Visualisere Proteiner og makromolekylær komplekser ved Negative Stain EM: fra Grid Forberedelse til Image Acquisition

Summary

Visualisering protein prøver av negative stain elektronmikroskopi (EM) har blitt et populært strukturell analysemetode. Det er nyttig for kvantitativ strukturell analyse, for eksempel beregne en 3D-rekonstruksjon av molekyler som studeres, og også for kvalitativ undersøkelse av kvaliteten på protein preparater. I denne artikkelen presenterer vi detaljerte protokoller for å forberede EM nett, flekker prøven og visualisere prøven i et elektronmikroskop. Uerfarne brukere kan følge disse protokollene og enkelt å bruke negative beis EM som en rutinemessig analyse, i tillegg til andre biokjemiske analyser, for å vurdere deres protein prøver.

Abstract

Enkelt partikkel elektronmikroskopi (EM), av både negative beiset eller frosne hydrert biologiske prøver, har blitt et allsidig verktøy i strukturell biologi ^1. I de senere årene har denne metoden oppnådd stor suksess i å studere strukturer av proteiner og macromolecular komplekser ^{2, 3.} Sammenlignet med elektron cryomicroscopy (cryoEM), hvor frossen hydrert protein prøvene er innebygd i et tynt lag av glass-is ^4, er negativ beising en enklere prøveopparbeidelse metode der protein prøver er innebygd i et tynt lag av tørket heavy metal salt for å øke prøven kontrast ^5. Den forbedrede kontrasten negative flekken EM lar undersøkelse av relativt små biologiske prøver. I tillegg til å avgjøre tredimensjonale (3D) struktur av renset proteiner eller protein komplekser ^6, kan denne metoden brukes til mye bredere formål. For eksempel negative flekken EM lett kan brukes til å visualisere rensetprotein prøver, innhenting av informasjon som homogenitet / heterogenitet av utvalget, dannelse av protein komplekser eller store forsamlinger, eller bare for å evaluere kvaliteten av et protein forberedelse.

I denne videoen artikkelen presenterer vi en komplett protokoll for å bruke en EM å observere negativt stained protein prøve, fra forbereder karbon belagt grid for negative flekken EM å skaffe bilder av negativt beiset utvalget i et elektronmikroskop operert ved 120kV akselererende spenning. Disse protokollene har blitt brukt i vårt laboratorium rutinemessig og kan lett følges av uerfarne brukere.

Protocol

1. Utarbeidelse av EM nett for karbon belegg

1. Fyll et stort glass begerglass med destillert vann.
2. Bruk et glass pipette å droppe en eneste dråpe collodion (~ 20μl, 2% i amyl acetate, elektronmikroskopi Sciences, PA, USA) på overflaten av vannet. Collodion vil spre seg å danne en tynn plast lag på vann / luft overflaten; Merk: En første dråpe collodion kan brukes til å fjerne vannflaten fra eventuelle støvpartikler. Etter fjerning av filmen fra første dråpe, er vannoverflaten rent for støv.
3. Plasser EM rutenett, 400 eller 200 mesh Gilder Cu nett kjøpt fra Ted Pella Inc. (USA), en etter en på plast lag flyter på vannoverflaten, vi vanligvis sted 50 ~ 100 nett i et tett pakking mønster, med den blanke side av rutenettet vendt ned i plast lag (Fig. 1A). Merk: 400 mesh nett er bra for rutine negative flekken EM nett, mens 200 mesh nett er bra for innsamling tilt par bilder.
4. Skjær en paice papir med dimensjoner litt større enn det området hvor grid plasseres på plast laget. Legg papiret forsiktig på toppen av rutenettet (Fig. 1B), og vent til papiret blir helt våt (Fig. 1C). Merknad: Ulike typer papir har forskjellig vannabsorpsjon priser. Det er viktig at papiret ikke absorbere vann for fort. For eksempel er vanlig papirfilter ikke bra for dette formålet, fordi det absorberer vann for fort og gjør en masse rynker. Den carbon film laget av skrukkete papiret ikke er flatt, og dermed ikke bra for innsamling tilt par bilder for tilfeldig koniske tilt 3D-rekonstruksjon. Man må teste ulike papirer for å finne en passende en. I vårt laboratorium har vi brukt papirer fra notepads kjøpt fra lokale matbutikk. Noen ganger avisen papiret ble også funnet å være egnet. Et annet alternativ er å bruke relative tykt ris papir som brukes for kinesisk / japansk kalligrafi.
5. Raskt gjøre incisions på plastfolie rundt og nærgjennomvåt papir. Umiddelbart etterpå, bruk en pinsett til å plukke opp papiret med nett klemt mellom plastfolie og papir. Plasser papiret i en petriskål med grid vendt opp for luft tørking (fig 1D); Merk: Det er viktig å la papiret lufttørke. Tørkingen for fort genererer mange rynker i avisen.

2. Carbon belegg nett

1. Den carbon-coating maskin som brukes i vårt laboratorium er en Cressington 208C Høy Vacuum Turbo Carbon Coater (Ted Pella). Vårt system er utstyrt med en Cressington filmtykkelse monitor, som måler tykkelsen på dekket karbon film basert på prinsippet om at den oscillerende frekvensen for en kvartskrystall blir endret av massen til et deponert film på overflaten. Men beskrev protokollen her krever ikke en tykkelse monitor, siden det er ofte ikke tilgjengelig i alle laboratorier.
2. Skjerp en karbon stang med en knivsliper (Ted Pella) og last karbon stenger i karbon belegg machine (Fig. 2A). To stenger, en med en skarp spiss og den andre med en flat ende er plassert mot hverandre.
3. Bruk av vakuum fett på halvparten av frostet arealet av en glass-slide og plassere den ved siden av nett (Fig. 2B). Bare halvparten av frostet området av glass-slide skal være dekket med vakuum fett. Merk: Området med vakuum fett vil ikke endre farge etter karbon belegg. Kontrasten mellom tilstøtende områder med og uten vakuum fett gir en estimering av tykkelse på belagt karbon.
4. Plasser papiret med nett på scenen karbon belegg maskin. Plasser glass-slide ved siden av nett (Fig. 2C). Merk: Man kan også første overføringen grid belagt med plastfilm til et glass lysbildet før belegg, i tilfelle mange nett falle av fra papiret.
5. Pump vakuum kammeret, og vent til vakuum når et nivå på 10 ^-5 Torr. Merk: belegg med lavere vakuum genererer ofte mange gnister, fører til mange store karbon partikler pårutenettet.
6. Øke dagens svært sakte. Den kraftige spissen av karbon stang vil først bli rød og så hvit som strømmen øker. Ikke se den høye lysstyrke spissen direkte med det blotte øye. Stopp økende strøm når belegget begynner. Glasset skyv vil endre farge fra hvit til lys grå og deretter mørk grå. Mørket av lysbildene korrelerer tykkelsen på karbon filmen blir belagt. Slå strømmen av å stoppe belegg når ønsket tykkelse er oppnådd (fig. 2D). Merknad: 1) Etter gjentatte karbon belegg prosesser, belagt karbon fra innsiden av glasset glassklokke kunne mørkere farge. Dette gjør belagt carbon filmen vises tykkere enn den faktisk er. 2) Et skjerpet karbon stang kan brukes til flere belegg. Gjengivelsen av tuppen gradvis redusert etter hvert belegg. Maksimal strømstyrke er påvirket av skarpheten i karbon stang. En ferskt skjerpet stang med mindre diameter krever en relativ laverenåværende fordampe karbon. Senere belegg kan kreve litt høyere strøm.
7. Vent vakuum kammeret og fjern belagt nett for senere bruk.
   Merknad 1. Jo mer nøyaktig metode for å kontrollere karbon tykkelse er ved hjelp av en filmtykkelse monitor. Eller man kan kvalitativt kalibrere farger mot den nøyaktige tykkelsen målt ved skjermen. Et nyttig karbon tykkelse for denne teknikken er mellom 3 og 7 nm.

Dette er en enkel og lett metode for å forberede en stor mengde karbon belagt nett, som regel ~ 100 nett per forberedelse. Rutenettene inneholde en tynn plast lag, som vanligvis ikke påvirker kvaliteten på negativt fargede bildet. Men, rutenett utarbeidet i denne metoden er ikke egnet for cryoEM. Dette laget av plast kan fjernes ved soaking rutenettene inn kloroform i flere timer.

3. Forbereder uranyl formiat løsning (0,75%) for negative flekken EM. Den detaljerte protokollen blebeskrevet tidligere ⁵

1. Vei opp 37,5 mg av uranyl formiat i et lite begerglass;
2. Tilsett 5 dl kokende vann og rør i 5 minutter i mørket;
3. Legg 10μl 5M NaOH, fortsetter røre i 5 minutter;
4. Filter løsningen ved hjelp av en sprøyte filter (Fisherbrand, 13mm sprøyte filter, 0.2μm, Nylon ikke-sterile, katalognummer 09-720-5), og lagre den filtrerte løsningen i en 8ml Falcon tube dekket med aluminiumsfolie;
   Note. Uranyl formiat pulver kan kjøpes fra Elektronmikroskopi Sciences (Hatfield, PA), katalognummer 22451. Uranyl formiat løsning er lys sensitive og bør holdes vekk fra direkte lys, for eksempel ved å dekke Falcon tube med aluminiumsfolie. En nylaget løsning har en lys gul farge (Fig. 3A). Stain løsning kan holdes på benken for en til to uker før det begynner utløsende. Uranyl formiat er surt med en pH ~ 4. Legge NaOH øker pH, men legger det altfor forteller i overkant kan forårsake flekken å fremskynde. I tillegg til å skape kontrast, fikser uranyl formiatbaserte også protein prøven. Fordi fiksering prisen er så rask, den lave pH vanligvis ikke påvirker den generelle protein conformations eller protein kompleks dannelse ^7.

Fire. Protokoll for å forberede negative flekken EM rutenett. Denne protokollen ble beskrevet i detalj tidligere ⁵

1. Glow-utslipp karbon belagt grid, bruker PELCO easiGlow GlowDischarge system (Ted Pella Inc., USA). Den nåværende brukt er 15 mA og nett er gløden utladet i 30 sek. Note. Glow-utladet nett bør brukes kort tid etter glød utlading. Vi bruker ofte rutenettene i mindre enn 2 timer etter glød utslippet.
2. Plasser to 20μl dråper destillert vann og to 25μl dråper uranyl formiatbaserte løsning på et stykke Parafilm (Fig. 3B).
3. Hold en glød-utladet grid bruke reverse-force anti-kapillært tang med bilenbon-bestrøkne siden vender opp. Merk: Det er nødvendig å bruke anti-kapillære tang. Ellers vil flytende prøven sugd vekk fra nett ved kapillære kraft mellom tang.
4. Påfør 2μl protein prøven til gløden-utladet rutenett, og vent i 30 sek. Merk: ventetiden og lengden av gløden utslipp påvirker konsentrasjonen av proteiner adsorbert i nettet. Veldig fortynnede prøvene krever lengre adsorpsjon ganger. Kan imidlertid forlenget adsorpsjon endre buffer konsentrasjonen siden vann damper. For å oppnå en skikkelig partikkel fordeling i nettet krever litt prøving og feiling tilnærming.
5. Blot av prøven ved hjelp av filter papir.
6. Trykk på nettet overflaten til en vann dråpe, og deretter klatt av vannet med filter papir. Gjenta med den andre dråpe vann.
7. Trykk på nettet overflaten til den første dråpe flekken kort. Blot av flekken løsning med filter papir.
8. Trykk på nettet overflaten til andre dråpe flekken i 20 sekunder. Blot off flekken løsning med filter papir.
9. Tørr nettet ved hjelp av en vakuum. Merk: Man kan også la rister på benken eller i en kjemisk hette det lufttørke. Fordelen med vakuum tørr er at man kan observere tavler i EM umiddelbart. De mulige gjenstand generert av hurtigtørkende er ujevn flekk.

5. Transmisjon elektronmikroskop

1. Mikroskopet som brukes i denne demonstrasjonen er en Tecnai T12 (FEI Company) utstyrt med en Gatan 4K x 4K CCD-kamera.
2. Kort sjekk justeringen av mikroskopet før du setter prøve; Merk: Dette er kun nødvendig én gang per EM økt. I en modell mikroskop, kan nær perfekt innretting bli lagret tidligere. Legge en slik innretting filen bør gjenopprette mikroskop justering til en nær perfekt stand.
3. Legg EM rutenettet i enkle tilt standard eksemplar holderen.
4. Sett holderen i CompuStage av T12. Vent til pumping syklusen å fullføre.
5. Sett holderen inn i kolonnen. </ Li>
6. Fokus prøve og stille inn ønsket defokus, vanligvis-1.5um. Merk: Fokusering kan oppnås enten ved manuell fokusering bruke minimum kontrast metoden eller bruker CCD-kamera for å fange levende bilder og beregne leve Fourier makt spektrum.
7. Ta et bilde ved hjelp av CCD-kamera;
8. I bildene av negativt fargede proteiner prøver, er proteiner ofte sett med hvit kontrast, dvs. hvit tetthet mot en mørkere bakgrunn. Merk at mens protein konsentrasjoner i ulike områder av samme grid er vanligvis ganske like, ikke observere en ulike nivåer av flekken i ulike områder av det samme nettet. Noen ganger områder kan ha ujevne flekker eller enda positive flekker (protein ser mørkt på en lys bakgrunn), mens enkelte andre områder har perfekt stain. Det er ofte nødvendig å søke på nettet for å finne et godt område for imaging.

Seks. Representant Resultater

Eksempler på typiske gode bilder av negativt stastudere aggressiv prøver, hest milt ferritin (figur 4A), Fab (Fig. 4B), archaeal 20S proteasome (Fig. 4C) og nucleosome (fig. 4D), vises.

Figur 1. Utarbeidelse av karbon belagt nett for negative flekken EM. A) plasserer EM grid én etter én i et lukket pakking mønster på overflaten av collodion film. B) Plassering et stykke papir litt større enn det området av nett. C) Vent til papiret blir helt våt. D) Plukk opp papiret sammen med nett for luft-tørking.

Figur 2. . Coating EM rutenett med karbon A) Setup karbon fordamperen: Plasser de to karbon stenger i belegget apparat, med en stang (til venstre) skjerpet til et punkt spissen. Den andre stang (til høyre) har en flat overflate og komme i kontakt med peker tuppen av den ene i motsatt eide. B) Plasser en liten mengde av vakuum fett på den ene siden av en fostret glass slide. Området innenfor den svarte rammen har vakuum fett. C) Setup rutenettene for belegg. Glasset slides brukes for å holde papiret på plass. Den pilspissen peker området med vakuum fett. D) Etter belegg, ikke fargen på lysbildet med vakuum fett dekket ikke endre fargen. Kontrasten indikerer tykkelsen av belagt karbon.

Figur 3. Illustrere negative flekker prosedyre. A) nylaget (til venstre) uranyl formiat løsningen er gjennomsiktig uten tegn på utfellinger. Etter 1 ~ 2 uker, utfellinger start akkumuleres i bunnen i bunnen av røret. B) Plasser to dråper (~ 25μl) av destillert vann og to dråper uranyl formiatbaserte løsning i et stykke Parafilm. Bruk et par anti-kapillære tang til å holde en glød utladet karbon-belagt EM rutenett med karbon sideopp. En dråpe av prøven (~ 2μl) er plassert i rutenettet. C) Etter å ha ventet i 30 sekund, blot løsningen med et filter papir. D) Flip nettet for å ta prøven på rutenettet med den første dråpe vann. Gjenta trinn C og D for å fullføre prosessen med farging.

Figur 4. Eksempler på EM bilder av negativt fargede protein vareprøver. A) Horse milt ferritin, B) fragment av antigen binding (Fab), C) archaeal 20S proteasome og D) nucleosome. Alle bilder ble registrert med samme forstørrelse. Skalaen Baren er 20Nm.

Discussion

Negative beis EM er et kraftig verktøy som kan brukes til å studere 3D strukturer av renset protein prøver, for eksempel bruk tilfeldig koniske tilt ⁸ metoden, som krever å samle et par bilder med en fra prøven tiltes til 60 ° og en fra samme område men untilted å beregne 3D rekonstruksjoner av macromolecular komplekser. I tillegg negative flekker EM kan ha mange andre programmer, for eksempel screening for to-dimensjonale (2D) krystaller av membran proteiner ^9, visualisering protein komplekser i ulike conformations ^10, eller bare for å visualisere homogenitet og / eller heterogenitet av renset proteiner sample dermed gi tilbakemeldinger for å forbedre protein rensing prosedyrer, etc. Det kan være en kraftig test for biokjemikere. I denne artikkelen presenterte vi protokollene fra oppstilling av karbon-belagt nett for å samle bilder av negativt beiset protein prøver i et elektronmikroskop. Som illustrert her,prosedyren er ganske enkel og lett å følge. Hvis du forsøker å beregne 3D rekonstruksjoner av prøven blir observert av tilfeldig konisk tilt metoden, er det nødvendig å skaffe seg vippe par bilder. Men hvis du utfører enkelt partikkel analyse er formålet, vil flere untilted bilder nok. I begge tilfeller er videre bildebehandling nødvendig, og dette er utenfor omfanget av denne videoen artikkelen.

Som med enhver metode, det er variasjoner i protokollene. Uranyl formiat fungerer veldig bra som en negativ flekk reagens i de fleste tilfeller. Uranyl acetate er en annen vanlig negative flekken reagens. Det fungerer veldig likt som uranyl format, men med en større kornstørrelse og i mange tilfeller lavere kontrast enn uranyl formiat. Fordelen med å bruke uranyl acetat er at løsningen varer lenger enn uranyl formiat. Man trenger ikke å forberede en ny løsning hver og en eller to uker. Både uranyl formiat og acetat er sure. En åpenbar bekymring er atlav pH kan indusere endringer i protein prøven som studeres. Begge flekken løsninger også fungere som protein fiksativ. En tidligere studie har vist at både fikse protein prøver raskt ^7. Denne raske fiksering gjør den lave pH mindre viktig. Under prosessen med flekker, et protein Prøven blir fastsatt før den lave pH kan indusere endringer. Likevel kan andre negative flekker reagenser, som ammonium molybdate og phosphotungstic syre, gir bedre resultater for beising prøver når lav pH er en bekymring ^7. Både ammonium molybdate og phosphotungstic syre har en tilnærmet nøytral pH, men kontrasten av protein prøver som genereres av disse flekkene er vanligvis dårligere uranyl formiat.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Collodion	Electron Microscopy Sciences	12620-30	30ml, 2% in Amyl Acetate
Gilder Cu grids	Ted Pella, Inc.	G400/G200	400/200 mesh
Cressington 208C High Vaccume Turbo Carbon Coater	Ted Pella, Inc.	9260
Double pointed Carbon rod	Ted Pella, Inc.	58
Uranyl formate	Electron Microscopy Sciences	16984-59-1	99.9% purity
PELCO easiGlow GlowDischarge system	Ted Pella, Inc.	91000	Purchase at local pharmacy
Whatman #1 Filter paper	Fisher Scientific	09-805E