), 물 표면에 떠있는 플라스틱 레이어에 하나 하나에서 구입한 400 200 메쉬 도금사 세제곱 격자 장소, 우리는 일반적으로 장소 50 반짝 이는와 가까운 포장 패턴 ~ 100 격자, 플라스틱 레이어 (그림 1A)에 아래로 직면하고있는 격자의 측면. 참고 : 400 메쉬 격자가 일상 부정적인 얼룩 EM의 격자에 좋은 200 메쉬 격자는 틸트 쌍 이미지를 수집하기 위해 좋은 반면.
- 파이를 잘라격자가 플라스틱 레이어에 배치되는 지역보다 약간 큰 크기로 종이 CE. 그리드 (그림의 1B)의 상단에 조심스럽게 종이를 놓고, 그리고 종이 (그림 1C) 서부 유럽 표준시 완전히 될 때까지 기다립니다. 참고 : 용지의 종류가 다른 물 흡수 률이 있습니다. 종이가 너무 빨리 물을 흡수하지 않는 것이 중요합니다. 너무 빨리 물을 흡수하고 주름을 많이하기 때문에 예를 들어, 정기적으로 필터 종이는이 목적을 위해 좋지 않습니다. 주름 종이로 만든 탄소 필름 따라서 임의의 원추형 경사 3 차원 재구성을위한 틸트 쌍 이미지를 수집하기 위해 좋지 않은 평면 아니합니다. 하나는 적합한 하나를 찾기 위해 다른 논문을 테스트하고 있습니다. 저희 연구실에서는, 우리는 지역 식료품 가게에서 구입한 notepads에서 신문을 사용했습니다. 때로는 신문 용지도 적합한 것으로 판명되었다. 또 다른 옵션은 중국 / 일본 서예에 사용되는 상대적으로 두꺼운 쌀 종이를 사용하는 것입니다.
- 신속하게 주변에 플라스틱 필름에 incisions을 만들고 주변젖었 종이. 즉시 나중에, 플라스틱 필름과 종이 사이에 끼워 넣으면 격자로 종이를 데리러 포셉 한 쌍의을 사용합니다. 공기 건조 (그림의 1D)에 직면하고있는 격자와 배양 접시에 종이 장소; 참고 : 이것은 종이가 공기 건조하게하는 것이 중요합니다. 건조가 너무 빨리 신문에 많은 주름을 생성합니다.
2. 탄소 코팅 격자
- 저희 연구실에서 사용되는 탄소 코팅 기계 Cressington 208C 높은 진공 터보 탄소 Coater (테드 펠라)입니다. 우리 시스템은 석영 크리스탈의 진동 주파수가 그 표면에 입금 영화의 질량에 의해 변경되는 원리에 따라 코팅된 탄소 필름의 두께를 측정 Cressington 필름 두께 모니터를 갖추고 있습니다. 그러나 프로토콜은 모든 연구실에 자주 사용할 수 없습니다 있기 때문에, 두께 모니터를 필요로하지 않습니다 여기에 설명되어 있습니다.
- 탄소 코팅 m에 숫돌 (테드 펠라)와 부하 탄소 봉을 사용하여 탄소 막대를 선명하게achine (그림 2A). 평면 엔드와 날카로운 팁 그리고 다른 두 막대, 하나는 서로 배치됩니다.
- 유리 슬라이드의 프로스트 지역의 절반에 진공 그리스를 적용하고 격자 (그림 2B) 옆에 그것을 놓으십시오. 유리 슬라이드의 프로스트 지역의 절반 밖에이 진공 기름으로 덮여 있어야합니다. 참고 : 진공 그리스와 지역은 탄소 코팅 후 색상을 변경할 수 없습니다. 진공 그리스와 인접하지 않고 지역 사이의 대조 코팅 탄소의 두께의 견적을 제공합니다.
- 탄소 코팅 기계의 무대에서 격자와 함께 종이를 놓습니다. 격자 (그림 2C) 옆에있는 유리 슬라이드를 놓습니다. 참고 : 하나는 또한 유리 슬라이드에 플라스틱 필름으로 코팅 첫째 전송 격자가 코팅하기 전에, 경우에 많은 격자가 용지에서 떨어질 수 있습니다.
- 진공 챔버를 펌프 및 진공 10 -5 토르의 수준에 도달할 때까지 기다립니다. 참고 : 코팅 낮은 진공과 함께 자주에 많은 큰 탄소 입자로 인한 많은 스파크를 생성그리드.
- 매우 느리게 전류를 늘립니다. 탄소 봉의 날카로운 끝을 먼저 현재의 증가 흰색 다음 빨간색이 될 것입니다. 직접 육안으로 높은 밝기 팁을 볼하지 마십시오. 코팅이 시작될 때 현재 증가하고 중지합니다. 유리 슬라이드 회색 그리고 짙은 회색 불을 흰색의 색상을 변경합니다. 슬라이드의 어둠이 코팅되는 탄소 필름의 두께를 연결합니다. 원하는 두께는 (그림 2D) 달성되었을 때 코팅을 막을 수있는 현재 꺼. 주 : 1) 반복되는 탄소 코팅 프로세스, 유리 벨 병의 안쪽에서 코팅된 탄소 후 어둡게는 색상 수 있습니다. 이것은 코팅 탄소 필름은 그것이 실제보다 두꺼운 나타날 수 있습니다. 2) 하나의 둘레에 탄소 막대는 여러 코팅에 사용될 수 있습니다. 팁의 선명도는 서서히 각 도장 이후 줄어 듭니다. 최대 전류는 탄소 막대의 선명도에 의해 영향을받습니다. 작은 직경 갓 날카롭게로드는 상대적으로 낮은 필요탄소를 증발하는 전류. 나중에 코팅이 약간 더 높은 전류를 필요로 할 수 있습니다.
- 진공 챔버를 환기하고 나중에 사용하기 위해 코팅 격자를 제거합니다.
참고 1. 탄소의 두께를 제어하는보다 정확한 방법은 필름 두께 모니터를 사용하는 것입니다. 아니면 하나는 질적으로 모니터에 의해 측정된 정확한 두께에 대한 색상을 조정할 수있다. 이 기법에 대한 유용한 탄소 두께 3시 사이에 7 NM입니다.
이것은 탄소 코팅 격자의 대량 준비하는 간단하고 쉬운 방법입니다, 보통 준비 당 100 그리드를 ~. 격자는 일반적으로 부정적인 스테인드 이미지의 품질에 영향을주지 않습니다 얇은 플라스틱 레이어를 포함합니다. 그러나,이 방법의 준비 격자는 cryoEM에 적합하지 않습니다. 플라스틱의이 계층은 몇 시간 동안 클로로포름에 그리드를 담글하여 제거할 수 있습니다.
3. 부정에 대한 uranyl의 편대 솔루션 (0.75 %)를 준비하는 것은 그들을 얼룩. 자세한 프로토콜했습니다이전 5 설명한
- 작은 비커에 uranyl의 편대의 37.5mg을 달다;
- 끓는 물에 5 ML을 추가하고 어둠 속에서 5 분간 저어;
- 10μl 5M NaOH를 추가, 5 분 볶음 계속;
- 주사기 필터를 (Fisherbrand, 13mm 주사기 필터, 0.2μm, 나일론이 아닌 살균, 카탈로그 번호 09-720-5)를 사용하여 솔루션을 필터링하고, 알루미늄 호일로 덮여 8ml 팔콘 튜브의 필터링 솔루션을 저장;
참고. Uranyl의 편대 분말은 전자 현미경 과학 (하트 필드, PA), 카탈로그 번호 22451에서 구입할 수 있습니다. Uranyl의 편대 솔루션은 빛을 민감한이며 팔콘 튜브 알루미늄 호일로를 덮고하여 예를 들어, 멀리 직접 빛으로부터 보관해야합니다. 신선한 해결책은 밝은 노란색 컬러 (그림 3A)를하고 있습니다. 이 precipitating 시작하기 전에 얼룩 솔루션은 1-2주에 대한 벤치에 보관하실 수 있습니다. Uranyl의 편대는 산도 ~ 4 산성이다. NaOH의 산도를 증가 추가,하지만 너무 빨리 추가또는 초과 침전물에 얼룩이 발생할 수 있습니다. 콘트라스트를 생성하는 것 외에도, uranyl의 편대는 또한 단백질 샘플을 수정합니다. 고정 속도가 너무 빠른 속도이기 때문에, 낮은 산도는 일반적으로 전체 단백질 conformations 또는 단백질 복잡한 형성 7에 영향을주지 않습니다.
4. 부정적인 얼룩 EM 격자를 준비 프로토콜. 이 프로토콜은 이전에 다섯 자세히 설명했다
- PELCO easiGlow GlowDischarge 시스템 (테드 펠라 주식 회사, 미국)를 사용하여 글로우 방전 탄소 코팅 그리드. 사용되는 전류는 15 mA 및 격자는 30 초.주의에 대한 면제 글로우 점입니다. 발광 - 배출 격자가 곧 글로우가 배출 후 사용해야합니다. 우리는 종종 글로우 방전 후 채 2 시간 그리드를 사용합니다.
- 장소 증류수 20μl 두 방울과 parafilm의 조각에 uranyl의 편대 솔루션의 두 25μl 방울 (그림 3B).
- 자동차와 함께 리버스 강제 안티 모세 집게를 사용하여 형광 방전 그리드를 잡고봉 - 코팅 사이드가 마주보고. 참고 : 안티 모세 집게를 사용하는 데 필요한 그것입니다. 그렇지 않으면, 액체 샘플 포셉 사이의 모세관 힘에 의해 떨어져 격자에서 빨려 것입니다.
- 형광 배출 그리드 2μl 단백질 샘플을 신청하고, 30 초 기다립니다. 참고 : 대기 시간과 글로우 방전의 길이가 격자에 adsorbed 단백질의 농도에 영향을 미칩니다. 매우 희석 샘플 더 이상 흡착 시간을 필요로합니다. 그러나, 장기 흡착 물의 증기부터 버퍼 농도를 변경할 수 있습니다. 그리드에 적당한 입자 분포를 달성하기 위해서는 다소 시행 착오 접근 방식이 필요합니다.
- 필터 종이를 사용하여 샘플을 얼룩.
- 물 방울에 그리드 표면을 터치하고 여과지로 물을 내려 점이 되리. 물 2 방울로 반복합니다.
- 얼룩 간단히의 첫 번째 드롭에 그리드 표면을 터치. 필터 종이 얼룩 솔루션을 얼룩.
- 20 초 동안 얼룩의 두 번째 드롭 격자 표면을 터치. 얼룩 O필터 종이 FF 얼룩 솔루션입니다.
- 진공을 사용하여 그리드를 건조시킵니다. 참고 : 하나도 벤치에 또는 공기 건조 화학 후드에 그리드을 남길 수 있습니다. 진공 건조의 장점은 하나가 바로 EM에서 그리드를 관찰 수있다는 것입니다. 빠른 건조에 의해 생성된 가능한 유물은 얼룩이 고르지입니다.
5. 전송 전자 현미경
- 이 예제에 사용되는 현미경 Gatan 4K X 4K CCD 카메라가 장착된 Tecnai T12 (황비홍 회사)입니다.
- 간단히 예제 삽입하기 전에 현미경의 정렬을 확인, 참고 : 이것은 한 번만 EM 당 세션이 필요합니다. 모델 현미경에 가까운 완벽한 정렬은 이전에 저장할 수 있습니다. 이러한 정렬 파일을로드하면 거의 완벽한 상태로 현미경 정렬을 복원해야합니다.
- 단일 기울기 표준 표본 홀더에 EM 격자를로드합니다.
- T12의 CompuStage에 홀더를 삽입합니다. 완료 빨아주기를 기다립니다.
- 칼럼에 홀더를 삽입합니다. </ 리>
- 표본을 집중하고 원하는 defocus, 보통 - 1.5um을 설정합니다. 참고 : 수동으로 포커싱 것은 최소한의 대비 방법을 사용하여 초점을하거나 라이브 이미지를 캡처하고 라이브 퓨리에 파워 스펙트럼을 계산하기 위해 CCD 카메라를 사용하여 어느 얻을 수 있습니다.
- CCD 카메라를 사용하여 이미지를 기록;
- 부정적인 스테인드 단백질 샘플의 이미지에서, 단백질은 주로 흰색 명암, 어두운 배경 즉, 흰색 밀도 볼 수 있습니다. 같은 그리드의 다른 분야에서 단백질 농도는 일반적으로 매우 비슷하면서, 그 중 하나가 같은 그리드의 서로 다른 영역에 얼룩의 다른 수준을 준수 않습니다. 다른 분야 완벽한 얼룩 반면 때로는 지역, 고르지 얼룩 또는 긍정적인 얼룩을 (단백질은 밝은 배경에 어두운 나타납니다)가 수 있습니다. 그것은 종종 이미지를 위해 좋은 장소를 찾을 수있는 그리드를 검색하는 것이 필요합니다.
6. 대표 결과
부정적인 역의 전형적인 좋은 이미지의 예ined 샘플, 말 비장 페리틴 (그림 4A), 팹 (그림 4B), proteasome (그림 4C)과 nucleosome (그림 4D) archaeal 20이 표시됩니다.
그림 1. 부정을위한 탄소 코팅 격자의 준비는 그들을 얼룩. 그들에게 격자 콜로디온 필름의 표면에 폐쇄 포장 패턴에서 한별로 하나를 배치). B) 격자의 면적보다 약간 큰 종이를 배치. 종이가 완전히 서부 유럽 표준시 때까지 C) 기다리십시오. D) 공기 건조에 대한 격자와 함께 종이를 선택하십시오.
그림 2. . 포인트 팁에 날카롭게 한 막대 (왼쪽)와, 코팅 장치에서 개최 두 탄소 막대 : 탄소로 코팅 EM의 격자가) 탄소 증발기를 설치합니다. 다른로드 (오른쪽에서) 평평한 표면을 가지고 있으며, 반대의에있는 하나의 포인트 팁 접촉IDE. B) 육성 유리 슬라이드의 한쪽에 진공 그리스의 작은 금액을 넣으십시오. 검은 프레임 내의 영역은 진공 그리스를하고 있습니다. C) 코팅을위한 그리드를 설치합니다. 유리 슬라이드는 위치에 종이를 개최하는 데 사용됩니다. 화살촉은 진공 그리스와 지역을 가리 킵니다. D) 코팅 후, 적용 진공 그리스와 슬라이드의 색상은 색상을 변경하지 않습니다. 대조 코팅 탄소의 두께를 나타냅니다.
그림 3. 부정적인 얼룩 절차를 설명.)은 신선한 (왼쪽) uranyl의 편대 솔루션 precipitates 흔적없이 투명합니다. 1 ~ 2 주가 지난 후, 튜브의 바닥에 바닥에 축적 시작 precipitates. B) 장소 증류수와 parafilm의 한 부분에서 uranyl의 편대 솔루션의 두 방울 두 방울의 (~ 25μl를). 탄소 사이드와 빛이 배출 탄소 코팅 EM 그리드를 잡아 방지 모세관 포셉 한 쌍의를 사용하여최대. 샘플의 드롭 (~ 2μl)는 격자에 배치됩니다. C) 30 초 동안 대기 후, 필터 종이 솔루션을 얼룩. D) 물의 첫 번째 드롭과 함께 그리드의 샘플 측면을 터치하는 격자를 뒤집기. 얼룩의 프로세스를 완료하는 단계를 C와 D를 반복합니다.
그림 4. 항원 결합 (팹), C의 부정적인 스테인드 단백질 샘플 EM 이미지의 예.) 말 비장의 페리틴, B)는 조각) archaeal 20은 proteasome과 D) nucleosome. 모든 이미지는 동일한 배율로 기록된되었습니다. 스케일 바는 20nm이다.
Discussion
얼룩 제외 EM은 임의의 원추형 기울기에게 동일한 지역에서 시료에서 한 60 °로 기울여서 하나를 이미지 한 켤레를 수집 필요 팔 방법을 사용하여 같은 정제된 단백질 샘플의 3D 구조를 연구하는 데 사용할 수있는 강력한 도구입니다 하지만 macromolecular의 단지의 3D reconstructions을 계산하도록 untilted. 또한, 부정적인 얼룩 EM 10, 또는 단순히 균질성 및 / 또는 따라서 단백질 샘플을 정화의 이질을 시각에 대해 다른 conformations에서 단백질 단지를 시각화, 이러한 멤브레인 단백질 9 2 차원 (2D) 결정에 대한 심사와 같은 다른 많은 응용 프로그램을 가질 수 단백질 정화 절차를 개선하기 위해 피드백을 제공하는 등 그것은 생화 학자위한 강력한 분석하실 수 있습니다. 이 문서에서는, 우리는 탄소 코팅 격자 전자 현미경에 부정적인 스테인드 단백질 샘플의 이미지를 수집하기 위해 준비까지 프로토콜을 제시했습니다. 마찬가지로 여기 삽화가,절차는 비교적 간단하고 따라하기 쉽다. 임의 원뿔 틸트 방법으로 관찰되는 샘플의 3 차원 reconstructions를 계산하려고 시도한다면, 그것은 기울기 쌍 이미지를 확보하는 것이 필요합니다. 그러나, 단일 입자 분석을 수행하는 것이 목적이라면, 여러 untilted 이미지는 충분합니다. 두 경우 모두에서, 추가 영상 처리가 필요하며 이것이 비디오 문서의 범위를 넘어입니다.
어떤 방법과 마찬가지로, 프로토콜에 변화가 없습니다. Uranyl의 편대는 대부분의 경우에 부정적인 얼룩이 시약으로 잘 작동합니다. Uranyl 아세테이트는 다른 일반적으로 사용되는 부정적인 얼룩이 시약입니다. 그것은 uranyl의 편대 매우 유사한 작동하지만, 대부분의 경우 큰 입자 크기와, uranyl의 편대보다 낮은 콘트라스트와 함께. uranyl 아세트산을 사용의 장점은 솔루션 uranyl의 편대 이상 지속한다는 것입니다. 하나는 모두 하나 또는 두 개의 주간 신선한 솔루션을 준비할 필요가 없습니다. uranyl의 편대와 아세테이트는 모두 산성입니다. 분명 우려되는낮은 산도가 연구되고있는 단백질 샘플의 변화를 유발 수 있습니다. 두 얼룩 솔루션은 또한 단백질 fixatives 같은 기능을 수행합니다. 이전 연구는 모두 수정 단백질 샘플을 신속하게 7 나타났습니다. 이것은 급속한 고정은 낮은 산도 덜 중요합니다. 낮은 산도는 변경을 유발하기 전에 얼룩의 과정 동안 단백질 샘플이 고정됩니다. 그럼에도 불구하고, 이러한 암모늄 molybdate와 phosphotungstic 산성 등의 부정적인 얼룩 시약은, 낮은 산도가 우려 칠 때 샘플을 얼룩에 대한 나은 결과를 얻을 수 있습니다. 암모늄 molybdate와 phosphotungstic 산 모두 약 중성 산도가 있지만,이 얼룩에 의해 생성된 단백질 시료의 대비는 일반적으로 uranyl의 편대로 열등한 수 있습니다.
Disclosures
관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.
Acknowledgments
쳉 실험실에서 전자 현미경 작업은 부분적으로 NIH (1R01GM082893, 1R01GM098672, 1S10RR026814 - 01 및 P50GM082250 (A. 프랭클)을), 그리고 혁신적인 바이오 메디컬 연구, 기회 수상 및 신기술 상을 UCSF 프로그램에서 부여의 기금에 의해 지원됩니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Collodion | Electron Microscopy Sciences | 12620-30 | 30ml, 2% in Amyl Acetate |
| Gilder Cu grids | Ted Pella, Inc. | G400/G200 | 400/200 mesh |
| Cressington 208C High Vaccume Turbo Carbon Coater | Ted Pella, Inc. | 9260 | |
| Double pointed Carbon rod | Ted Pella, Inc. | 58 | |
| Uranyl formate | Electron Microscopy Sciences | 16984-59-1 | 99.9% purity |
| PELCO easiGlow GlowDischarge system | Ted Pella, Inc. | 91000 | Purchase at local pharmacy |
| Whatman #1 Filter paper | Fisher Scientific | 09-805E |
References
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